一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法与流程

本发明涉及一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术：

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

国内外报道的杨树溃疡病(poplarcankerdisease)的病原菌种类很多(袁嗣令1984)，而我国杨树溃疡病绝大多数由真菌引起(许文力等1997)，对林业生产造成巨大损失的溃疡病害的病原主要是葡萄座腔菌属botryosphaeria(引起水泡型溃疡病)，由葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)引起的杨树水泡型溃疡病主要发生在主干和大枝上，发病初期在光皮杨树品种树皮上的皮孔边缘形成近圆形小泡状病斑，随后病斑逐渐变大至直径为1cm左右的圆形小泡，按压之有无色液体流出；在粗皮杨树上则多形成有红褐色液体流出的水渍状病斑，后期病斑失水干瘪形成一个圆形稍下陷的坏死斑，黑褐色。发病严重时，病斑连接成片，布满整个树干，最后枝干枯死。该类杨树溃疡病在我国广泛分布，严重影响着我们杨树人工林的健康持续发展。

目前在杨树真菌性溃疡病菌的检测上，较常用的方法有两种，一种是分子生物学检测方法，其中以pcr最为常见，但是pcr需要30～35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(pcr仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广；另一种是血清学检测方法，例如elisa通过酶的高效催化作用与底物发生显色反应，从而定性或者定量鉴定不同真菌，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification)是2000年日本学者notomi等人新发明的一种核酸特异性序列体外等温扩增技术。lamp技术的关键在于引物的设计。与传统pcr引物相比较其特异性在于普通的真菌pcr引物只有正向引物和反向引物两种，两种引物分别沿模板连的5’端和3’端按碱基互补配对的原则扩增，而lamp引物是主要是针对要扩增的靶基因的六个不同的区域设计的，分别是基于靶基因3’端的flc区、f2c区和f3c区以及基于靶基因5’端的bl区、b2区和b3区等6个不同的区域位点设计的4种引物该技术已在各种检测鉴定技术中被证明有着不可比拟的优势并且得到迅速发展，尤其在食物病原细菌以及口腔细菌的检测鉴定中发展迅速。lamp技术的主要特点在于用两对特殊设计的引物(一对内引物，一对外引物)和具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)在反应中在模板两端的引物结合处不断重复出现单链环状结构，并且使引物可以在等温条件下与模板结合进行连置换扩增反应。与传统的pcr技术相比较，lamp技术克服了传统pcr要通过反复热变性以获取单链模板的缺点，大大节省了反应时间，实现了等温条件下的连续快速扩增，并且其灵敏度与传统的pcr技术相比有了很大的提高；同时，lamp引物为2对特异性引物，2对引物是针对靶基因的六个区域设计的，这就使lamp扩增有较高的特异性。lamp扩增结果的检测有多种方法：扩增产物电泳检测会出现特征性的阶梯状条带；扩增产物中加入mg²⁺肉眼可见白色浑浊物；扩增产物中加入荧光染料钙黄绿素混匀后，在肉眼中可见绿色荧光。

针对引起杨树溃疡病的葡萄座腔菌属的lamp检测，并未有文献报道。关于葡萄座腔菌的lamp检测，有研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物，并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度，然而该研究采用lamp检测茶藨子的葡萄座腔菌的最低检测限仅为1pg/μl，灵敏度较低，从而无法应用于杨树真菌性溃疡病菌的检测。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有快速、灵敏、稳定、高效，仪器要求简易、操作简便、成本低的检测杨树真菌性溃疡病菌的方法。

为此，本发明的一方面是提供一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测的引物组，由f3、b3、fip、bip组成；

f3：gcctgttcgagcgtcatt(见seqidno.1)

b3：tcagcgggtatccctacc(见seqidno.2)

fip：cgcttgaggcaagacgccacgctctgcttggtattgggc(见seqidno.3)

bip：acatacatctcgcttcggagcgtccgaggtcaaccttgagaa(见seqidno.4)。

本发明的另一方面是一种上述的引物组在环介导等温扩增快检测杨树真菌性溃疡病菌中的应用。

本发明的第三方面是提供一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法，使用上述引物组对提取的杨树真菌性溃疡病菌dna进行环介导等温扩增，环介导等温扩增后进行电泳检测或荧光检测。

本发明的第四方面是提供一种试剂盒，包括上述引物组、bstdna聚合酶。

本发明的第五方面是提供一种上述试剂盒在环介导等温扩增快检测杨树真菌性溃疡病菌中的应用。

本发明的有益效果为：

根据杨树真菌性溃疡病菌核苷酸序列设计lamp引物，通过摸索优化条件实现了该真菌的快速检测，为该病害的调查提供了一种简便有效的方法，极大地提高了检测效率，降低了检测成本。

本发明建立了一种杨树真菌性溃疡病菌的环介导等温检测方法，本发明针对目的基因botryosphaeriadothidea的6个区域设计了4条特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在等温65℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了lamp扩增的高度特异性。样品提取总dna后，进行lamp反应，反应产物经电泳或者加入荧光染料钙黄绿素(北京索莱宝生物)直接观察的方法实现杨树真菌性溃疡病菌的快速检测。提供的方法对botryosphaeriadothidea的检测特异性强，具有快速、灵敏、稳定、高效，仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。

附图说明

构成本公开的一部分说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1是lamp引物筛选结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1-3：分别为三套引物检测botryosphaeriadothidea感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。

图2是lamp引物筛选结果荧光染料图，1-3：分别为三套引物检测botryosphaeriadothidea感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。

图3是lamp反应体系优化结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1、2、3、7、8、9、13、14、15：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系检测botryosphaeriadothidea感病样品，4、5、6、10、11、12、16、17、18：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系的阴性对照。

图4是lamp反应体系优化结果荧光染料图，1、2、3、7、8、9、13、14、15：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系检测botryosphaeriadothidea感病样品，4、5、6、10、11、12、16、17、18：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系的阴性对照。

图5是lamp特异性检测结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1为田间感染botryosphaeriadothidea杨树样品，2、3、4、5分别为diplodiaseriata、alternariaalternata、colletotrichumgloeosporioides、cytosporachrysosperma感病样品，6～10：分别是以上阴性对照。

图6是lamp特异性检测结果荧光染料图，其中1为田间感染botryosphaeriadothidea杨树样品，2、3、4、5分别为diplodiaseriata、alternariaalternata、colletotrichumgloeosporioides、cytosporachrysosperma感病样品，6～10：分别是以上阴性对照。

图7是lamp灵敏性检测结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1-8分别用dna稀释10⁰-10^-7倍做模板，9：阴性对照。

图8是lamp灵敏性检测结果荧光染料图，其中1-8分别用dna稀释10⁰-10^-7倍做模板，9：阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于pcr检测和elisa通过酶的高效催化作用与底物发生显色反应存在时间长、灵敏度低的不足，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法。

本公开的一种典型实施方式，提供了一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测的引物组，由f3、b3、fip、bip组成；

f3：gcctgttcgagcgtcatt(见seqidno.1)

b3：tcagcgggtatccctacc(见seqidno.2)

fip：cgcttgaggcaagacgccacgctctgcttggtattgggc(见seqidno.3)

bip：acatacatctcgcttcggagcgtccgaggtcaaccttgagaa(见seqidno.4)。

本公开的另一种实施方式，提供了一种上述的引物组在环介导等温扩增快检测杨树真菌性溃疡病菌中的应用。

本公开的第三种实施方式，提供了一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法，使用上述引物组对提取的杨树真菌性溃疡病菌dna进行环介导等温扩增，环介导等温扩增后进行电泳检测或荧光检测。

该实施方式的一种或多种实施例中，环介导等温扩增的反应体系，以体积份数计：

9.5～10.5份2×u-lampmix，3.5～4.5份引物mix，1.5～2.5份杨树真菌性溃疡病菌dna溶液，0.5～1.5f份bstdna聚合酶，7.5～8.5份ddh2o，所述引物mix中含有上述引物组。

该实施方式的一种或多种实施例中，环介导等温扩增的条件为：先在64～66℃恒温50～55min，然后升温至78～82℃恒温8～12min。

该实施方式的一种或多种实施例中，采用ctab法提取杨树真菌性溃疡病菌dna。

该系列实施中，ctab法的步骤如下：

(1)取杨树真菌性溃疡病菌置于灭菌研钵中，加入液氮研磨，研磨获得菌丝粉；

(2)向菌丝粉末中，加入2×ctab提取液，混合均匀；

(3)将步骤(2)获得的溶液，进行水浴加热；

(4)将水浴加热后的溶液离心分离获得一次上清液；

(5)向一次上清液中加入苯酚、氯仿、异戊醇的混合物，震荡至液体呈均一乳白色；

(6)将乳白色液体离心分离获得二次上清液；

(7)向二次上清液中加入异丙醇，混合均匀后，静置；

(8)将静置后的沉淀用乙醇水溶液洗涤、干燥，获得杨树真菌性溃疡病菌dna。

步骤(3)中，水浴加热的条件为64～66℃水浴10～20min。

步骤(4)中，离心分离的条件为：10000±100rpm离心6～8min。

步骤(5)中，苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1。一次上清液与苯酚、氯仿、异戊醇的混合物的体积相等。

步骤(6)中，离心分离的条件为：12000±100rpm离心8～11min。

步骤(7)中，二次上清液与异丙醇的体积相等。静置的条件为3～5℃沉淀25～35min。

步骤(8)中，静置后沉淀的分离方法为离心分离。离心条件为12000±100rpm离心4～6min。乙醇水溶液为体积分数为70％的乙醇。

该实施方式的一种或多种实施例中，电泳检测的方法为：取扩增产物加dnabuffer混匀加入琼脂糖凝胶中电泳，选择d2000为dnamarker，电压设为120v，电泳30～45min后将凝胶用eb染液染色10～15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。

该实施方式的一种或多种实施例中，荧光检测的方法为：向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有葡萄座腔菌的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有葡萄座腔菌的样品。

本公开的第四种实施方式，提供了一种试剂盒，包括上述引物组、bstdna聚合酶。

该实施方式的一种或多种实施例中，包括2×u-lampmix。

本公开的第五种实施方式，提供了一种上述试剂盒在环介导等温扩增快检测杨树真菌性溃疡病菌中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

材料与试剂：

标本采集在山东省菏泽市赵和桥杨树人工林进行，采集时间选在8、9月份病害发生的高峰期，采集各个发病时期的标本，带回实验室待分离纯化和鉴定。鉴定为目标菌株后-20℃保存。

主要试剂：

bstdna聚合酶：购自北京美莱博医学科技有限公司；

2×u-lampmix：购自北京美莱博医学科技有限公司；

钙黄绿素：购自北京索莱宝生物有限公司。

实施例1：建立杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增检测方法

以感染杨树真菌性溃疡病菌样品为检测对象，以无核酸ddh2o为阴性对照。

1、引物设计：

根据ncbi上已报道的杨树真菌性溃疡病菌脱氧核糖核酸序列(mg878167.1botryosphaeriadothidea)，利用lamp引物设计软件primerexplorerv4设计了5套特异引物，根据lamp引物设计原则初步筛选出3套引物，引物序列如下(5’-3’)：

第一组引物：

f3：gcctgttcgagcgtcatt(见seqidno.1)

b3：tcagcgggtatccctacc(见seqidno.2)

fip：cgcttgaggcaagacgccacgctctgcttggtattgggc(见seqidno.3)

bip：acatacatctcgcttcggagcgtccgaggtcaaccttgagaa(见seqidno.4)

第二组引物：

f3：cctttggtattccgaagggc(见seqidno.5)

b3：tccgaggtcaaccttgagaa(见seqidno.6)

fip：caccgccgaggtctttgaggcgagcgtcattacaaccct(见seqidno.7)

bip：gcgtcttgcctcaagcgtagtgttcagaaggttcgtccgg(见seqidno.8)

第三组引物：

f3：tgcctgttcgagcgtcat(见seqidno.9)

b3：tccgaggtcaaccttgagaa(见seqidno.10)

fip：caccgccgaggtctttgaggtacaaccctcaagctctgct(见seqidno.11)

bip：gcgtcttgcctcaagcgtagtgttcagaaggttcgtccgg(见seqidno.12)

2、杨树真菌性溃疡病菌总dna提取：

采用ctab法提取杨树真菌性溃疡病菌总dna，具体步骤：

(2.1)取约2g备用菌丝，置于灭菌研钵中，加入液氮快速研磨，重复3次，至菌丝被研磨成粉状；

(2.2)将菌丝粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml预热的2×ctab提取液；

(2.3)颠倒混匀，置于水浴锅中，65℃水浴15min，每隔3-4min颠倒混匀一次；

(2.4)室温，10000rpm离心7min，将上清液转移至新离心管；(约600μl)

(2.5)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡15s，至液体呈均一乳白色；

(2.6)室温，12000rpm离心10min，将上清液转移至新离心管(约400μl)；

(2.7)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于4℃静置沉淀30min；

(2.8)室温，12000离心5min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，置于超净工作台下室温干燥5min；

(2.9)加入50μlddh2o，溶解dna，-20℃保存备用。

3、lamp反应及lamp引物的筛选：

反应体系(25μl)如下：10μl2×u-lampmix；4μl引物mix(华大基因)；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o

三组引物中引物(f3和b3)1μl，三组引物中引物(fip和bip)1μl，

反应条件：65℃恒温70min；80℃10min。

4、检测：

电泳检测：取5μl扩增产物加1μldnabuffer混匀加入1％的琼脂糖凝胶中电泳，选择d2000为dnamarker，电压设为120v，电泳40min后将凝胶用0.1％的eb染液染色10～15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。

或：荧光染料检测：扩增完成后，向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素(北京索莱宝生物)1μl，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有葡萄座腔菌的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有葡萄座腔菌的样品。

5、结果分析

电泳检测：在以杨树真菌性溃疡病菌样品dna为模板的三组引物中，可以观察到第一组引物呈弥散状的核酸泳带，而第二和第三组引物则没有弥散状核酸电泳带，在以无核酸ddh2o为模板的六组引物中均无核酸电泳条带，阴性对照也无核酸电泳带(图1)；

荧光染色：在以感染杨树真菌性溃疡病菌样品dna为模板的三组引物中，可以观察到第一组引物呈翠绿色，而第二和第三组引物和无核酸ddh2o样品橙黄色(图2)

实施例2：lamp检测体系的优化

通过实施例1可以筛选出最优的引物为第一组引物，通过对构建体系的主要影响的两个因素扩增温度和扩增温度筛选、确定最优检测体系。反应体系(25μl)：

a：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温30min；80℃10min。

b：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温30min；80℃10min。

c：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温30min；80℃10min。

d：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温50min；80℃10min。

e：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温50min；80℃10min。

f：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温50min；80℃10min。

g：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温70min；80℃10min。

h：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温70min；80℃10min。

i：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温70min；80℃10min。

lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素后肉眼观察两种方法来分析。通过图3可以看出，a、c、f、i体系中botryosphaeriadothidea扩增样品没有明显的弥散状核酸电泳带，b、d、e、g、h体系中botryosphaeriadothidea样品呈弥散状核酸电泳带，其中e体系样品弥散状核酸电泳带比较明亮清晰，b、d、g、h有条带但不是很明亮清晰，对照中均无核酸电泳带；通过图4可以看出，a、c、f、i体系中botryosphaeriadothidea扩增样品呈橙黄色，b、d、e、g、h体系中botryosphaeriadothidea样品呈现绿色荧光，其中e体系样品荧光最亮，对照均呈橙黄色。以上结果说明h体系为最优体系。

实施例3：本发明中lamp检测方法的特异性和稳定性

按上述实施例2反应h体系及反应条件，同时对田间diplodiaseriata、alternariaalternata、colletotrichumgloeosporioides、cytosporachrysosperma感病样品进行检测，检验lamp方法的特异性及稳定性。以提取的diplodiaseriata、alternariaalternata、colletotrichumgloeosporioides、cytosporachrysosperma感病样品中提取的dna为检测模板进行lamp扩增反应，lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素肉眼观察两种方法来分析。通过图5、6可以看出，仅在botryosphaeriadothidea反应管中出现了阳性反应出现特异性地翠绿色荧光，其他反应管均为阴性。结果说明本发明中的lamp方法特异性强，稳定性高，能够特异性地检测botryosphaeriadothidea，与其它真菌无交叉反应。

实施例4：本发明中lamp检测方法的灵敏性

样品：botryosphaeriadothidea(原始浓度3.7ng/μl)

样品处理：将botryosphaeriadothidea做10⁰-10^-7的倍比稀释。

按上述实施例2反应h体系及反应条件，以稀释后的dna来做lamp的模板进行lamp扩增反应，lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素肉眼观察两种方法来分析。通过图7、8可以看出，在稀释10^-7倍时还能检测到，并呈现特异的翠绿色荧光。结果说明本发明中的lamp方法灵敏性高，能够检测到10^-7(即3.7×10^-7ng/μl)的模板。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>引物

<400>1

gcctgttcgagcgtcatt18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>引物

<400>2

tcagcgggtatccctacc18

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>引物

<400>3

cgcttgaggcaagacgccacgctctgcttggtattgggc39

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>引物

<400>4

acatacatctcgcttcggagcgtccgaggtcaaccttgagaa42

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>引物

<400>5

cctttggtattccgaagggc20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>引物

<400>6

tccgaggtcaaccttgagaa20

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>引物

<400>7

caccgccgaggtctttgaggcgagcgtcattacaaccct39

<210>8

<211>40

<212>dna

<213>引物

<400>8

gcgtcttgcctcaagcgtagtgttcagaaggttcgtccgg40

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>引物

<400>9

tgcctgttcgagcgtcat18

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>引物

<400>10

tccgaggtcaaccttgagaa20

<210>11

<211>40

<212>dna

<213>引物

<400>11

caccgccgaggtctttgaggtacaaccctcaagctctgct40

<210>12

<211>40

<212>dna

<213>引物

<400>12

gcgtcttgcctcaagcgtagtgttcagaaggttcgtccgg40