快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法及所用的分子标记与流程

本发明涉及快速检测翘嘴红鲌快速生长相关的分子标记及其用途。

背景技术：

分子遗传标记是一种以dna多态性为基础的遗传标记，可以反映出生物个体在dna水平上的差异。它很普遍存在于所有的生物中而且数量非常丰富，不会受外界环境干扰影响。.目前主要应用于水产动物的dna标记技术有：限制性片段长度多态性标记(restrictionfragmentlengthpolymorphism,rflp)、随机扩增多态性dna(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)、简单序列重复(simplesequencerepeat,ssr)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,rflp)和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snps)等技术。

单核甘酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snps)是人类和动物基因组中普遍存在的一种分子标记。主要是指在基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的dna序列的多态性。它是可遗传的变异中一种最常见的变异。最早在1994年，lander学者第一次提出snp可以作为新一代分子标记，随后wagner等便利用3241个snps标记成功构建了人类第一张snps遗传。snp具有以下特点：数量多基因组覆盖率高，呈二态性且具有代表性、遗传稳定性强，易实现自动化分析。

关于snp在水产动物遗传育种中的应用：近年来，国内外很多学者通过候选基因法发现与动物生长性状相关的spns位点的研究并且取得不错的成效。张世勇等人在斑点叉尾(鮰)mstn基因4个snp位点及其与生长性状的相关性中研究得出mstn基因,4355c>g位点的多态性与斑点叉尾(鮰)生长性状显著相关。tao等采用pcr-rflp技术对10个候选基因的snps筛选，结果发现部分snps位点与北极嘉鱼的早期生长速率存在明显的相关性。以上这些研究都都是候选基因法寻找与生长性状相关的snp位点十分可行，且成效明显的有力证据。

随着生物科技的不断发展，snp作为新一代分子标记，已被应用于各个物种中。snp在构建高密度遗传连锁图谱的构建、群体遗传结构、关联性分析。系统发育分析、品种资源鉴定等方面均表现十分广阔的应用前景。

翘嘴红鲌(erythroculterilishaeformis)，隶属于鲤形目、鲤科、鲌亚科，体型较大，是大型淡水经济鱼类鳊鲌亚科中最大的一种鱼。其肉质鲜美，鳞下富含脂肪，在我国江浙沪市场价格比较高，且需求量大。开展翘嘴红鲌的品种选育工作，选育出具有较快生长速度的翘嘴红鲌品种，具有重要的现实意义。目前国内对翘嘴红鲌的研究主要存在养殖技术方面，其分子相关研究较少，分子育种被认为是最有效率的育种方法，现有的est数据库数据有限，所以开展翘嘴红鲌生长性状相关功能基因克隆及snp位点筛选的工作极为重要。

因此，建立一种快递灵敏、经济检测翘嘴红鲌优良生长性状的方法对开展翘嘴红鲌的品种选育具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可以简便快速筛选生长速度快的翘嘴红鲌的方法和所用分子标记，本发明首次利用dna的多态性，通过pcr的方法，对翘嘴红鲌dna进行快速检测验证。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种翘嘴红鲌快速生长相关的分子标记，分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，

rlib(f)cggttcgcttggattttcggactga

rlib(r)aagatgtataaagacgattcctgtt。

本发明还同时提供了利用上述分子标记进行的快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法，包括如下步骤：

1)、将待测翘嘴红鲌的dna作为下述pcr扩增步骤的模板；

2)、pcr扩增

pcr反应体系如下：

pcr反应体系如下：

pcr反应程序如下：

pcr反应程序如下：

注：72℃条件下延伸10s后pcr反应结束，使pcr产物处于4℃环境下；

3)、将上述步骤2)所得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对其进行测序：

在440bp产生t/c转变，判定该翘嘴红鲌生长速度快(较快)；

在440bp仍然为c(即，未发生t/c转变)，判定该翘嘴红鲌生长速度一般(即，为常规生长速度)。

作为本发明的快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法的改进：

判定为生长速度快的翘嘴红鲌的dna序列为：

tgtcgatcaaaattttacatataaatgtcttctttatgtctgtagtgtatttgattttgtg

判定为生长速度一般的翘嘴红鲌的dna序列为：

tgtcgatcaaaattttacatataaatgtctcctttatgtctgtagtgtatttgattttgtg。

作为本发明的快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法的进一步改进：

所述步骤3)中，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果为能在500bp±20bp产生特异条带时，再对其进行测序。

snp标记具有如下优势：1)、数量多，分布广：snp标记在基因组的密度比其他任何的分子标记都要高，在人基因组中覆盖率高达千分之一，在部分物种基因组中覆盖率甚至更高；2)、呈二态性，遗传稳定性高：snp标记是双等位的分子标记，误读和错配的几率很小；3)、突变率低：由于生物体内各种生理活动都有精密的调控机制，生物体中碱基的突变率极低，尤其是处于编码区的位点突变率更低；4)、成本低：随着高通量技术的不断创新与发展，snp的自动化分析变得异常便捷，成本也逐渐降低。

综上所述，本发明是在翘嘴鲌中首次发现该分子标记，且具有高度多态性，与翘嘴红鲌生长性状指标，有显著性相关。可以作为选育快速生长翘嘴红鲌的分子标记。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为对所得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳跑胶图(最佳引物f/r温度梯度电泳跑胶图)。

图2为在最佳温度(55℃)下的样品pcr扩增产物跑胶图，由图2可得，在最佳温度下，条带都很清晰，证明样品具有良好的特异性。

图3为用dnastar7.0green软件观察得到的测序结果峰图(翘嘴红鲌mstn-1基因snps位点筛选峰图)，即可证明存在snp位点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、运用pcr方法检测

1.dna提取

剪取翘嘴红鲌(144日龄)少量尾鳍，用天根基因组dna提取试剂盒提取dna，基因组dna先经1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，再用drop2000紫外分光光度计检测其浓度≥500ng/ul(可以作为模板使用)，保存于-20℃冰箱。

2.pcr扩目的片段

引物fcggttcgcttggattttcggactga

raagatgtataaagacgattcctgtt。

pcr反应体系如下：

pcr反应程序如下：

将所得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果如图1所述，当退火温度为55.6℃，引物特异性的效果最佳；由于仪器精确度为1，因此最终将退火温度设为55℃。

在设定的55℃退火温度下，对样品重新进行pcr扩增，再将所得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所述。

对目的片段(即，满足大小约为500bp的片段)进行切胶回收，并进行测序。测序结果用dnastar7.0green观察峰图。结果如图3所示。

图3上代表生长速度一般的翘嘴红鲌mstn-1基因突变位点c-c；

图3下代表生长速度较快的翘嘴红鲌mstn-1基因突变位点c-t；

即，判定为生长速度快的翘嘴红鲌的dna序列为：

tgtcgatcaaaattttacatataaatgtcttctttatgtctgtagtgtatttgattttgtg

判定为生长速度一般的翘嘴红鲌的dna序列为：

tgtcgatcaaaattttacatataaatgtctcctttatgtctgtagtgtatttgattttgtg。

验证实验：将上述判定为生长速度快的翘嘴红鲌(144日龄)、以及判定为生长速度一般的翘嘴红鲌(144日龄)按照常规的无公害翘嘴红鲌养殖技术规范法(可参照《浙江省地方标准db33》的无公害翘嘴红鲌养殖技术规范法)进行饲养。所得结果如表1所示。

表1

本发明对上述方法对翘嘴红鲌进行了至少5次的重复性实验，结果发现：判定成生长速度较快的翘嘴红鲌的日增重，均为判定成生长速度一般的翘嘴红鲌的日增重的1.1～1.15倍。

对比例1、将分子标记引物改成如下表2所述，其余等同于实施例1；所得结果如表2所述。

表2

综上，本发明的分子标记的引物为特意性最佳引物，且目的片段在600bp以内，便于寻找突变位点。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江师范大学

<120>快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法及所用的分子标记

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cggttcgcttggattttcggactga25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aagatgtataaagacgattcctgtt25