一种具有多粘菌素抗性的蛋白质、基因、基因扩增引物、载体、细胞及应用的制作方法

本发明属于基因工程和医药研究技术领域，具体涉及一种具有多粘菌素抗性的蛋白质、基因、基因扩增引物、载体、细胞及应用。

背景技术：

粘菌素(colistin)，别名多粘菌素e、polymyxine。是抗菌谱药，对绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌，以及嗜血杆菌、肠杆菌属、沙门菌、志贺菌、百日咳杆菌、巴斯德菌和弧菌等革兰阴性菌有抗菌作用。

细菌耐药性是严重影响人类健康的问题之一。耐药基因作为细菌耐药的物质基础，近年来成为人们关注的热点。多粘菌素被认为是治疗ndm-1等超级耐药菌的最后一道防线。过去，研究者们对耐多粘菌素的机制报道主要集中在，染色体编码的调节系统(pmrab，phopq，mgrb等)基因的突变。随着2015年12月，我国科学家首次报道，由质粒携带的全新的多粘菌素抗性基因mcr-1，引起了全球关注。随后在世界范围内，相继报道了类似的基因mcr-1，mcr-2，mcr-3。

技术实现要素：

本发明的目的在于研究并发现新的粘菌素抗性蛋白、基因。

本发明提供了一种具有多粘菌素抗性的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供了编码上述蛋白质的基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明提供了上述基因的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示；下游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供了包含上述基因的重组载体。

优选的，所述重组载体的基础载体为pet28a。

本发明提供了包含上述重组载体的重组细胞。

优选的，所述重组细胞的宿主细胞为bl21感受态细胞。

本发明还提供了上述蛋白质、基因、基因扩增引物对、重组载体或重组细胞在制备多粘菌素抗性检验试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒以上述蛋白质为标准品。

有益效果：本发明提供了一种具有多粘菌素抗性的蛋白质、基因、基因的扩增引物、载体、细胞及应用。本发明所述具有多粘菌素抗性的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.1所示。研究发现，该蛋白具有多粘菌素抗性，将具有合成该蛋白功能的基因导入表达载体，并在细胞中表达，发现携带有表达载体的细胞也具有多粘菌素抗性。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤(二)所述pcr扩增产物的电泳结果；

图2为本发明实施例1步骤(二)所述电泳回收产物dna的电泳验证结果；

图3为本发明实施例1步骤(三)所述载体质粒dna的电泳验证结果。

具体实施方式

本发明提供了一种具有多粘菌素抗性的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.1所示。研究发现，该蛋白具有多粘菌素抗性。

本发明还提供了上述蛋白质的编码基因。所述编码基因的核苷酸序列优选如seqidno.2所示。在本发明中，seqidno.2所示核苷酸序列的基因取自一株分离自水环境中的具有多粘菌素抗性的大肠杆菌e.coli.。本发明对所述基因的获取方法不作特别限定，采用本领域常规的方法如人工合成、pcr扩增等均可。当采用pcr扩增时，pcr用引物对的上游引物核苷酸序列优选如seqidno.3所示，下游引物核苷酸序列优选如seqidno.4所示。

得到上述基因后，本发明优选将上述基因导入表达载体中，得到重组载体。在本发明中，所述重组重组载体的基础载体优选为pet28a。所述导入过程优选使用ncoi和xhoi对所述基础载体和目标基因进行双酶切。在本发明中，所述导入优选采用同源重组的方法。所述同源重组优选采用20μl体系，所述20μl体系优选包括2μlexnaseii、50-200ngvector、50-200ng插入片段dna、4ul5×缓冲液，去离子水补足20μl。所述同源重组的程序优选为：37℃，30min，0℃(冰水浴)，5min。

得到重组载体后，本发明优选将所述重组载体导入到宿主细胞中，得到重组细胞。在本发明中，所述宿主细胞优选为bl21感受态细胞。本发明对所述重组细胞的构建方法不作特别限定，本领域常规操作均可。本发明优选对构建成功的重组细胞进行验证，所述验证优选使用最小抑菌浓度(2μg/ml)的多粘菌素进行。

本发明还提供了上述蛋白质、基因、基因扩增引物对、重组载体或重组细胞在制备多粘菌素抗性检验试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒以上述蛋白质为标准品。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(一)细菌dna的提取。

1)本发明从水环境中分离得到具有多粘菌素抗性的大肠杆菌e.coli.(含有seqidno.2所示核苷酸序列)后，将该细菌置于甘油中保存。本发明使用接种环，将该细菌接种至无菌的lb培养液中，37℃恒温摇床150r/min过夜培养12h；

2)使用天根生化科技(北京)有限公司，细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)；

3)取细菌培养液1～5ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。向菌体沉淀中加入200μl缓冲液ga，振荡至菌体彻底悬浮。

4)向管中加入20μlproteinasek溶液，混匀。

5)加入220μl缓冲液gb，振荡15sec，70℃放置10min，待溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

9)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。

10)重复上一操作步骤；

11)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。

12)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液te，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

(二)目标片段通过pcr扩增获取。

使用宝生物工程(大连)有限公司pyrobest^tmdnapolymerase(r005q)。

1)反应体系(50μl)如下：

其中，primerf的核苷酸序列为：

aactttaagaaggagatataccatggcaatcaatccttctgc(seqidno.3)；

primerr的核苷酸序列为：

gtggtggtggtgctcgagttaagcgtcggtaccaaa(seqidno.4)。

2)反应条件：

pcr产物dna的电泳(100ev，40min)结果如图1所示，图1中从左到右依次是dl2000marker和样品。

3)切胶回收(选857bp左右条带)，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根dp209)：

①柱平衡步骤：向吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

②将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

③向胶块中加入等倍体积溶液pn(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlpn溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

④将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。吸附柱容积为800μl，样品体积大于800μl分批加入。

⑤向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。

⑥重复操作步骤⑤。

⑦将吸附柱ca2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱ca2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

⑧将吸附柱ca2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液eb，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集dna溶液。

4)回收产物dna电泳验证。

回收产物dna电泳(100ev，40min)验证结果如图2所示，图2中从左到右依次是dl2000marker和样品。

(三)目标片段通过克隆获取

1)37℃、4h孵育分别对目的基因和载体双酶切。

酶切体系(20μl)如下：

2)使用t4dna连接酶，16℃过夜连接目的基因和载体。

连接体系(20μl)如下：

3)载体质粒dna电泳验证。

载体质粒dna电泳(100ev，40min)验证结果如图3所示，图3中从左到右分别是z1，z2，z3，z4。据图可知，z3组获得的载体质粒连接情况良好，因此选择z3作为载体质粒进行克隆。

4)将克隆载体转化大肠埃希菌bl21感受态细胞。

①取100μl冰浴上融化的bl21感受态细胞，加入目的dna，轻轻混匀，冰上静置30min。

②42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置3min。

③向离心管中加入500μl不含抗生素的培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h。

④根据实验需要，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含氨苄抗生素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

5)每板挑取适当单克隆，加入1ml含氨苄抗生素的lb培养基，200rpm培养16h，测序。

6)经过序列比对：克隆细菌的基因序列与pcr产物序列100％一致。

(四)挑取单克隆，检测最小抑菌浓度mic。

药敏实验方法参照美国临床实验室标准化委员会(clsi)推荐的mueller-hinton微量肉汤稀释法，分别测定抗生素对细菌的最小抑菌浓度(mic)。

无菌96孔板中每孔加入灭菌mh肉汤100μl。a1孔加入100μl512μg/ml的多粘菌素(polymyxine，生工生物工程(上海)股份有限公司，cas[1264-72-8])，用移液枪吹打混匀，吸取100μl至a2孔，重复上述操作至a12孔。a12孔取100μl弃去。b1-12，c1-12为重复，共三个平行试验。此时每孔药物浓度每排从左至右分别为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μg/ml。再分别在各孔加入稀释好的菌液100μl。最终每孔药物浓度每排从左至右分别为128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06μg/ml。d排只加200μlmh肉汤做阴性对照，e排只加200μl菌悬液做阳性对照。加样完毕后将96孔板置于带有湿润纱布的灭菌搪瓷盘中，37℃恒温箱培养16-24h后，使用酶标仪在λ＝640读取各孔吸光度值。90％的mic值计算公式如下所示：

mic结果表明：阳性对照组细菌生长正常，阴性对照组无细菌生长；转化前不携带重组质粒的大肠埃希菌bl21，不能在含有多粘菌素抗生素的mh肉汤；经过转化携带重组质粒的大肠埃希菌bl21，多粘菌素mic为2μg/ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120>一种具有多粘菌素抗性的蛋白质、基因、基因扩增引物、载体、细胞及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>285

<212>prt

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>1

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151015

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<212>dna

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>2

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<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aactttaagaaggagatataccatggcaatcaatccttctgc42

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtggtggtggtgctcgagttaagcgtcggtaccaaa36