一种控制稻类小粒和半矮秆的基因及其应用的制作方法

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及到一种控制水稻小粒和半矮秆的基因及其应用。

背景技术：

水稻的谷粒大小是一个典型的数量性状和重要的经济性状，该性状形成受亲源效应、植物激素信号途径、g蛋白等各种遗传信号和调节途径的控制和影响。水稻种子主要由胚、胚乳、果皮、种皮和颖壳构成。其中，处于内部的胚乳提供用于人类食用的部分；处于外部的颖壳一方面为种子提供保护，另一方面也被认为是限制籽粒生长的容器，对粒形的调控起到重要的作用。颖壳的大小取决于颖壳细胞，主要通过细胞分裂和细胞增大两种方式来协调控制。在颖壳发育早期，颖壳细胞通过广泛的细胞分裂来增加数量；随后，细胞分裂速度减缓并开始通过细胞扩张来增大细胞；最终由籽粒颖壳不同维度上的细胞数量和细胞大小决定粒长、粒宽和粒厚的表型。

水稻粒重与粒形是水稻产量构成的关键因素，一般以粒长、粒宽、粒厚和长宽比等粒形性状进行衡量。水稻粒重/粒形是典型的数量性状，受多基因控制，通常以qtl(quantitativetraitlocus)研究方法进行遗传分析。目前，已经鉴定水稻粒重/粒形的qtl有超过四百个，在水稻基因组的任一条染色体上皆有分布(www.gramene.com)。粒形性状具有很高的遗传率，其在不同的遗传背景和环境中的稳定表现对品种遗传改良具有重要意义。近十多年来，控制水稻粒形性状的基因/qtl的克隆与功能研究取得了重要进展，目前已有16个控制水稻粒形和粒重的qtl被分子克隆和功能解析，但除了少量的qtl/基因外，绝大多数调控水稻粒形和粒重的qtl，尚处在初步研究阶段。因此，亟需加强对控制该性状的qtl克隆和对其候选基因的功能解析。本发明利用图位克隆的方法分离克隆一个控制水稻小粒半矮秆的基因tgw5，为水稻改良育种提供重要的基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种控制作物粒形和株高的基因及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种分离的控制水稻小粒半矮秆的多肽，该蛋白选自下组：

(1)具有seqidno:2氨基酸序列的多肽；或

(2)将seqidno:2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的多肽。

本发明的第二方面，提供了一种分离的控制水稻小粒半矮秆的多肽，该蛋白选自下组：

(1)具有seqidno:4氨基酸序列的多肽；或

(2)将seqidno:4氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的多肽。

本发明的第三方面，提供了一种分离的控制水稻小粒半矮秆的多肽，该蛋白选自下组：

(1)具有seqidno:6氨基酸序列的多肽；或

(2)将seqidno:6氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的多肽。

本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：

(a)编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno:1所示的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：

(a)编码本发明第二方面所述多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno:3所示的多核苷酸。

本发明的第六方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：

(a)编码本发明第三方面所述多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno:5所示的多核苷酸。

本发明的第七方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：

(a)转录本发明第四、五和六方面所述多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno:7所示的多核苷酸。

本发明的第八方面，提供了一种改良作物(更优选的，为选育小粒半矮秆水稻品系)的方法，该方法包括：

(ⅰ)改良水稻的籽粒性状；

(ⅱ)调节水稻株高。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了水稻tgw5互补转基因植株与受体品种“fh212”的株高和粒形比较。

图2显示了利用crispr技术获得tgw5突变体植株与受体品种“c815s”的株高和粒形比较。

图3显示了利用分子标记辅助选择导入tgw5基因的改良植株的株高和粒形与受体品种“武香s”的比较。

具体实施方式

本发明人经深入广泛的研究，首次发现了一种控制作物粒形和粒重的新基因，该基因的功能降低或缺失可缩小粒形和降低株高。研究证实tgw5基因的单碱基突变和基因敲除可使粒形显著变小和株高降低。表明tgw5基因在选育小粒作物品系中有广泛的应用前景。

术语

本发明所述的“作物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等。

本发明所述的“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化。

本发明所述的“分离的tgw5蛋白或多肽”是指所述的tgw5蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白。

本发明所述的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽包括天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主中产生。

本发明所述的“长粒”、“大粒”可以互换使用。

本发明所述的“tgw5蛋白”指具有tgw5蛋白活性的seqidno：2序列的多肽。

本发明还提供了编码tgw5蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括：dna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区可以与seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5和seqidno：7所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

本发明还涉及tgw5基因的分子标记选择技术在农作物小粒不育系选育中的应用。

本发明以恢12-29(大粒品种)和fh212(小粒品种)杂交构建遗传群体，应用qtl-seq定位技术定位了一个位于第5染色体的控制水稻粒长和粒重的基因tgw5，并且通过图位克隆技术克隆了该基因。

本发明的主要优点在于：

(1)首次分离得到一种新的水稻小粒基因，改变该基因的转录翻译或敲除该基因可使作物(如水稻)的籽粒变小，株秆变矮。

(2)本发明的水稻小粒基因tgw5可以作为控制作物籽粒大小和株高的一个基因，应用于农作物品种的改良。

实施例1水稻小粒半矮秆基因tgw5的获得

恢12-29是较大粒水稻品种，而fh212为小粒水稻品种。本发明人以恢12-29与fh212杂交构建遗传群体，利用qtl-seq分析方法定位了一个控制水稻粒形和株高的新基因(或qtl)tgw5，该基因位于第5染色体上。进一步利用图位克隆技术克隆了该基因，基因序列如seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5和seqidno：7所示，编码的蛋白如seqidno：2、seqidno：4和seqidno：6所示。

实施例2tgw5水稻转基因实验

遗传转化验证tgw5控制水稻粒形和株高。本实施例采用来源于植物表达载体pcambia1301作为水稻转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(kan^r)、潮霉素抗性基因(hyg^r)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、双camv35s启动子、nos基因的终止信号序列以及限制性内切酶多克隆位点(mcs)。在限制性内切酶多克隆位点处可以正向或者反向插入tgw5的dna序列构建转基因载体。

1.tgw5互补转基因质粒构建

在本实施例中，以来自于大粒品种恢12-29的基因组dna作为模板，使用高保真酶kodfxneo(toyobo)扩增恢12-29中tgw5基因序列，扩增片段以1％琼脂凝胶电泳后胶回收。胶回收片段通过平末端连接的方式克隆到中间载体peasy-blunt3载体上，并对多个重组子进行测序，验证序列的正确性。pcr扩增引物序列：

5’端寡核苷酸引物序列为：5’-ccggaattccaaaccccgttaaagcc-3’

3’端寡核苷酸引物序列为：5’-atagggtacagacctgaacagc-3’

用ecori和hindiii限制性内切酶消化tgw5-peasy-blunt3和pcambia1301载体,将tgw5-peasy-blunt3消化后的目的片段连接到最终载体pcambia1301的ecori和hindiii酶切位点中。连接产物转化大肠杆菌菌株t1，在还有kan(50μg/ml)的lb培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用m13通用引物对该克隆进行测序检测目标片段序列是否正确。如此成功构建tgw5互补转基因质粒。

2.tgw5转化水稻

tgw5互补转基因质粒通过冻融法导入农杆菌菌株eha105。每200μleha105感受态细胞与0.5-1μg(约10μl)质粒dna混匀，依次在冰上、液氮中和37℃水浴中各放置5分种：用新鲜的yeb液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布与含抗生素kan(50μg/ml)的yeb平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含有抗生素的yeb平板上划单菌，连续划3次。从yeb平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的ab液体培养基中，200rpm继续振摇培养至od600为0.6-0.8左右，将新鲜的农杆菌菌液于500rpm、4℃离心5分种，收集并重悬于1/3体积的aam液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化fh212的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的fh212未成熟种子经70％乙醇浸泡1分种后，于naclo溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温200)消毒90分种以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种于n6d2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的aam农杆菌菌液中并不时摇动，20分种后将水稻材料移出，在无菌纸上吸去过多的菌液，随即转移到n6d2c培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌vir基因活化物，使用浓度为100μmol/l。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基n6d2s1(hyg25㎎/l),进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转移到n6d2s2(hyg50㎎/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生小苗在1/2ms0培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。

实施例3水稻tgw5互补转基因植株与野生型的谷粒大小和株高比较

如实施例2所述的方法获得水稻tgw5互补转基因植株，观察野生型fh212和转基因水稻粒形和株高的表型，分析tgw5基因对谷粒大小和株高的影响。结果如图1所示，水稻tgw5互补转基因植株(c5)与对照fh212相比，谷粒明显变大，株高显著增加。

实施例4利用crispr技术获得tgw5突变体

1、分析tgw5基因序列，利用cripsr-ptool(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计sgrna靶标位点，靶标序列：

靶标序列：5’-aaagaggtggagaggtatatagg-3’

2、经过引物变性、退火，得到grna片段，酶切连接获得重组质粒，转化大肠杆菌置37℃恒温培养箱，过夜培养，挑选单克隆，抽提质粒鉴定。

3、把抽提的质粒送2个单克隆，测序鉴定

4、鉴定正确的质粒酶切连接至表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂布于lb固体培养基过夜培养，挑选单克隆，提取质粒鉴定。

5、鉴定正确的质粒载体，采用农杆菌(eha105)侵染法侵染c815s的愈伤，获得转基因植株。

6、从t0代转基因植株上采摘幼嫩的叶片，利用ctab法提取植物组织dna。

7、利用primer5软件设计包含靶标位点的引物，利用pcr技术获得tgw5片段，引物序列：

5’端核苷酸引物序列tgw5-341(+):5’-ccatttcccgtcatttctta-3’

3’端核苷酸引物序列tgw5-417(-):5’-ttccttggtctccatcattc-3’

8、1％琼脂糖凝胶电泳，挑选目标条带切胶回收，送往公司测序。

9、利用网站dsdecode(http://dsdecode.scgene.com/home/)对测序结果进行分析。

10、结果显示获得2株tgw5突变体c65和c70。

c65和c70突变株和野生型(control)的目标序列相比：

野生型：cctcctacatcatacaacctatatacctctccacctcttt

j22：cctcctacatcatacaacct―――tacctctccacctcttt

j42：cctcctacatcatacaacctata――cctctccacctcttt

实施例5水稻tgw5突变体转基因植株与野生型植株的谷粒大小比较

如实施例4所述的方法获得水稻tgw5基因敲除植株，观察水稻粒形和株高表型，分析tgw5基因对谷粒大小和株高的影响。结果如图2所示，水稻tgw5基因敲除的转基因植株(j22)的谷粒明显比受体水稻品种c815s小，株高也极显著降低。

实施例6tgw5基因的分子标记辅助选择育种

本实施例中在tgw5基因内设计pcr寡核苷酸引物(seqidno：8和seqidno：9)，用taq酶进行pcr扩增大粒品种武香s和小粒品种fh212的dna，扩增产生的片段用限制性内切酶aluⅰ酶切，经过2.5％琼脂糖凝胶电泳检测出大粒品种和小粒品种之间存在dna多态性(差异)，大粒品种分子量286bp,小粒品种314bp,因此该对引物发展成特异性鉴别大粒tgw5基因和小粒tgw5基因的分子标记。结果如图3所示，在大粒品种武香s与小粒品种fh212的杂交后代群体中苗期用该分子标记可以快速地将携带小粒基因的个体挑选出，培育小粒水稻新品系(xs1)。

tgw5基因特异分子标记的引物序列：

5’端寡核甘酸引物序列为：

5’－agagttcttttgctccttcatatagtagc－3’(seqidno：8)；

3’端寡核苷酸引物序列为：

5’－tccgtacgccgctagttagtc－3’(seqidno：9)。