一组打破烟草TMV抗性基因N下游（3’端）连锁累赘的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记及其应用。
背景技术：
：由烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,tmv）引起的烟草花叶病，是我国乃至全球烟叶产区的重要烟草病害之一。为了减少和避免因烟草花叶病而对烟草产业造成巨大经济损失，生产上主要采取药剂防治和人为销毁田间病残体等措施进行防治，虽在控制tmv的发生流行上取得了一定的效果，但在局部田块爆发tmv的情况仍然时有发生。因此，选育抗病品种、提高烟草本身的抗病性是防治tmv的根本途径。目前，生产上大面积推广应用的烟草tmv抗源主要是源于野生烟草-心叶烟(nicotianaglutinosa)，其抗性由一个显性单基因n控制（gersteldu,inheritanceinnicotianatabacum.xix.identificationofthetabacumchromosomereplacedbyonefromn.glutinosainmosaic-resistantholmessamsountobacco,genetics,1945,30:448-454）且n基因已在1994年被成功克隆（whithams,dinesh-kumarsp,choid,hehlr,corrcandbakerb,theproductofthetobaccomosaicvirusresistancegenen:similaritytotollandtheinterleukin-1receptor,cell,1994,78:1101-1115）。紧接着，利用n基因改良普通烟草（栽培烟草）的tmv抗性工作就取得很大进展（tternovskymf,methodsofbreedingtobaccovarietiesresistanttotobaccomosaicandpowderymildew,thea.i.mikoyanpansovietsci.res.inst.tob.&indiantob.ind.krasnodarpub,1945,143:126-141；wernsmanea,sourcesofresistancetovirusdiseases，corestainf.bull.,1992,3:113-119)。在采用传统的杂交育种手段获得的含有n基因而具有tmv抗性的烟草品种中，除了目标基因n外还携带n基因上（5’端）下游（3’端）紧密连锁的累赘片段（源自野生烟-心叶烟染色体片段）。因连锁累赘的存在，使烟草在获得tmv抗性的同时也存在产量上较低、上部叶落黄较慢、后期成熟叶片烘烤困难等不利影响，严重阻碍了含有tmv抗性基因n的烟草在生产上大面积推广应用。已有研究证明n基因本身除了提供tmv抗性外，并无产量和产值的不利影响，而连锁累赘造成的不利性状或影响是源自n基因上（5’端）下游（3’端）紧密连锁片段上的其他基因（lewisrs.,lingerlr.,wolffmf.,wernsmanea.,thenegativeinfluenceofn-mediatedtmvresistanceonyieldintobacco:linkagedragversuspleiotropy.theorapplgenet,2007,115:169-178;lewisrs,rosec,agronomicperformanceoftobaccomosaicvirus-resistanttobaccolinesandhybridspossessingtheresistancegenenintrogressedondifferentchromosomes.cropsci.,2010,50:1339-1347）。基于烟草tmv抗性基因n的序列，国内外研究者成功的开发出多个用于检测含有n基因而具有tmv抗性的分子标记（lewisrs,millasr,andlevinjs,molecularandgeneticcharacterizationofnicotianaglutinosal.chromosomesegmentsintobaccomosaicvirusresistanttobaccoaccessions,cropsci.,2005,45(6):2355-2362；袁清华,陈俊标,李淑玲,马柱文,邱道寿,张振臣,抗tmv烟草种质资源的n基因片段序列研究,广东农业科学,2011,1(29):96-99；陈爽,朴世领,金爱兰，烟草抗tmvn基因及其在分子标记辅助育种中的应用,延边大学农学学报,2012,34(4):355-361；张玉,罗成刚,殷英,胡小波,戴培刚,张波,烟草n基因及其在烤烟遗传育种中的应用,中国农学通报,2013,29(19):89-92），同时建立了相应的检测体系（刘磊,郭兆奎,万秀清,颜培强,乔婵,刘丹,n基因标记基因pcr检测方法的建立及其在遗传育种中的应用,分子植物育种,2010,8(1):167-171），并将其中的部分检测标记及方法申请了专利（cn101892304b；cn102140546b；cn103866038b）。但上述标记和方法仅是用来检测具有n基因的tmv抗性烟草品种，而不具有打破n基因紧密连锁的累赘片段的功能。虽有相关文献（lewisrs,millasr,levinjs,molecularandgeneticcharacterizationofnicotianaglutinosal.chromosomesegmentsintobaccomosaicvirus-resistanttobaccoaccessions.cropsci.,2005,45:2355-2362）和专利（cn105200052b;cn105200149b）利用分子标记来衡量和估算因导入n基因而携带的连锁片段长度，但这些研究所公开的分子标记是基于番茄基因组数据而不是与n基因紧密连锁的累赘片段序列信息，因此，这些分子标记只能用来粗略估计烟草中n基因上（5’端）下游（3’端）连锁累赘片段的长短，而不具备精确检测、判断和打破烟草中n基因的连锁累赘片段及具体位置信息，进而，限制了上述标记在培育既含n基因又具有完全打破连锁累赘或在不同位置部分打破连锁累赘的烟草抗tmv品种中的应用。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记；第二目的在于提供所述的打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记的应用。本发明的第一目的是这样实现的，所述的打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记编号为tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。本发明的第二目的是这样实现的，利用上述一组分子标记进行精确检测和判断待测烟草中n基因下游（3’端）连锁累赘打破程度及具体位置信息。本发明的另一目的是提供一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的pcr扩增所用的引物对。本发明的又一目的是提供一种用于精确检测和判断待测烟草中n基因下游（3’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的位置信息的方法。本发明的再一目的是提供上述分子标记、引物对及应用方法在培育烟草抗tmv品种中打破n基因下游（3’端）不利连锁累赘影响的应用。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：本发明公开了一组打破烟草tmv抗性基因n上游（5’端）连锁累赘的标记，所述的分子标记为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示序列。本发明还公开了一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的pcr扩增所用的引物对，所述的引物对为tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383，所述的一组引物对分别为：tmn324序列为tmn324f：5’-cgacttcatgaaagcaccag-3’，tmn324r：5’-ctactggactccacccacga-3’；tmn330序列为tmn330f：5’-tggttaaaactcccatcccta-3’，tmn330r：5’-tggaaaatgaatttttcgaatg-3’；tmn332序列为tmn332f：5’-tttgtgccaaaagaaaaggaa-3’，tmn332r：5’-tggagagatcgtgaaggtca-3’；tmn349序列为tmn349f：5’-tgcacgtctgatactttttga-3’，tmn349r：5’-caactttgcaccaccatcac-3’；tmn359序列为tmn359f：5’-caacacgcaccatcacaagt-3’，tmn359r：5’-ctatgctgccccttcttcac-3’；tmn360序列为tmn360f：5’-tggttaaagcatgcgacttg-3’，tmn360r：5’-aggagtttttcggcgattg-3’；tmn383序列为tmn383f：5’-tttacgccctcacaaaaacc-3’，tmn383r：5’-gatttcaccgtcgggactaa-3’。本发明还公开了一种精确检测和判断待测烟草中n基因下游（3’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的位置信息的方法。以tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383共7对引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物并根据产物序列的有无或产物序列的不同组合方式进行判断待测烟草中n基因下游（3’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息，具体的信息见表1：表1公开的7对引物pcr扩增产物核苷酸序列信息及其在烟草n基因下游（3’端）打破连锁累赘的位置信息本发明所公开的一组引物序列（seqidno.11-seqidno.24）及分子标记序列(seqidno.1-seqidno.10)是通过以下技术方案获得的。首先，利用基因组重测序技术（以二代测序技术为主同时以三代测序技术为辅助）分别对含有显性单基因n的野生烟草-心叶烟（nicotianaglutinosa）和通过人工杂交培育的含n基因及其连锁累赘片段的抗tmv烤烟品种coker176进行15×的重测序，获得的重测序数据再利用生物信息学方法进行过滤、拼接和组装，最终形成高质量的scaffold数据；其次，将获得的心叶烟和烤烟coker176的scaffold数据分别与已公开的烤烟k326全基因组数据信息（sierron.,batteyjn.,ouadis.,bakahern.,bovetl.,williga.,goepferts.,peitschmcandivanovnv.thetobaccogenomesequenceanditscomparisonwiththoseoftomatoandpotato.2014,nat.commun.,5,doi:10.1038/ncomms4833）进行比对，获得n基因下游（3’端）连锁累赘片段的完整序列信息；最后，基于获得的n基因下游（3’端）连锁累赘片段序列信息开发一组具有精确位置信息的分子标记并进行实验验证。本发明还公开了上述一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记在培育打破不利连锁累赘影响的烟草抗tmv品种中的应用。本发明的分子标记可用于培育打破n基因不利连锁累赘影响的烟草抗tmv品种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测含有n基因的烟草基因组dna中是否含有上述一组引物对所对应的pcr扩增产物核酸序列并根据扩增产物序列的有无进或序列间的不同组合方式进行精确判断待测烟草中n基因下游（3’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的具体位置信息。所述检测可以是pcr检测的方法，具体地，可以使用tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383引物对进行pcr扩增。所述检测还可以通过测序方法进行。该烟草育种辅助选择方法具有简捷、快速、高灵敏度的优点。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记，该组分子标记是基于n基因下游（3’端）完整的连锁累赘片段序列信息而开发获得且具有精确位置信息。与文献或专利已报道的n基因抗性相关分子标记或估算n导入片段长度标记相比，本发明所述分子标记是用于精确检测、判断和打破n基因下游（3’端）不同位置的连锁累赘片段，而不是用于评价n基因具有的抗性有无和粗略的估算n基因导入的连锁累赘片段长度。根据上述公开的一组分子标记，可精确的检测、判断和打破n基因下游（3’端）不同位置的连锁累赘片段，从而获得具有完全打破或在不同位置上部分打破不利连锁累赘影响的抗tmv烤烟品种。附图说明图1为7对引物在n基因下游（3’端）连锁累赘片段上的具体位置信息。图中左侧为具体的物理距离（单位为mb），右侧为引物名称，其中，n_gene_start和n_gene_start为n基因自身所在的位置信息，标记tmn323_n则为检测n基因的特异性引物，scf_end为n基因下游（3’端）连锁累赘片段的结束端；图2为引物tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383的pcr扩增产物在coker176（含有n基因的烤烟，基因型nn）、k326（无n基因的烤烟，基因型nn）及其子一代（f1，coker176×k326，基因型nn）三份材料中的电泳图。其中每对引物的三份烟草材料从左到右分别为：coker176、k326和f1。电泳图的最右侧泳道为100bpdnaladder，从上往下依次是500bp、400bp、300bp和200bp。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明公开了一组引物对以及打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记。利用本发明公开的一组引物对，以烟草基因组dna为模板进行pcr，可以精确检测、判断和打破烟草n基因下游（3’端）不同位置的连锁累赘片段。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述pcr扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。本发明所述的一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记的编号为tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383，其扩增产物核苷酸序列为seqidno.1-10所示。所述的分子标记所对应的7个位点的引物序列分别为：tmn324序列为tmn324f：5’-cgacttcatgaaagcaccag-3’，tmn324r：5’-ctactggactccacccacga-3’；tmn330序列为tmn330f：5’-tggttaaaactcccatcccta-3’，tmn330r：5’-tggaaaatgaatttttcgaatg-3’；tmn332序列为tmn332f：5’-tttgtgccaaaagaaaaggaa-3’，tmn332r：5’-tggagagatcgtgaaggtca-3’；tmn349序列为tmn349f：5’-tgcacgtctgatactttttga-3’，tmn349r：5’-caactttgcaccaccatcac-3’；tmn359序列为tmn359f：5’-caacacgcaccatcacaagt-3’，tmn359r：5’-ctatgctgccccttcttcac-3’；tmn360序列为tmn360f：5’-tggttaaagcatgcgacttg-3’，tmn360r：5’-aggagtttttcggcgattg-3’；tmn383序列为tmn383f：5’-tttacgccctcacaaaaacc-3’，tmn383r：5’-gatttcaccgtcgggactaa-3’。所述的一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3’端）连锁累赘的分子标记及其应用是：利用tmn324、tmn330、tmn332、tmn349、tmn359、tmn360和tmn383共7对引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物核酸序列并根据扩增产物序列的有无进或序列间的不同组合方式进行精确判断待测烟草中n基因下游（3’端）的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的具体位置信息。下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：实施例1一、实验材料含有n基因且具有tmv抗性的烟草材料共63份，其中白肋烟20份，烤烟40份，香料烟、晒烟和野生烟各1份，此63份烟草材料中的n基因均是源自野生烟草-心叶烟（n.glutinosa），故此，n基因下游（3’端）或多或少存在着连锁累赘片段。此外，还有1份不含n基因也不具备tmv抗性的烤烟（k326）用做对照，上述共计64份烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。具体的烟草材料信息见表2：表264份烟草材料的信息编号名称类型来源编号名称类型来源t01burley21白肋烟美国t33牡单80-7烤烟中国t02burley22白肋烟美国t34牡单81-56烤烟中国t03burley49白肋烟美国t35台烟5号烤烟中国t04burley64白肋烟美国t36台烟6号烤烟中国t05banketa-1白肋烟美国t37中卫1号烤烟中国t06k10白肋烟美国t38rbst烤烟中国t07k14(ergo)白肋烟美国t39coker86烤烟美国t08kentucky9白肋烟美国t40coker176烤烟美国t09kentucky10白肋烟美国t41h423烤烟美国t10kentucky12白肋烟美国t42nc567烤烟美国t11kentucky14白肋烟美国t43nc628烤烟美国t12kentucky15白肋烟美国t44nc7烤烟美国t13kentucky17白肋烟美国t45nc86烤烟美国t14kentucky908白肋烟美国t46sc71烤烟美国t15kentucky8959白肋烟美国t47sc72烤烟美国t16virginia1048白肋烟美国t48vamorr48烤烟美国t17nc3白肋烟美国t49virginia3160烤烟美国t18tn90白肋烟美国t50virginia645烤烟美国t19引巴1号白肋烟巴西t51virginia770烤烟美国t20bys白肋烟韩国t52virginia80烤烟美国t2178-3013烤烟中国t53we-12烤烟美国t227915烤烟中国t54k326烤烟美国t238211烤烟中国t55pvh01烤烟巴西t248212烤烟中国t56pvh02烤烟巴西t259501烤烟中国t57rgh04烤烟巴西t26b09烤烟中国t58pvh06烤烟巴西t27cv85烤烟中国t59pvh07烤烟巴西t28cv87烤烟中国t60朝鲜抗赤烤烟朝鲜t29大白筋2518烤烟中国t61ak6烤烟不详t30辽烟9号烤烟中国t62virginia878晒烟美国t31辽烟13号烤烟中国t63samsun-nn香料烟日本t32辽烟14号烤烟中国t64n.glutinosa野生烟南美洲二、烟草基因组dna提取采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献报道或试剂盒中的说明书。三、pcr扩增及电泳检测pcr扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献；pcr扩增程序中，上述7对引物的退火温度均为60℃，具体的pcr扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。四，n基因下游（3’端）的连锁累赘打破信息利用上述一组7对引物分别扩增待检测的64份烟草基因组dna，检测pcr扩增产物序列并根据产物序列的有无或不同组合方式进行判断待测的64份烟草中n基因下游（3’端）连锁累赘的打破程度及连锁累赘打破的精确位置信息。详细的结果表3：表3利用7对引物分析64份烟草材料中n基因下游（3’端）连锁累赘打破情况注：引物后面括号内数字表示该标记距离n基因的位置；+：该引物有pcr扩增产物且在该位置的连锁累赘未被打破；-：该引物没有pcr扩增产物且在该位置的连锁累赘完全被打破；+/+：该引物有一个pcr扩增产物（基因型为nn）且在该位置的连锁累赘未被打破；+/-：该引物有两个pcr扩增产物（基因型为nn）且在该位置的连锁累赘被部分打破；-/-：该引物有一个pcr扩增产物（基因型为nn）且在该位置的连锁累赘完全被打破；每个引物的pcr扩增产物序列信息详见表1。sequencelisting<110>云南省烟草农业科学研究院<120>一组打破烟草tmv抗性基因n下游（3'端）连锁累赘的分子标记及其应用<130>2018<160>24<170>patentinversion3.3<210>1<211>195<212>dna<213>tmn324扩增产物核苷酸序列<400>1cctaccctgccctaatccactatctttttaaaaaaaatttaatcctgccctgcctcattt60agcgtttgccctgccctgccctgccccatttagcgtttgctctgccttgccccattctaa120ttgtcatccctatttttgtttcctatttataacttaatcaaaaatataatcagttgtctt180actgcaacgaccaca195<210>2<211>287<212>dna<213>tmn330扩增产物核苷酸序列<400>2tctcttgccacaaccacaagtttttcacatacagttttcttacgcttttcagagaattaa60taccgagtccatggcatcatcttcttcttcttctgctagatggagctatgatgtttttct120aagttttagaggtgaagatactcggaaaacatttacaagtcacttgtacgaagtcttgaa180taataagggaataaaaacctttcaagatgaaaaaaggctagagtacggttcaactatccc240agaagaactctgtaaagctatagaagagtctcaatttgccatcatcg287<210>3<211>241<212>dna<213>tmn332扩增产物核苷酸序列<400>3caccctcctcttttccgatttatatcaaaatttggaaacctatttcattttaactcaaca60aaaaaaaaaaagtaaaaatggcacggggcgccctatttggtcgcccccatttaacatata120ctcatttttttaaaaagttttaacttgtactcactttttaaacaacttcagccccctttc180tcctcctccttctcctcctttgttttcttcttcttctttcttctgctactgttggtgctg240c241<210>4<211>225<212>dna<213>tmn349<400>4cgattaagttgcataccttccaccccctcccccctccaaaccaaaaaaatcaaaatcaaa60atcgacattctaactcgagggtatggcataatggtcaatgaagtgggatgaaaacatgag120agaataaggttcagttacaagtggcc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