一种长链非编码RNA及其组合物在诊断治疗胆管癌中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长链非编码rna，linc00152及其组合物，在制备诊断胆管癌及靶点药物治疗中的应用。同时，本发明还涉及其引物，在制备诊断直结肠癌试剂中的应用。通过研究该长链非编码rna细胞水平的表达，揭示了其与胆管癌发病机理的关系。

背景技术：

肿瘤是严重威胁人类健康的一大主要元凶，对肿瘤恶性进展的分子机制研究一直是学界关注的焦点与难点。已有研究报道，肿瘤细胞在生长过程中具有促进增殖和侵袭转移，持续血管生成，免疫耐受及免疫逃逸等细胞表型特征。研究表明，肿瘤细胞的生长是一个复杂的多基因调控和多步骤、多阶段发展的过程，包括p53、p21等抑癌基因的失活和blc1、myc等原癌基因的激活。迄今为止，恶性肿瘤的发生机制仍未完全清楚，需要进一步探索。

研究显示：除这些已被广泛研究的编码基因外，长非编码rna(longnoncodingrnas，lncrnas)的异常表达也参与肿瘤恶性进展。lncrnas是一类转录本长度超过200nt的rna分子，有别于其他小分子非编码rna，其可以顺式(incis)或反式(intrans)作用的方式调节rna代谢、蛋白质功能活性、组蛋白修饰及染色质重塑，在表观遗传学、转录以及转录后水平广泛参与细胞生物学过程。越来越多的研究证实，lncrnas不仅在维持机体的正常生理功能及发育过程中发挥重要的调控作用，其异常表达与疾病的发生发展尤其是肿瘤的恶性进展有着密切的联系。

胆管癌(cholangiocarcinoma，cca)是起源于胆管上皮细胞的高度侵袭性的恶性肿瘤，其全球发生率，尤其是在亚洲国家中呈逐年上升趋势，5年生存率不足5％。胆管癌早期发病隐匿，常无明显的临床表现，明确诊断时已至中晚期。尽管目前已有手术、放疗、化疗等临床治疗手段，但是胆管癌患者的预后仍很差。已有研究表明，lncrnas的异常表达介导胆管癌恶性进展。上调的h19和hulc可通过cerna机制促进胆管癌细胞的迁移和侵袭。lncrnacps1intronictranscript1(cps1‐it1)可促进胆管癌细胞的增殖及抑制凋亡，且影响病人的肝功能及预后。进一步文献检索结果显示：lncrnas可以通过发挥原癌基因的作用，参与胆管癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移等生物学过程，提示更多胆管癌恶性进展相关lncrnas的功能和机制具有进一步研究的必要性。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种长链非编码rna及其组合物在诊断胆管癌以及在制备治疗胆管癌药物中的应用。

技术方案：本发明提供一种长链非编码rna，linc00152，其特征在于，长度为852bp，其序列如seqidno:1所示，即：

tcgttccaatgagaatgaaggctgaggtgtgcgcctttttttttttttccttcttagtcg

tgtgtacatcattgggaatggagggaaataaatgactggatggtcgctgctttttaagtt

tcaaattgacattccagacaagcggtgcctgagcccgtgcctgtcttcagatcttcacag

cacagttcctgggaaggtggagccaccagcctctccttgtcctggaggctggaagtgcaa

aaggaaggtgtcggcaagatcgtttttttctgagagctctctccttggcttgcagatggc

agcctgctcctggcacagtcttttctctactcatgcccaaagttacggaggacccagcaa

ccatctcctgcagcccctggaaacctcttgactcttctgtgatgtccccagtgatccagc

agccctggccttcttttgatggcttgaacatttggtcttcattgaacagtttgtatattg

gaaacttgccagcctccatccacattccaacctccgtctgcatccctcgaataactggga

gatgaaacaggaagctctatgacacacttgatcgaatatgacagacaccgaaaatcacga

ctcagccccctccagcacctctacctgttgcccgccgatcacagccggaatgcagctgaa

agattccctggggcctggttccaaccgcccactgtggactctgaggcctctgcatttgcg

ggtggtctgcctgtgatattt。

本发明还提供了检测上述长链非编码rna的试剂在制备诊断胆管癌试剂中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括检测长链非编码rna，linc00152的检测试剂。

进一步地，本发明还提供了上述药物组合物在制备诊断胆管癌试剂中的应用。

本发明还提供了一种用于检测长链非编码rna，linc00152的引物组：序号分别如seqidno：2和3所示，即：

seqidno：2linc00152faaaatcacgactcagccccc，

seqidno：3linc00152raatgggaaaccgaccagacc。

进一步地，本发明提供上述引物组在制备诊断胆管癌试剂中的应用。

本发明保护一种试剂盒，所述试剂盒包括上述检测长链非编码rna，linc00152的引物组。优选地，试剂盒中引物组的浓度为0.01~0.1mol/l。

本发明保护一种用于治疗胆管癌的药物组合物，该药物组合物包括长链非编码rna，linc00152的抑制剂。

进一步地，所述linc00152的抑制剂为linc00152的sirna，其序列如seqidno:4，5或seqidno:6，7所示，即：

si-linc001521#:

acagccggaaugcagcugaaagauuseqidno:4

aaucuuucagcugcauuccggcuguseqidno:5

si-linc001522#:

ggucaugggcuggucuggucgguuuseqidno:6

aaaccgaccagaccagcccaugaccseqidno:7。

技术路线

一、实验对象

我们收集了17对2015年至2016年在南京医科大学第二附属医院生物治疗中心接受诊断和治疗的胆管癌患者以及不含有该疾病的健康志愿者的组织。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃，直至rna提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。

二、实验设备和试剂

本发明所使用的实验方法和研究技术：如总rna和蛋白质的提取、克隆技术、细胞转染、chip试验、rip试验、westernblot、荧光实时定量pcr、生物信息学数据库的使用等；所需要的实验材料如抗体、试剂盒等均可商购。

本发明团队依托南京医科大学，所需各设备，如荧光定量pcr仪、流式细胞仪、酶标仪、co2孵箱、低温高速离心机、荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜等，以及实验动物，均可直接使用。

三、实验步骤及结果

1.实验路线示意图，依据本发明的发明构思，其实验路线示意图见附图9。

2.linc00152在胆管癌中显著性高表达：检测胆管癌组织标本中linc00152表达水平并分析其相关性进行生物信息学分析，查找基因表达综合数据库(即geo数据库)中的胆管癌-癌旁的芯片数据，将归一化数据下载并进行差异表达数据分析；最终获得在癌-癌旁差异表达的lncrnas。确定linc00152是在数据中显著性上调(p值<0.001，fdr<0.05)的一条lncrna。实验结果显示在图1中，linc00152在在癌-癌旁的差异表达情况：(a)gse76297数据库的胆管癌表达谱数据显示：相对于癌旁或正常组织，linc00152在癌中高表达，纵坐标为标准化分数z值；(b和c)geo数据库和tcga数据库数据显示linc00152在癌中高表达；（d）收集胆管癌组织样本，采用荧光实时定量pcr(qrt-pcr)技术在17对胆管癌组织及其癌旁组织中进行了验证，结果显示linc00152在癌中显著高表达。

3.linc00152促进胆管癌细胞恶性进展的研究：

1)合成linc00152干扰序列(sirna)和过表达质粒，转染胆管癌细胞系；干扰序列如seqidno:4，5及seqidno:6，7所示，即：

si-linc001521#:

acagccggaaugcagcugaaagauuseqidno:4，

aaucuuucagcugcauuccggcuguseqidno:5，

si-linc001522#:

ggucaugggcuggucuggucgguuuseqidno:6，

aaaccgaccagaccagcccaugaccseqidno:7。

2)qrt-pcr检测抑制和过表达效率，cck8、克隆形成、transwell、edu、流式细胞技术检测封闭及过表达linc00152后对胆管癌增殖、凋亡及侵袭转移细胞功能的影响；进一步评价linc00152在胆管癌细胞中的生物学功能，明确其癌基因功能。

实验结果显示在图2、图3和图4中：

图2(a)linc00152在胆管癌上皮细胞(hucct1细胞)和人胆管癌细胞(rbe细胞)中的干扰效率都可达90％。(b)linc00152在胆管癌上皮细胞(hucct1细胞)和人胆管癌细胞(rbe细胞)中的过表达效率。

图3（a和b）cck8实验结果显示：干扰linc00152后抑制hucct1细胞及rbe细胞的增殖；过表达linc00152后促进hucct1细胞及rbe细胞的增殖；（c和d）克隆形成实验结果显示：干扰linc00152抑制hucct1细胞及rbe细胞的增殖；过表达linc00152后促进hucct1细胞及rbe细胞的增殖；(e)edu实验结果显示：干扰linc00152抑制hucct1细胞及rbe细胞的增殖；（f和g）transwell实验结果显示：干扰linc00152抑制hucct1细胞及rbe细胞的侵袭转移；过表达linc00152后促进hucct1细胞及rbe细胞的侵袭转移

图4（a）流式细胞仪检测结果显示：干扰linc00152后，hucct1及rbe细胞的凋亡明显增多；(b)流式细胞仪检测结果显示：干扰linc00152后，rbe细胞细胞周期主要被阻滞在g1期。

4.linc00152提高胆管癌细胞在体内的肿瘤形成能力

1)构建linc00152干扰和过表达的慢病毒载体，包装成病毒，转染hucct1细胞，筛选阳性稳转细胞株。

2)两种细胞分组注射入免疫缺陷小鼠(balb/c裸鼠)，以构建皮下成瘤模型。待瘤体形成后，每2天测一次瘤体体积，4周后处死小鼠，取瘤体，测量重量；定量pcr检测linc00152的表达水平。进一步评价linc00152对胆管癌细胞增殖能力的影响。

实验结果显示在图5中：(a-b)裸鼠皮下成瘤实验，观察并记录小鼠瘤体大小，待瘤体形成16天后处死小鼠，取出瘤体，拍照记录；同时量取瘤体的大小并称其重量；(c)瘤体生长速度检测，敲低sh-linc00152组小鼠瘤体的平均生长速度显著慢于对照组瘤体的平均生长速度（d）瘤体重量检测，敲低sh-linc001522#组小鼠瘤体的平均重量显著低于对照组瘤体的重量。

5.高通量测序linc00152调节下游靶基因表达

利用转录组测序初步确定linc00152所调控的靶基因：在hucct1细胞系中利用sirna敲低linc00152，利用转录组测序技术高通量筛选linc00152所调控的重要靶基因，并运用qrt-pcr对测序结果进行验证。

实验结果显示在图6中：(a)干扰linc00152后，转录组高通量测序所得linc00152下游影响的差异表达基因，颜色表示z分数；(b)go分析显示linc00152与细胞增值，迁移和凋亡等相关；(c-d)qpcr及westernblot实验验证在胆管癌细胞株hucct1及rbe中干扰linc00152后下游靶基因显著上调。

6.linc00152绑定ezh2表观抑制下游靶基因

1)在胆管癌细胞中通过rip技术以鉴定linc00152与ezh2蛋白结合。

2)linc00152表观调控胆管癌细胞恶性表型的机制：

a.胆管癌细胞中分别封闭linc00152，qrt-pcr、westernblot方法分别检测lrig1的mrna、蛋白的表达水平。

b.胆管癌细胞中封闭ezh2后，采用qrt-pcr、westernblot方法分别检测lrig1的mrna、蛋白的表达水平。

c.为鉴定在胆管癌细胞中linc00152是否与ezh2特异结合，进行了rna免疫共沉淀(rnaimmunoprecipitation，rip)实验对linc00152与ezh2在胆管癌细胞中的绑定进行了进一步验证(实验结果见图7a)，结果提示在胆管癌细胞中linc00152可与ezh2特异结合。

ezh2是构成prc2复合物中唯一具有酶活性的亚基，prc2是一个作用于组蛋白h3赖氨酸位点k27的高度保守的组蛋白甲基转移酶，其生物功能是对分化基因的转录沉默。目前已知通过全基因组研究，在多种生物体中prc2的常作用靶点是转录因子和信号通路的关键位点。研究表明，长链非编码绑定介导组蛋白甲基化从而抑制下游靶基因的表达。且研究表明，在肝癌、肾细胞癌、肺腺癌和胃癌中，linc00152可与ezh2结合抑制下游靶基因的表达。已有文献报道，膀胱癌、肺癌、肾癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、胶质瘤和结直肠癌组织中lrig1的表达量显著低于癌旁组织，可以发挥抑癌作用。且有文献报道，在结直肠癌和宫颈癌中，其肿瘤组织中lrig1的表达与其启动子区域的甲基化相关。提示我们:linc00152可绑定ezh2介导组蛋白甲基化从而引起lrig1基因的抑制表达。

d.linc00152可能通过绑定ezh2表观抑制lrig1基因等抑癌基因的表达，从而促进胆管癌细胞恶性表型进展。

chip实验证实敲减linc00152后，ezh2与lrig1基因启动子区的绑定风度降低

上述实验的结果显示在图7中，(a)rip实验证实：linc00152能够和ezh2蛋白绑定；(b)westernblot实验验证在胆管癌细胞株hucct1及rbe中成功干扰ezh2基因。(c)qpcr验证在hucct1及rbe细胞中干扰ezh2后，lrig1mrna水平和蛋白水平的表达显著上调。（d）chip实验证实敲减linc00152后，敲减linc00152后，ezh2与lrig1启动子区的绑定丰度降低且lrig1基因启动子区h3k27me3的丰度降低。

图8，(a)tcga数据库的胆管癌表达谱数据显示：相对于癌旁或正常组织，lrig1在癌中低表达，左图纵坐标为标准化分数z值；(b)geo数据库数据显示lrig1在癌中低表达；(c)在17对胆管癌和癌旁组织qpcr验证：lrig1在胆管癌组织中显著下调。(d)cck8：lrig1抑制胆管癌细胞的增值，并可以挽救linc00152对增值能力的促进；(e)克隆形成实验：在胆管癌细胞中过表达lrig1，结果示lrig1抑制胆管癌细胞的增值，并可以挽救linc00152对增值能力的促进；(f)transwell：lrig1抑制胆管癌细胞的迁移，并可以挽救linc00152对迁移能力的促进。

有益效果：本发明从临床组织标本、细胞、模式动物三个层面研究linc00152调控胆管癌细胞恶性进程的作用机制，运用qpcr、rip分子生物学技术手段对linc00152与靶基因之间的关系作进一步验证。本发明具有显著的科学意义：linc00152在胆管癌中异常高表达并参与表观遗传介导的增殖侵袭机制；生物信息学分析、转录组高通量测序、rip等方法的运用保证了结果的准确性和系统性；本研究的成功实施将丰富lncrnas调控胆管癌发生发展的分子机制，揭示了linc00152可作为胆管癌诊断、预后的标志物，为临床早期胆管癌临床诊治提供实验和理论依据。

附图说明

图1linc00152在癌变组织-癌旁组织的差异表达情况；

图2ling00152在hucct1细胞和rbe细胞中的干扰及过表达效率；

图3linc00152对hucct1细胞和rbe细胞增殖以及迁移的影响；

图4linc00152对hucct1细胞和rbe细胞凋亡以及细胞周期的影响；

图5linc00152对肿瘤细胞形成大小的影响；

图6高通量测序linc00152调节下游靶基因表达；

图7linc00152绑定ezh2表观抑制lrig1基因的表达；

图8lrig1作为linc00152的下游靶标可以在胆管癌中发挥抑癌作用，并可以拮抗linc00152的促癌作用；

图9本发明实验路线示意图。

具体实施方式

实施例：下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.生物信息学方法筛选并确定胆管癌中高表达linc00152

（1）入选标准进入geo数据库和tcga数据库，查询“cholangiocarcinoma”和“cancerofbiliaryduct”，限制过滤条件“entrytype:series”、“organism:homosapiens”、“studytype：expressionprofilingbyarray”和“attributename：tissue”，获关于胆管癌的芯片研究查询结果，挑选符合下列要求的研究项目:胆管癌、同时含病例-对照(或癌-癌旁)、主流芯片平台(affy、agilent和illumina)、单通道芯片。

（2）芯片数据分析

下载已有归一化数据或使用rmaexpress对原始数据进行归一化；计算差异表达倍数(fc)；对归一化数据进行z分值变换；之后依据样本情况进行配对t检验或成组t检验，并计算fdr(错误发现率)值，将p值<0.001，fdr<0.05定义为显著性差异。

（3）lncrnas探针注释

利用探针序列blast和biomart查询的方式对芯片平台的探针集进行lncrnas注释，最终获得显著性差异lncrnas。结果发现linc00152是在数据中显著性上调的一条lncrnas。

2.检测胆管癌组织标本中linc00152表达水平并分析其相关性

进一步收集胆管癌及癌旁组织标本，及其临床资料的整理。trizol法提取组织的总rna，取1μg的rna逆转录为cdna模板(takara)。采用qpcr在17对胆管癌组织及其癌旁组织中进行了验证，结果显示linc00152平均上调约5倍。定量pcr应用abi公司的7500型定量pcr仪(appliedbiosystem，fostercity，ca)，结果采用2-δδct值进行分析。

所用引物序列如下:

linc00152f：5’-aaaatcacgactcagccccc-3’

linc00152r：5’-aatgggaaaccgaccagacc-3’

gapdhf：5’-gggagccaaaagggtcat-3’

gapdhr：5’-gagtccttccacgataccaa-3’

3.linc00152在胆管癌细胞的功能研究

(1)设计合成特异性的针对linc00152的sirna分子及过表达质粒(invitrogene公司)转染胆管癌细胞，以未转染干扰序列为对照；设计合成特异性linc00152过表达质粒载体转染胆管癌细胞，以空载体转染组为对照；48小时后收集细胞的总rna，qrt-pcr分别检测转染效率。

(2)胆管癌细胞系分别封闭或过表达linc00152后，cck8、克隆形成、transwell实验、edu、流式细胞技术检测封闭linc00152后对胆管癌细胞增殖、细胞侵袭转移及细胞周期、凋亡等功能的影响。以明确linc00152在胆管癌细胞中的生物学功能。

4.linc00152在模式动物中的功能验证

linc00152的干扰及过表达慢病毒载体构建：合成linc00152的序列及特异性干扰序列，以gapdh(磷酸甘油醛脱氢酶)基因的序列作为对照。上述片段均由英潍捷基tm公司合成，并将其插入慢病毒载体中；包装入慢病毒载体感染rbe和hucct1细胞，g418筛选阳性细胞；收集阳性稳转细胞的总rna，qrt-pcr检测linc00152的表达。用其及相应的对照组细胞分别皮下注射balb/c裸鼠，构建皮下成瘤模型；待瘤体形成后，每2天测一次瘤体体积，4周后处死小鼠，取瘤体，测量重量。

5.linc00152调控胆管癌细胞增殖的分子机制研究

(1)利用转录组测序初步确定linc00152所调控的靶基因

a.总rna的提取(trizol法)

在hucct1细胞中敲低linc0015248h后，分别在对照组和干扰组细胞中加入500ultrizol，放置10min；加入100μl氯仿，剧烈震动15s，室温静置5min；离心，4℃、12000g、10min，将上清转移到一新的1.5ml离心管中。加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min，离心，4℃、12，000g、20min，弃除上清。加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，离心，4℃、12000g、5min，弃除上清，室温干燥10min。加入30-50μlrnase-free水，溶解rna，-80℃保存。

b.rna的质检，打开agilent2200机器，打开软件；装入相应的r6kagilentscreentape，排枪装入16个loading枪头；取出一个8联管，按顺序分别加入4μlr6ksamplebuffer与1μlrna样品；混匀后离心收集混合液，72℃3min，冰上2min；离心以收集管壁溶液，然后放入agilent2200样品板上；点击start开始质检。

c.文库构建

转录组rna片段化：poly(a)rna的获取；rna片段化；片段rna纯化构建文库：rna加接头；反转录；cdna纯化；cdna扩增；扩增产物纯化。文库质检：打开agilent2200机器，打开软件；装入相应的d6kagilentscreentape，排枪装入16个loading枪头；取出一个8连管，在第一管中加入3μld1kladder，在剩余的管中分别加入3μld1ksamplebuffer和1μlcdna样品，涡旋混匀5s；离心收集管壁溶液，然后放入agilent2200样品板上；点击start开始质检。

d.测序模板准备文库的稀释；乳滴pcr；珠子的清洗；阳性珠子的富集。

e.上机测序

清洗测序仪；测序仪初始化；上样。

(2)rip实验验证linc00152与ezh2绑定

a.rip：对rbe细胞及hucct1细胞用ezh2抗体免疫沉淀rnp复合物。

b.将沉淀的总rna的抽提。无rna酶的dnaase1处理提取的总rna。对提取的rna进行逆转录并qrt-pcr检测。

c.rna-pulldown联合sds-page-银染-质谱技术：构建linc00152过表达质粒，运用特异限制性内切酶切开质粒，利用体外转录试剂盒转录得到linc00152rna，再以生物素末端标记试剂盒对linc00152末端标记，与细胞内蛋白运用磁珠孵育结合，高效富集rna结合蛋白，特异地获得与linc00152结合的蛋白，再联合sds-page-银染-质谱技术，鉴定与linc00152结合的蛋白。

(3)linc00152在胆管癌细胞中绑定ezh2调控靶基因的表达

a.设计特异性的linc00152干扰或过表达载体，用脂质体2000(英潍捷基tm)转染试剂将linc00152干扰或过表达载体瞬时转染胆管癌细胞，转染48小时后，收集细胞总rna和蛋白用于qrt-pcr及westernblot分别检测靶基因mrna和蛋白表达(以gapdh作为对照)。

b.设计特异性的ezh2的干扰序列，干扰序列如seqidno:12所示，即si-ezh2：gagguucagacgagcugauuu；aucagcucgucugaaccucuu。用脂质体2000(英潍捷基tm)转染试剂将瞬时转染胆管癌细胞，转染48小时后，收集细胞总rna和蛋白用于qrt-pcr及westernblot分别检测ezh2及靶基因lrig1的mrna和蛋白表达(以gapdh作为对照)。

c.分别封闭和过表达linc00152后，chip检测ezh2与靶基因lrig1启动子区的结合能力。

所用引物序列如下：

linc00152

aaaatcacgactcagccccc

aatgggaaaccgaccagacc

ezh2

tgcacatcctgacttctgtg

aagggcattcaccaactcc

lrig1

gcctggaagaaagacaatgaa

gagccaaagtggttggtgat

actg2

ttgtgcgagacatcaaggag

tccatgccaataaaggaagg

tnfaip3

agtgtcagcatcccaacca

ccggttagccatacatctgc

nfkbie

ctcatccactctgtgcaagg

gcttcagtcggtacacagca

nfkb2

ccttgctgctaaatgctgct

tgaggttgtctgtcggtacg

cmtm3

tgctggccttgtacttcctc

gcaaacacgatggtagcaaa

adam19

aagtaccatgacaacgcccaat

cattctcggagtggtccatgt

gapdh

gggagccaaaagggtcat

gagtccttccacgataccaa

6.胆管癌组织标本中linc00152与靶基因之间的相关性研究,分析靶基因的功能表型。

进一步收集胆管癌组织标本并整理详细病理资料和建立随访记录库。qrt-pcr技术检测胆管癌组织标本及配对正常标本中linc00152的表达水平，并分析其与胆管癌病人的病理资料(肿瘤tnm分期、病理特征、预后等)的相关性。qrt-pcr分析胆管癌组织标本及配对正常标本中相应靶基因lrig1的表达水平；分析胆管癌临床组织标本中linc00152与靶基因之间相关性。并通过功能实验对lrig1在胆管癌中发挥的作用进行了研究。以进一步评价linc00152以及lrig1可作为胆管癌诊断、预后的标志物，其表达异常可能是促进胆管癌发生发展的关键靶点。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

序列表

<110>南京医科大学第二附属医院

<120>一种长链非编码rna及其组合物在诊断治疗胆管癌中的应用

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>741

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcgttccaatgagaatgaaggctgaggtgtgcgcctttttttttttttccttcttagtcg60

tgtgtacatcattgggaatggagggaaataaatgactggatggtcgctgctttttaagtt120

tcaaattgacattccagacaagcggtgcctgagcccgtgcctgtcttcagatcttcacag180

cacagttcctgggaaggtggagccaccagcctctccttgtcctggaggctggaagtgcaa240

aaggaaggtgtcggcaagatcgtttttttctgagagctctctccttggcttgcagatggc300

agcctgctcctggcacagtcttttctctactcatgcccaaagttacggaggacccagcaa360

ccatctcctgcagcccctggaaacctcttgactcttctgtgatgtccccagtgatccagc420

agccctggccttcttttgatggcttgaacatttggtcttcattgaacagtttgtatattg480

gaaacttgccagcctccatccacattccaacctccgtctgcatccctcgaataactggga540

gatgaaacaggaagctctatgacacacttgatcgaatatgacagacaccgaaaatcacga600

ctcagccccctccagcacctctacctgttgcccgccgatcacagccggaatgcagctgaa660

agattccctggggcctggttccaaccgcccactgtggactctgaggcctctgcatttgcg720

ggtggtctgcctgtgatattt741

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaaatcacgactcagccccc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatgggaaaccgaccagacc20

<210>4

<211>25

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acagccggaaugcagcugaaagauu25

<210>5

<211>25

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaucuuucagcugcauuccggcugu25

<210>6

<211>25

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggucaugggcuggucuggucgguuu25

<210>7

<211>25

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aaaccgaccagaccagcccaugacc25

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aaaatcacgactcagccccc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aatgggaaaccgaccagacc20

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gggagccaaaagggtcat18

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gagtccttccacgataccaa20

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<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gagguucagacgagcugauuuaucagcucgucugaaccucuu42

<210>13

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aaaatcacgactcagcccccaatgggaaaccgaccagacc40

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgcacatcctgacttctgtgaagggcattcaccaactcc39

<210>15

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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agtgtcagcatcccaaccaccggttagccatacatctgc39

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ctcatccactctgtgcaagggcttcagtcggtacacagca40

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>40

<212>dna

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tgctggccttgtacttcctcgcaaacacgatggtagcaaa40

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<212>dna

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<210>22

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

gggagccaaaagggtcatgagtccttccacgataccaa38