一株产甲壳素酶菌株及应用的制作方法

本发明涉及一株产甲壳素酶菌株及其在发酵麻虾产甲壳低聚糖中的应用，属于工业微生物领域技术。

背景技术：

甲壳素又名几丁质，其是由β-1，4糖苷键连接的n-乙酰-d-氨基葡萄糖高分子多聚体，广泛存在于自然界中，储量仅次于纤维素。甲壳素的水不溶性大大限制了应用范围，但可在甲壳素酶的作用下分解成具有水溶性甲壳低聚糖或壳寡糖（cos）。其分解产物具有抑菌、抗氧化、促进动植物生长发育等多种作用。大量研究发现壳聚糖、壳寡糖具有显著的抗神经炎症以及抗氧化作用，未来可能能广泛应用于阿尔茨海默病的治疗。同时，壳寡糖还具有显著的抗肿瘤活性，在食品、农业和医药具有广泛的应用前景。

产甲壳素酶的生物主要来自微生物，其主要包括芽孢杆菌、链霉菌、粘质沙雷氏菌以及假单胞菌等等。研究者通过随机诱变、定点诱变以及改变筛选来源等各种手段获得高产或具有特殊性质的甲壳素酶，如耐冷、耐热以及耐酸碱甲壳素酶等。麻虾酱主要是由产自海洋的麻虾加盐自然发酵一月左右制得，富含蛋白质、甲壳素，是我国及东南亚地区的常用调味料。麻虾酱微生物多样性和构成非常复杂，适合用作产甲壳素酶菌株的筛选，同时麻虾中富含甲壳素又价格低廉，适合作为甲壳素分解产物的底物，具有极强的工业化应用前景，目前未有从麻虾酱中筛选产甲壳素酶菌株且利用麻虾生产甲壳低聚糖的报道。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一株产甲壳素酶菌株。

为了实现本发明的上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一株产甲壳素酶菌株，其分类命名为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号cctccno：m2018263，保藏日期为2018年5月10日。

所述菌株从自然发酵的麻虾酱中分离获得。

本发明的链霉菌cs1801的理化性质如下：

形态学：在筛选培养基上生长5-7天，能形成明显的菌落，菌落呈圆型，干燥，粗糙，凸起，粉末状，较易挑起，无色素，土霉气味较轻。在pda上也能形成明显菌落，菌落呈圆形，干燥，粗糙，凸起，粉末状，难挑起，有深绿色色素出现，土霉气味重。革兰氏阳性菌，在电镜下观察，孢子链直行或柔曲，有分支，孢子为卵圆形，表面光滑。

培养特征：最适生长温度30℃左右，好氧；最适生长ph6.5～7。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在利用麻虾发酵产甲壳低聚糖中的应用。

进一步的，本发明提供了几种可用于产甲壳低聚糖的发酵培养基，包括：

以胶体甲壳素为发酵底物，发酵培养基成分为：

a液：k2hpo41.4g/l，kh2po40.6g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl10g/l，(nh4)2so420g/l，去离子水1000ml，ph6.5；

b液：10g/l胶体甲壳素，ph6.5；

使用前a液和b液等体积混合。

其中，胶体甲壳素的制备方法为：称取10g粉末甲壳素缓缓加入浓盐酸200ml，迅速搅拌，待其全部溶解后用玻璃棉过滤除去杂质，溶液加入1000ml蒸馏水。离心得到沉淀，用蒸馏水洗至中性。

或以麻虾粉末为发酵底物，发酵培养基成分为：

a液：k2hpo41.4g/l，kh2po40.6g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl10g/l，(nh4)2so420g/l，去离子水1000ml，ph6.5；

b液：100g/l麻虾粉末，ph6.5；

a液和b液等体积混合。

其中，所述麻虾粉末制备方式为：将冷冻麻虾流水解冻后烘干打粉，过100目筛。

或以湿麻虾为发酵底物，发酵培养基成分为：

300g/l湿麻虾，ph6.5。

其中，所述湿麻虾由冷冻麻虾流水解冻得到。

发酵菌株生产甲壳低聚糖的步骤如下：

（1）将菌株cs1801接种至pda液体培养基中，30℃，振荡培养2～3d；

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，30～37℃，振荡发酵5～7d；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液。

进一步的，所述的步骤（2）发酵培养是在30℃下进行。

以本发明的菌株为出发菌株可生物催化麻虾生产甲壳低聚糖；该菌株来源于传统的自然发酵食品，在食品行业具有广阔的应用前景；该菌株在pda固体培养基上生长良好，容易培养和保存，通过发酵麻虾所得的甲壳素酶酶活可达57.3u/l，甲壳低聚糖含量为0.58mol/l。

附图说明

图1为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801的电镜观察图；

图2为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801经革兰氏染色后的显微形态；

图3为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801的系统进化树；

图4为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801的发酵液的超高效液相色谱图，其中4-a为标品液相色谱图，4-b为发酵液液相色谱图；

图5为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801的发酵液的质谱图，其中5-a为标品质谱图，5-b为发酵液质谱图；

本发明涉及的生物材料，其分类命名为淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号cctccno：m2018263，保藏日期为2018年5月10日。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明淀粉酶链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801的筛选纯化及鉴定方法。

筛选样品为连云港市海娃食品有限公司的麻虾酱，称取25g虾酱与225ml生理盐水制备菌悬液，同时将其浓度分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3和10^-4倍。将菌悬液原液、10^-1倍稀释菌液、10^-2倍稀释菌液、10^-3倍稀释菌液和10^-4倍稀释菌液涂布于初筛培养基上，37℃生长1~7d后挑取生长良好的单一菌落在初筛培养基上划线分离。挑取初筛培养基上生产的周围有明显透明圈的单一菌落接种到液体培养基中，37℃，200r/min摇床培养1~7d。

初筛培养基：a液：k2hpo41.4g/l，kh2po40.6g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl10g/l，(nh4)2so420g/l，琼脂40g/l，去离子水1000ml，ph6.5。b液：10g/l胶体甲壳素，ph6.5。使用前等体积混合。

复筛培养基：a液：k2hpo41.4g/l，kh2po40.6g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl10g/l，(nh4)2so420g/l，去离子水1000ml，ph6.5。b液：10g/l胶体甲壳素，ph6.5。使用前等体积混合。

在pda固体培养基上插片，培养7天后，将盖玻片切割成合适大小，直接喷金扫描，在电镜下观察，孢子链直行或柔曲，有分支，孢子为卵圆形，表面光滑（图1）。

从初筛培养基平板上挑取一环菌与载玻片上水珠混合并过火。通过结晶紫初染，碘液酶染，乙醇脱色，番红复染后在显微镜下镜检，该菌为革兰氏阳性菌（图2）。

对上述菌株的16srdna部分的序列的测定及blast比对后用mega5.1构建n-j系统进化树分析，其16srdna序列如seqidno.1所示，系统进化树如图3所示，由此鉴定为链霉菌属，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名定为链霉菌（streptomycesdiastaticus）cs1801，其保藏编号为cctccm2018263。

实施例2

本实施例具体说明菌株cs1801在利用胶体甲壳素发酵产甲壳低聚糖中的应用。

（1）将菌株cs1801接种至pda液体培养基中，30℃，振荡培养2～3d；

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，30℃，振荡培养7d。发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，测定其甲壳素酶活为117.4u/l，甲壳低聚糖的含量为1.18mol/l。

发酵培养基成分和前述复筛培养基相同。

甲壳素酶酶活测定方法为：将发酵液3000r离心10min，取上清液为待测样品。往预先包被甲壳素酶抗体的包被微孔中，依次加入待测样品、辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体，经过37℃温育1h并彻底洗涤。用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）显色，在hrp催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定od值，通过标准曲线计算样品活性。标准品为纯甲壳素酶配置的0、1.5、3、6、12、24u/l酶溶液。酶活定义为：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解甲壳素产生1mgn-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位u。甲壳素酶elisa检测试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司。

实施例3

本实施例具体说明菌株cs1801利用胶体甲壳素发酵产甲壳低聚糖的产物种类。

（1）将菌株cs1801接种至pda液体培养基中，30℃，振荡培养2～3d；

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，30℃，振荡培养7d。发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液。

发酵培养基成分和前述复筛培养基相同。

利用超高效液相色谱-质谱串联（uplc-q-tof-ms）技术分析对发酵液中成分进行分析，确定甲壳素在链霉菌cs1801作用下分解成壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖。超高效液相色谱图见图4，质谱图见图5。

实施例4

本实施例具体说明菌株cs1801在利用麻虾粉末发酵产甲壳低聚糖中的应用。

（1）将菌株cs1801接种至pda液体培养基中，30℃，振荡培养2～3d；

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，35℃，振荡发酵5d；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液测甲壳素酶活，其酶活为57.3u/l，甲壳低聚糖的含量为0.58mol/l。甲壳素酶活测定同实施例2。

其发酵培养基为：

a液：k2hpo41.4g/l，kh2po40.6g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl10g/l，(nh4)2so420g/l，去离子水1000ml，ph6.5。b液：100g/l麻虾粉末，ph6.5。等体积混合。

实施例5

本实施例具体说明菌株cs1801在利用湿麻虾发酵产甲壳低聚糖中的应用。

（1）将菌株cs1801接种至pda液体培养基中，30℃，振荡培养2～3d，

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，37℃，振荡发酵7d；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液测甲壳素酶活，其酶活为50.3u/l。甲壳低聚糖的含量为0.43mol/l。甲壳素酶活测定同实施例2。

发酵培养基为：300g/l湿麻虾，ph6.5。

序列表

<110>常熟理工学院

<120>一株产甲壳素酶菌株及应用

<130>xb18111912

<141>2018-11-19

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1431

<212>dna

<213>淀粉酶链霉菌(streptomycesdiastaticuscs1801)

<400>1

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