同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针的制作方法

本发明属于动物病原检测领域，涉及检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的方法，特别涉及一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr的引物、taqman探针、包含该引物和探针的检测试剂盒以及该引物、探针和试剂盒在检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒中的应用。
背景技术：
：牛流行热(bovineephemeralfever，bef)是由牛流行热病毒(bovineephemeralfevervirus，befv)引起的肉牛、奶牛、黄牛以及水牛的一种急性、非接触型传染病。该病是由节肢动物传染，呈周期性流行，广泛分布于亚洲、非洲和大洋洲地区。根据其流行特点又称为暂时热、僵硬病、三日热。该病特征是突然高热，呼吸急促，消化机能障碍，跛行，僵硬全身虚弱。牛流行热病毒属于弹状病毒科、暂时热病毒属，为单股负链rna病毒，大小约14900bp，成熟病毒粒子长100～230nm、宽45～100nm，含有10个开放阅读框，3’到5’端依次为3’-n-p-m1-m2-g-gns-α1-α2-α3-β-γ-l-5’，所编码的蛋白中5种为结构蛋白，分别是核蛋白(nucleoprotein，n)、聚合酶交联蛋白(polymeraseassociateprotein，p)、聚合酶相关蛋白(largerna-dependentrnapolymerase，l)、基质蛋白(matrixprotein，m)、糖蛋白(surfaceglycoprotein，g)。其它为非结构蛋白。该病毒对热敏感，56℃、10min或者37℃、18h即可将病毒灭活，ph2.5以下或ph8.0以上数十分钟内即可将病毒灭活，并且对氯仿、乙醚等敏感。牛呼吸道合胞体病(bovinerespiratorysyncytial，brs)是由牛呼吸道合胞体病毒(bovinerespiratorysyncytialvirus，brsv)引起的一种急性、热性呼吸道传染病，主要症状为高热、咳嗽、流鼻涕和流涎等症状，是引起牛等反刍动物的呼吸道疾病的主要病原之一。该病呈世界性分布，对养牛业危害极大。据报道，15～18月龄牛发病率高达80～100％，一些牛场的病死率为5～20％，对养牛业造成了很大的经济损失。欧盟许多国家将该病列为仅次于牛病毒性腹泻(bvd)和传染性鼻气管炎(ibr)的第三大疾病。因此，牛呼吸道合胞体病的诊断即成为了国内外兽医界关注的重点。牛呼吸道合胞体病毒属于副粘病毒科肺病毒属，研究表明牛呼吸道合胞体病毒与人呼吸道合胞体病毒相似，病毒呈球状或丝状，病毒粒子大小为80～860nm，有囊膜，为单股负链rna病毒，大小为15～16kb，含有10个开放阅读框，编码11种蛋白，其中核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，n)、磷蛋白p、大聚合酶蛋白l为核衣壳蛋白，融合蛋白(fusionprotein，f)、附着蛋白(attachmentprotein，g)、小疏水蛋白(smallhydrophobicprotein，sh)为跨膜蛋白，还有3种非糖基化的基质蛋白(matrixprotein，m)，其余为非结构蛋白。目前，国内外常用的实验室检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的方法主要是血清学实验，包括血清中和实验、补体结合实验、免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验和分子生物学诊断等几大类，其中分子生物学诊断中的实时荧光定量pcr检测技术以其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。实时荧光定量pcr技术(quantitativereal-timepcr，qpcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出的，该技术是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量pcr作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。与常规pcr相比该技术可快速、灵敏的检测病毒rna和dna以及细菌dna，目前该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域。牛流行热病毒与牛呼吸道合胞体病毒均属于呼吸道疾病，目前已有牛流行热病毒或牛呼吸道合胞体病毒的单重荧光定量pcr方法，例如cn201210219927公开了检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒，cn201710246638公开了一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒，但单重的方法检测时间较长、检测成本较高。目前，疫苗接种是疫病预防的主要手段。在疫苗的生产过程中，准确、特异、快速地检测牛流行热病毒和/或牛呼吸道合胞体病毒抗原的含量在疫苗生产监控等方面具有重要意义，目前，生产过程中抗原滴度的测定主要依赖于tcid50，该方法操作繁琐，并且与操作人的熟练度有直接的关系。本发明能够对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒实施快速的鉴别检测，可为疫苗生产过程中的菌种筛选提供有力依据，确保疫苗中抗原的含量，对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒疫苗的生产具有一定的指导作用；还可以在临床上对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行调查监控，并为后续临床处置提供客观数据。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，还可以为后续灭活疫苗的效力检验提供前期技术基础，应用前景广阔。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr的引物和taqman探针。该引物基于牛流行热病毒序列自5’端第3413～3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847～1988位碱基作为检测序列设计得到。优选地，用于检测牛流行热病毒的上游引物的核苷酸序列如sedidno：1所示或其衍生序列，用于检测牛流行热病毒的下游引物的核苷酸序列如seqidno：2所示或其衍生序列；用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物的核苷酸序列如sedidno：3所示或其衍生序列，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物的核苷酸序列如seqidno：4所示或其衍生序列。该taqman探针基于牛流行热病毒序列自5’端第3413～3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847～1988位碱基作为检测序列设计得到。优选地，用于检测牛流行热病毒的taqman探针的核苷酸序列如sedidno：5所示或其衍生序列，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的taqman探针的核苷酸序列如seqidno：6所示或其衍生序列；探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。更优选地，用于检测牛流行热病毒的taqman探针的报告荧光基团为fam，荧光淬灭基团为tamra；用于检测牛呼吸道合胞体病毒的taqman探针的报告荧光基团为rox，荧光淬灭基团为bhq2；并且探针的3’端经磷酸化处理。本发明的第二个目的是提供一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒，其包含上述本发明的引物和taqman探针。优选地，该检测试剂盒包含以下用于25μl双重实时荧光定量pcr反应体系的试剂：实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，takaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，用于检测牛流行热病毒的上游引物(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的下游引物(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的taqman探针(10μm)0.75μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的taqman探针(10μm)0.5μl，rna-freeh2o4.25μl。本发明的第三个目的是提供一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测方法，该方法使用上述引物和探针、或检测试剂盒对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行非诊断用途的定性、定量检测。该方法涉及对待测样品中牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒含量进行检测，待测样品包括疫苗的生产原料、灭活液、浓缩液及成品，以实现对疫苗生产各环节中的病毒含量进行质控。该方法包括以下步骤：1)建立标准曲线：分别构建携带牛流行热病毒的重组质粒和携带牛呼吸道合胞体病毒的重组质粒，制备dna标准品，分别以10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，以不同浓度的标准品作为模板，在本发明的引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr，检测结束后，以各标准品的浓度log值(x轴)对其相应循环数(ct值)(y轴)作图，绘制标准曲线；2)提取待测样品的基因组总rna，以提取的总rna为模板，在本发明的引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr；3)用得到的ct值或荧光信号的变化实现对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的拷贝数，实现定量检测。优选地，该方法步骤3)中的定性检测使用以下任一种方法：结果判定方法1：阳性对照样品ct值＜37，阴性对照样品ct值≥38时实验成立，待测样品ct值＜37时判定结果为阳性，ct值为37～39时判定结果为可疑，需复检，ct值≥39时，则判定结果为阴性；结果判定方法2：根据荧光信号的变化，对待测样品中的牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行定性检测，出现荧光扩增曲线判定样品为阳性。优选地，该方法步骤1)和步骤2)中使用25μl双重实时荧光定量pcr反应体系，其包含：模板2μl，实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，takaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，用于检测牛流行热病毒的上游引物(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的下游引物(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的taqman探针(10μm)0.75μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的taqman探针(10μm)0.5μl，rna-freeh2o4.25μl；双重实时荧光定量pcr反应条件为：先52℃15min反转录，95℃预变性1min；然后95℃变性30s、54℃退火30s，共45个循环。本发明提供了一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr方法。本发明方法与单重定量的方法比较，其准确性、重复性和敏感度并不低于单重的定量方法，因此，本发明方法的建立旨在于缩短牛流行热病和牛呼吸道合胞体病的分子检测时间，降低检测的成本，并准确区分两种病毒。本发明提供两对自主设计的引物和两条taqman探针，引物和探针分别针对牛流行热病毒基因和牛呼吸道合胞体病毒基因的保守区设计。本发明通过建立针对牛流行热病毒基因和牛呼吸道合胞体病毒基因的双重实时荧光定量pcr方法，能够进行牛流行热病和牛呼吸道合胞体病的非诊断用途的定性检测，并可对病毒拷贝数进行精确定量。本发明亦可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和合理性，对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒疫苗的生产研发具有指导作用。本发明的检测方法操作简便、特异性强，将在牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的检测及疫苗研发生产中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。附图说明图1示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛流行热病毒的标准品扩增曲线；图2示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛流行热病毒的标准品标准曲线；图3示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛呼吸道合胞体病毒的标准品扩增曲线；图4示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛呼吸道合胞体病毒的标准品标准曲线；图5示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测特异性实验的扩增曲线；图6示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr牛流行热病毒标准品重复性实验扩增曲线；图7示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛流行热病毒标准品重复性实验标准品的标准曲线；图8示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测牛呼吸道合胞体病毒标准品重复性实验扩增曲线；图9示出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr牛呼吸道合胞体病毒标准品重复性实验标准品的标准曲线。具体实施方式本发明提供一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr的引物和taqman探针，以实现牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的同时检测。本发明所提供的用于对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行检测的双重实时荧光定量pcr的引物为：用于检测牛流行热病毒的上游引物(befv-f)的核苷酸序列如sedidno：1所示，用于检测牛流行热病毒的下游引物(befv-r)的核苷酸序列如seqidno：2所示；用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物(brsv-f)的核苷酸序列如sedidno：3所示，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物(brsv-r)的核苷酸序列如seqidno：4所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本发明。衍生序列是指在seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3和/或seqidno：4的基础上经过一至十个、优选一至五个、更优选一至二个、最优选一个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。本发明所提供的用于对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行双重实时荧光定量pcr检测的taqman探针为：用于检测牛流行热病毒基因的taqman探针(befv-p)的核苷酸序列如sedidno：5所示；用于检测牛呼吸道合胞体病毒基因的taqman探针(brsv-p)的核苷酸序列如seqidno：6所示；该探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。由上述taqman探针衍生的序列也属于本发明。衍生序列是指在seqidno：5和seqidno：6的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。befv-p的报告荧光基团为fam，荧光淬灭基团为tamra；brsv-p的报告荧光基团为rox，荧光淬灭基团为bhq2。为防止pcr扩增时taqman探针被延伸，探针的3’端已经磷酸化处理。本发明还提供一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒，其包含上述本发明的引物和taqman探针。具体来讲，该检测试剂盒可包含以下用于25μl双重实时荧光定量pcr反应体系的试剂：模板2μl，实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，takaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ(购于takara公司)0.5μl，befv-f(10μm)1μl，befv-r(10μm)1μl，brsv-f(10μm)1μl，brsv-r(10μm)1μl，befv-p(10μm)0.75μl，brsv-p(10μm)0.5μl，rna-freeh2o4.25μl。本发明进一步提供一种使用上述双重实时荧光定量pcr的引物和taqman探针、或检测试剂盒对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行定性、定量检测的方法。利用本发明所提供的引物和taqman探针对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行双重实时荧光定量pcr检测，可包括以下步骤：1)建立标准曲线：分别将携带牛流行热病毒基因的重组质粒pcr-topo-befv和携带牛呼吸道合胞体病毒基因的重组质粒pcr-topo-brsv作为标准品(标准品为本申请发明人所在实验室构建，具体构建方法详见下文实施例2)，分别以10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，以不同浓度的标准品作为模板，在上述本发明的引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测，检测结束后，以各标准品的浓度log值(x轴)对其相应ct值(y轴)作图，分别绘制对于牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的标准曲线；2)提取待测样品的总rna，以提取的rna为模板，在上述本发明的引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测；3)用得到的ct值或荧光信号的变化实现对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的两条标准曲线，得出待测样品中所含牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的拷贝数，实现定量检测。在上述方法中，步骤3)中的定性检测使用以下任一种方法：结果判定方法1：阳性对照样品ct值＜37，阴性对照样品ct值≥38时实验成立，待测样品ct值＜37时判定结果为阳性，ct值为37～39时判定结果为可疑，需复检，ct值≥39时，则判定结果为阴性；结果判定方法2：根据荧光信号的变化，对待测样品中的牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行定性检测，出现荧光扩增曲线判定样品为阳性。在上述方法中，步骤2)中的待测样品主要包括：血清、病毒细胞培养物。步骤1)和步骤2)中的25μl双重实时荧光定量pcr反应体系可包括：模板2μl，实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ(购于takara公司)12.5μl，takaraextaqhs(购于takara公司)0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ(购于takara公司)0.5μl，befv-f(10μm)1μl，befv-r(10μm)1μl，brsv-f(10μm)1μl，brsv-r(10μm)1μl，befv-p(10μm)0.75μl，brsv-p(10μm)0.5μl，rna-freeh2o4.25μl。步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量pcr反应条件可为：先52℃15min反转录，再95℃预变性1min；然后95℃变性30s、54℃退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。实施例下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度。实施例中描述的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用引物由华大基因公司合成，taqman探针由takara公司合成。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的公开内容不限于下述的实施例。实施例1.设计对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行双重实时荧光定量pcr检测的引物及taqman探针从ncbi的核酸数据库genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得牛流行热病毒(genbank号：nc_002526)和牛呼吸道合胞体病毒(genbank号：af295543)的序列，用dnaman软件进行比对后，确定牛流行热病毒的特异性引物的靶序列为自5’端第3058～4929位碱基，牛呼吸道合胞体病毒的特异性引物的靶序列为自5’端第1610～2350位碱基，在此基础上再用primerexpress6.0软件设计牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒在该片段范围进行双重实时荧光定量pcr检测的引物对及taqman探针，分别设计2对引物和2条探针，并通过单重荧光定量pcr进行优选，最终确定本发明最优的牛流行热病毒目的基因序列为自5’端第3413～3518位碱基，牛呼吸道合胞体病毒目的基因序列为自5’端第1847～1988位碱基。引物和探针优选过程：分别对所设计的2对befv和brsv(befv1、befv2；brsv1、brsv2)荧光定量引物与探针进行单重实时荧光定量pcr，所用反应体系与反应条件如下：1)25μl单重实时荧光定量pcr反应体系可包括：模板1μl，实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ(购于takara公司)12.5μl，takaraextaqhs(购于takara公司)0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ(购于takara公司)0.5μl，上游引物f(10μm)1μl，下游引物r(10μm)1μl，探针(10μm)1μl，rna-freeh2o7.5μl。引物稀释为10ng/μl，反应体系中最终加量为10ng。taqman探针稀释为10ng/μl，反应体系中最终加量为10ng。2)单重实时荧光定量pcr反应条件可为：先52℃，15min反转录；再95℃预变性1min；然后95℃变性30s、54℃退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应结束后比较ct值和平台期所能达到的扩增值，筛选出最优的牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重实时荧光定量pcr的引物和探针。经过优选，本发明确定的对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行双重实时荧光定量pcr检测的引物及taqman探针序列如下：befv上游引物(befv-f)：5’-tagatcagggtgcattacttcgcc-3’(sedidno：1)，befv下游引物(befv-r)：5’-ggcttctgttgtattaggacatag-3’(sedidno：2)；brsv上游引物(brsv-f)：5’-gaggtagtagggtagaaggaatc-3’(sedidno：3)，brsv下游引物(brsv-r)：5’-cttgtacgctggcatgaccaagc-3’(sedidno：4)；befvtaqman荧光探针(befv-p)：5’-(fam)tattaccctcctgctggatgcttttgga(tamra)-3’(sedidno：5)brsvtaqman荧光探针(brsv-p)：5’-(rox)ttgcagggttattcatgaatgcatatggag(bhq2)-3’(sedidno：6)。befv的报告荧光基团为fam，荧光淬灭基团为tamra；brsv的报告荧光基团为rox，荧光淬灭基团为bhq2。为防止pcr扩增时taqman探针被延伸，探针的3’端已经磷酸化处理。实施例2.使用本发明的引物及taqman探针对牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒进行双重实时荧光定量pcr检测步骤一.提取样品的总rna对灭活的牛流行热病毒细胞培养物和牛呼吸道合胞体病毒细胞培养物提取病毒核酸，提取方法有两种，即传统trizol提取法和商品化核酸提取试剂盒提取病毒rna，可以任择其一。具体方法包括以下步骤：以axypreptmbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit为例。1)将待测样品、阴性对照、阳性对照分别进行编号。2)按试剂盒说明书，预先配置含1％冰乙酸的异丙醇并在试剂bufferw1a和bufferw2中添加指定体积的无水乙醇。3)将200μl样品转移至1.5ml离心管中(如果样品中有细菌或细胞污染，可先12000g，离心5min，取上清200μl作为样品)。4)向步骤3)的样品中，加入200μlbufferv-l，漩涡震荡混匀后，室温静置5min，得到混合液。5)向步骤4)的混合液中，加入75μlbufferv-n，漩涡震荡混匀，12000g离心5min。6)将步骤5)中离心得到的上清液转移至2ml离心管(试剂盒内提供)中，加入300μl异丙醇(含1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。7)将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，将步骤6)中得到的混合液移入至制备管中，以6000g离心1min。8)弃离心液，将制备管置回至2ml离心管中，加入500μlbufferw1a，室温静置1min。以12000g离心1min。9)弃离心液，将制备管置回至2ml离心管中，加入800μlbufferw2，以12000g离心1min。10)将制备管置回到2ml离心管中，以12000g离心1min。11)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管的膜中央加入40μl无酶水(bufferte)，室温静置1min。以12000g离心1min洗脱核酸，得到总rna溶液。步骤二.牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr标准曲线的建立1.pcr扩增牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒目的片段对步骤一提取的牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒总rna分别进行pcr扩增，分别得到牛流行热病毒和(引物为befv-f和befv-r)和牛呼吸道合胞体病毒(引物为brsv-f和brsv-r)的目的片段，25μl反应体系如下：表1牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的pcr扩增体系试剂名称体积(μl)2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5takaraextaqhs0.5primescriptrtenzymemixⅱ0.5上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1rna模板1rna-freeh2o8.52.标准品制备1)将纯化回收的牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒目的片段分别克隆至pcr-topo载体(购自invitrogen公司)中构建成重组质粒。2)将重组质粒转化至jm109感受态细胞(购自takara公司)中，在amp+lb固体培养基37℃过夜培养。3)挑选阳性克隆，接种至amp+lb液体培养基中，37℃，210rpm增菌培养，将菌液送华大基因公司测序。4)将上述3)中测序正确的菌液，37℃培养6-12小时后，取菌液提取质粒，即制备得到dna标准品。分别命名为pcr-topo-befv和pcr-topo-brsv。3.双重实时荧光定量pcr标准曲线的建立分别对测序正确的携带牛流行热病毒目的片段的重组质粒pcr-topo-befv和携带牛呼吸道合胞体病毒目的片段的重组质粒pcr-topo-brsv提取出的dna标准品，用qubit3.0测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，按照10倍梯度将牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒标准品分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，每个样品做2个重复，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测。双重实时荧光定量pcr的反应体系(25μl)如下：表2befv和brsv的双重实时荧光定量pcr反应体系试剂名称体积(μl)2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5takaraextaqhs0.5primescriptrtenzymemixⅱ0.5befv-f(10μm)1befv-r(10μm)1brsv-f(10μm)1brsv-r(10μm)1befv-p(10μm)0.75brsv-p(10μm)0.5dna模板2.0rna-freeh2o4.25双重实时荧光定量pcr的反应条件为：先52℃，15min反转录；再95℃预变性1min；然后95℃变性30s、54℃退火30s，共45个循环。标准品的双重实时荧光定量pcr扩增曲线如图1(befv)和图3(brsv)所示，标准品扩增曲线为平滑的“s”形曲线，图中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl。检测结束后，以各标准品的浓度log值(x轴)对其相应ct值(y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图2(befv)和图4(brsv)所示，相关系数分别为r2＝0.997与r2＝0.998，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝-3.178x+44.047(befv)和y＝-3.402x+44.515(brsv)。步骤三.牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒临床病料的双重实时荧光定量pcr检测用本发明建立的同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr方法，对所收集的19份牛流行热病毒细胞培养物(来自金宇保灵生物药品有限公司)和12份疑似感染牛呼吸道合胞体病毒的牛鼻拭子(来自牧场)以及3份患病牛鼻拭子(来自牧场)，用步骤一所述方法提取总rna，取其中12份牛流行热病毒rna和12份疑似感染牛呼吸道合胞体病毒rna混合形成样品1～12，另外7份牛流行热病毒rna为样品13～19，3份患病牛病毒rna为样品20-22，分别以灭活的牛流行热病毒细胞培养物和牛呼吸道合胞体病毒dna标准品为阳性对照，以无酶水为阴性对照，并用步骤二所述双重实时荧光定量pcr方法进行检测。根据牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒双重实时荧光定量pcr检测结果，对样本结果进行判定，并对所感染病毒的拷贝数进行定量。结果如表3所示，所检测的样品1-12判定为befv阳性、brsv阴性；样品13-19判定为befv阳性、brsv阴性；样品20判定为befv阴性、brsv阴性；样品21判定为befv阳性、brsv阳性；样品22判定为befv阴性、brsv阳性。结果表明，本发明的双重实时荧光定量pcr方法能同时检测和区分牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒。表3待测样品的双重实时荧光定量pcr检测结果实施例3.同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒本发明的同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒包含以下用于25μl双重实时荧光定量pcr反应体系的试剂：实时荧光定量pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，takaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，用于检测牛流行热病毒的上游引物befv-f(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的下游引物befv-r(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的上游引物brsv-f(10μm)1μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的下游引物brsv-r(10μm)1μl，用于检测牛流行热病毒的taqman探针befv-p(10μm)0.75μl，用于检测牛呼吸道合胞体病毒的taqman探针brsv-p(10μm)0.5μl，rna-freeh2o4.25μl。本发明试剂盒的使用方法参考实施例2。实施例4.特异性实验按照实施例2的方法对牛副流感病毒(bpiv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)提取rna并进行反转录，鼻气管炎病毒(ibrv)直接提取dna，同时以牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒dna标准品为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。检测结果如图5所示，牛流行热病毒阳性对照和牛呼吸道合胞体阳性对照的ct值分别为25/27(＜37)，结果阳性；阴性对照ct值为n/a(≥39)，试验成立；牛副流感病毒(bpiv)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)和牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的ct值均>39，且未出现特定的扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒。实施例5.灵敏度实验按照实施例2所述，将牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒标准品按照10倍梯度分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，以不同浓度的标准品作为模板，在本发明引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的灵敏度。结果如图1和图3所示，牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的扩增曲线显示牛流行热病毒的双重实时荧光定量pcr检测可至1×102拷贝/μl，牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr检测可至1×101拷贝/μl，灵敏度较高。实施例6.重复性实验按照实施例2所述，将牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒标准品按照10倍梯度分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，以不同浓度的标准品作为模板，并分别做三个重复，在本发明引物和taqman探针的引导下进行双重实时荧光定量pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法重复性，结果牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的扩增曲线如图6、图8所示，标准曲线如图7、和图9所示。重复性结果如表4和表5所示。从图中可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明牛流行热病毒和牛合胞体病毒双重实时荧光定量pcr检测方法的重复性较好，循环数组内标准偏差相差最高仅为1.217，变异系数为3.25；组间标准偏差为1.12，变异系数为2.83。表4牛流行热病毒和牛合胞体病毒双重实时荧光定量pcr重复性实验组内变异系数表5牛流行热病毒和牛合胞体病毒双重实时荧光定量pcr重复性实验组间变异系数序列表<110>金宇保灵生物药品有限公司<120>同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量pcr的引物和探针<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>befv上游引物（befv-f）(人工序列)<400>1tagatcagggtgcattacttcgcc24<210>2<211>24<212>dna<213>befv下游引物（befv-r）(人工序列)<400>2ggcttctgttgtattaggacatag24<210>3<211>23<212>dna<213>brsv上游引物（brsv-f）(人工序列)<400>3gaggtagtagggtagaaggaatc23<210>4<211>23<212>dna<213>brsv下游引物（brsv-r）(人工序列)<400>4cttgtacgctggcatgaccaagc23<210>5<211>28<212>dna<213>befvtaqman荧光探针（befv-p）(人工序列)<400>5tattaccctcctgctggatgcttttgga28<210>6<211>30<212>dna<213>brsvtaqman荧光探针（brsv-p）(人工序列)<400>6ttgcagggttattcatgaatgcatatggag30当前第1页12