基于BTNAA体系等温快速检测猪圆环2型病毒的引物、探针、试剂及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)是迄今发现的最小的动物病毒之一，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链dna，基因组大小约为1.76kb。现已知pcv有两个血清型，即pcv1和pcv2。pcv1为非致病性的病毒，pcv2为致病性的病毒。pcv2全长1768bp或1767bp，pcv2毒株间的核序列同源性大于96％。

pcv1与pcv2都有读码框orf1，编码病毒复制蛋白。各毒株间的orf1编码蛋白质序列间源性大于86％，在pcv各读码框编码的蛋白质中间源性最高。现已经证实，pcv有两个主要的阅读框，orf1和orf2，二者在长度上都大于600bp。orf1是最大的阅读框，编码病毒的复制蛋白(rep)，分子量大小为37kda，与病毒的复制转录有关。orf2编码病毒的结构蛋白，可以与pcv2的抗血清反应，liuq等研究表明，位于12-18位及34-41位的氨基酸残基对pcv2-orf2是重要的。orf2编码蛋白(cap)的两个抗原表位分别位于所编码的氨基酸的69-83处和117-131处。

pmws是最早被认识和确认的由pcv2感染所致的疾病。常见的pmws主要发生在5～16周龄的猪，最常见于6～8周龄的猪，极少感染乳猪。一般于断奶后2～3天或1周开始发病，急性发病猪群中，病死率可达10％。虽然致死率不高，但常常由于pcv2感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，使圆环病毒与猪的许多疾病混合感染。最常见的混合感染有prrsv、prv(伪狂犬病毒)、ppv(细小病毒)、肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、pedv(流行性腹泻病毒)、sⅳ(猪流感病毒)，有的呈二重感染或三重感染，其病猪的病死率也将大大提高，有的可达25％～40％。血清学调查表明，pcv在世界范围内流行，危害当今养猪业。因此，建立快速检测猪圆环2型病毒方法具有重大意义。

人们通过多种方法检测猪圆环2型病毒(pcv2)，如血清学检测方法，分子生物学技术，限制性核酸内切酶分析等，其中分子生物学技术具有特异性强、灵敏度高等优点越来越被人们重视和发展。然而，这些技术对精密设备高度依赖，尤其是荧光定量pcr仪，使其主要集中在实验室内使用，未能帮助医务人员真正在现场实现猪圆环2型病毒(pcv2)的快速检测。此外，由于荧光定量pcr仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量pcr难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。

综上，本发明针对现有猪圆环2型病毒检测的缺陷及市场需求，开发出一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。本发明通过btnaa(bodytemperaturenucleicacidamplification，体温核酸扩增)，在常温恒温下，通常在30min内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。本发明相比传统pcr法更为便捷、快速，在没有实验室条件的养猪场、屠宰场、资源匮乏的边远地区也能，做到对猪圆环2型病毒进行便捷、快速和精确的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的引物和探针。

本发明的另一目的在于提供一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的试剂。

本发明的再一目的是提供一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的试剂盒。

为了实现本发明的目的之一，本发明采取以下技术方案：

一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的引物和探针，其上下游引物和探针的序列分别如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示，具体如下：

上游引物：aagtggtgggatggttaccatggtgaagaagt；

下游引物：ctgggacagcagttgaggagtaccattcca；

探针：tcttccaatcacgcttctgcattttcccgc(f)(h)ac(b)ttcaaaagttcagc—spacerc3

其中，f为荧光基团，h为四氢呋喃位点，b为猝灭基团，3’末端为spacerc3修饰。

本发明的特异性引物，是针对猪圆环2型病毒cap基因设计的寡核苷酸。由两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30核苷酸(nt)左右，序列碱基排布随机性高；c/g含量30％-70％；扩增产物100-400bp；5’端3-5bp少g，多c/t；3’端c/g结尾；不用考虑tm值；最佳引物对需通过试验优化筛选出，要求是其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

本发明的特异性荧光探针，是针对猪圆环2型病毒cap基因设计的寡核苷酸长链。该特异性荧光探针只专一性识别本发明的特异性引物扩增出来部分猪圆环2型病毒cap基因序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为50nt左右，c/g含量30％-70％；5’端3-5bp少g；共有四个修饰位点，先寻找间隔2-3个碱基的两个t(胸腺嘧啶)，其中靠近5’端的t距5’端要有28-32nt，靠近3’端的t距3’端要有15-18nt.将这间隔的2-3个碱基中的其中一个用四氢呋喃(thf)替换，作为核酸外切酶的识别位点；5’端的t用fam(荧光基团)替换，3’端的t用bhq(淬灭基团)替换；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物素-teg或c3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸。

为了实现本发明的目的之二，本发明采取以下技术方案：

一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的试剂，包含上述引物和探针。

进一步地，所述试剂还包括反应液，所述反应液包括聚乙二醇(peg)、tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶、辅助蛋白和核酸外切酶。

上述反应液经冻干后保存，等温快速检测猪圆环2型病毒时再溶于双蒸水使用。所述冻干条件为：在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时，最后10-18℃干燥1-2小时，两个阶段的干燥时间取决于冻干样品的数量。冻干后的反应液变为干粉状，以减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。

本发明反应液中的5种工程酶：重组酶，单链dna结合蛋白，dna聚合酶，辅助蛋白和核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶。上述5种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、破碎纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白。

优选的，所述重组酶来源于噬菌体或细菌；更优选的，所述重组酶选自t4噬菌体重组酶uvsx或大肠杆菌(e.coli)重组酶reca。

优选的，所述单链dna结合蛋白选自t4或e.coli的gp32。

优选的，所述dna聚合酶选自phi-29聚合酶、枯草芽胞杆菌poli(bsu)、bst聚合酶或e.coli的dna聚合酶iklenow大片段。

优选的，所述辅助蛋白为t4噬菌体uvsy蛋白。

优选的，所述核酸外切酶选自e.coli的核酸外切酶exoiii或exoiv。

进一步地，上述反应液中5种工程酶的浓度分别为：重组酶220-280ng/μl；单链dna结合蛋白200-250ng/μl；dna聚合酶100-150ng/μl；辅助蛋白70-100ng/μl；核酸外切酶80-120ng/μl。

反应液中的其它组分，为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、反应所需能量、扩增所需原料，冻干处理过程和存储阶段中提供保护剂。

进一步地，反应液中各组分浓度为：聚乙二醇(peg)2-4％；tris20-40mm；乙酸钾(kac)100-140mm；酸磷酸腺苷(atp)2-4mm；磷酸肌酸二钠盐(creatinephosphatedisodiumsalt，pcr)40-60mm；脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)250-300μm；蔗糖5-8％；甘油20-40％。

为了实现本发明的目的之三，本发明采取以下技术方案：

一种基于btnaa体系等温快速检测猪圆环2型病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的试剂。

本发明检测方法的工作原理：是模拟细菌胞内核酸的自我复制所研究出的体系，是一种借助多种酶打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体rec/ssdna，在辅助蛋白和单链结合蛋白ssb的帮助下，侵入双链dna模板；在侵入位点形成d-loop区域，并开始对dna双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体rec/ssdna解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，形成新的dna互补链。同时当双链dna被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的dna双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的四氢呋喃位点出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和猝灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，每打开一条dna双链就能释放一个荧光基团，荧光信号强度与合成的dna双链正相关，通过荧光检测仪器可视化。

本发明具有以下技术特点：

(1)反应仪器更为便携：与主要的几种核酸扩增技术相比，btnaa体系扩增过程无需变温，使得反应仪器可以做的更加小更加便捷，适用于更多的非实验室环境。

(2)反应速度更快：相对于荧光定量pcr，btnaa体系扩增反应时间由1.5-2小时缩短至15-25分钟，明显提高了扩增效率。

(3)能够实时监测：通过taqman探针，反应中每打开一条dna双链就能释放一个荧光基团，荧光信号强度与合成的dna双链正相关，通过荧光检测仪器可视化，从而实现实时监测的效果。

(4)定性与定量检测：通过观察荧光曲线是否起峰判断样本中是否有目的核酸；通过荧光曲线起峰的时间可以判断样本中目的核酸的浓度。

(5)特异性高：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确特异性高。

(6)操作简单：本发明反应液冻干保存，使用时只需按在干粉中加入规定的ddh2o、peg、mgac和待测样本核酸，混匀后即可启动扩增反应，适合于基层检测机构的推广。

(7)结果检测方法多：既可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，也可以通过荧光仪器进行检测。

附图说明

图1是引物对扩增效果影响的电泳图(m为marker，1、2为引物pcv2-1-1，3、4为pcv2-1-2，5、6为pcv2-1-3，n为阴性对照)。

图2是扩增反应灵敏度电泳图(m为marker，1-6引物为pcv2-1-2；1、2浓度为100fg/μl，3、4浓度为10fg/μl，5、6浓度为1fg/μl，n为阴性对照。7-12引物为pcv2-1-3；7、8浓度为100fg/μl，9、10浓度为10fg/μl，11、12浓度为1fg/μl，n为阴性对照，本发明的浓度指模板浓度，是根据pcv2病毒部分序列合成的质粒模板的浓度)。

图3是荧光探针结构图。

图4是探针对扩增效果影响的荧光图(target1、2、3引物均为pcv2-1-2，target1探针为pcv2-probe-1，target2探针为pcv2-probe-2，target3探针为pcv2-probe-3)。

图5是扩增反应灵敏度荧光图(sample1、2、3、4引物均为pcv2-1-2，探针均为pcv2-probe-1；sample1模板浓度为100fg/μl，sample2模板浓度为10fg/μl，sample3模板浓度为1fg/μl。sample4为阴性对照)。

图6是反应原理图。

图7是采用不同方法提取实际样本核酸进行检测的荧光图。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

一、引物的筛选

参考genbank上已公布的猪圆环2型病毒衣壳蛋白基因(capsidprotein，cap)序列，本申请发明人对猪圆环2型病毒衣壳蛋白(capsidprotein，cap)的基因组、蛋白结构与功能等信息进行了较为深入的研究，而且在猪圆环2型病毒中衣壳蛋白基因(capsidprotein，cap)的含量较高，本发明选择猪圆环2型病毒衣壳蛋白基因(capsidprotein，cap)作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对猪圆环2型病毒衣壳蛋白基因(capsidprotein，cap)初步设计了三对不同的引物：pcv2-1-1、pcv2-1-2和pcv2-1-3(如表1所示)，这些序列可以和猪圆环2型病毒衣壳蛋白基因(capsidprotein，cap)的相应序列特异性结合。

表1引物的序列及对应的目的片段大小

图1是引物对扩增效果影响的电泳图谱。从图1上可以看出，不同的引物对扩增效果是有影响的，使用引物pcv2-1-1进行dna扩增实验时条带亮度明显弱于pcv2-1-2、pcv2-1-3，阴性对照n无条带，说明体系无污染。因此，引物pcv2-1-1不符合要求，也不利于进一步的荧光检测。

为了选择更好的引物进行荧光检测。分别针对引物pcv2-1-2和pcv2-1-3进行模板梯度稀释的灵敏度试验。dna扩增灵敏度实验的电泳图谱如图2所示。从图2上可以看出，在较低模板浓度时，引物pcv2-1-2扩增的目标条带比引物pcv2-1-3的亮度高，也就是说使用引物pcv2-1-2进行猪圆环2型病毒cap基因扩增试验的灵敏度更高。模板浓度是根据pcv2病毒部分序列合成的质粒模板的浓度

根据上述的实验结果，选择引物pcv2-1-2作为荧光检测实验的引物。

二、探针的筛选

不同的探针对恒温扩增的灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对引物pcv2-1-2设计了三对不同的探针，探针示意图图3所示：pcv2-probe-1、pcv2-probe-2和pcv2-probe-3(如表2所示)，这些探针可以与引物pcv2-1-2的扩增产物相应序列特异性结合，经酶切发出荧光信号。

表2探针的序列

*f为荧光基团(fluorophore)，h为四氢呋喃位点(thfresidue)，b为猝灭基团(quencher)，3’末端为spacerc3修饰

图4是探针对扩增效果影响的荧光图。从图4可以看出在相同的引物条件下使用不同的探针对扩增的结果有影响，探针pcv2-probe-1荧光曲线起峰时间更早，曲线的峰值更高，意味着有更高的灵敏度。接着为了研究最优引物加最优探针的极限检测浓度，针对该最优组合进行灵敏度实验。图5是扩增反应灵敏度荧光图。从图5可以看出，引物pcv2-1-2与探针pcv2-probe-1的极限检测浓度为1fg/μl。

三、对猪圆环2型病毒进行特异性检测的方法

将聚乙二醇(peg)、tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶、辅助蛋白和核酸外切酶组成的反应液进行冷冻干燥。冻干条件为：在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时，最后10-18℃干燥1-2小时。得到冻干粉，待用。

冻干粉各组分浓度如表3所示。

表3冻干粉反应单元组分

本发明检测具体步骤为：

(1)将上述冻干粉，加入ddh2o28.4μl；聚乙二醇(peg)12.5μl；醋酸镁2.5μl；样本2μl；上下游引物各2μl；探针0.6μl。

(2)将步骤(1)中的试剂混匀，离心。

(3)将混匀离心后的混合物放入带温控功能的荧光仪器中，设定温度为37℃；每20秒检测一次荧光信号强度，共检测60次，共20min。

(4)反应完成后，根据荧光强度曲线判断样本是否为阳性。

本发明的检测原理如图6所示，是模拟细菌胞内核酸的自我复制所研究出的体系，是一种借助多种酶打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体rec/ssdna，在辅助蛋白和单链结合蛋白ssb的帮助下，侵入双链dna模板；在侵入位点形成d-loop区域，并开始对dna双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体rec/ssdna解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，形成新的dna互补链。同时当双链dna被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的dna双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的四氢呋喃位点出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和猝灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，每打开一条dna双链就能释放一个荧光基团，荧光信号强度与合成的dna双链正相关，通过荧光检测仪器可视化。

四、提取方式不同对猪圆环2型病毒检测的影响

猪圆环2型病毒实际样本来源于患猪圆环2型病毒的猪肉。取四份1/3黄豆大小实际样本编号1、2、3、4，其中1、2号采用自制裂解液nl1，在实际样本中加入1ml匠神生物血液/细胞/组织基因组dna快速提取试剂盒中的裂解液常温下裂解10min，取5μl反应后的混合物用ddh2o稀释至10^-3。3、4号由天根的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒提取，最后用80μl洗脱液洗脱dna，用ddh2o稀释至10^-3。使用btnaa体系以及本发明中的引物pcv2-1-2与探针pcv2-probe-1对4个样本进行检测。图7是采用不同方法提取实际样本核酸进行检测的荧光图。通过图7可以看出，利用本发明的btnaa体系以及针对猪圆环2型病毒cap基因设计的特异性引物和探针可以对实际样本中的猪圆环2型病毒进行检测。同时自制裂解液nl1可顺利提取患猪圆环2型病毒的猪肉中的猪圆环2型病毒核酸，与试剂盒提取的差异不大，并且不需要高速离心机，离心柱等条件；反应时间也仅需10min，与本发明配套使用，极大程度的提高了便携型，也大大缩短了检测所需的时间。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110>宁波匠神生物科技有限公司

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