一种新型人血清白蛋白黏附肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种新型人血清白蛋白黏附肽及其应用。

背景技术：

人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)是生命体血浆中含量最丰富的蛋白质，承担着体内各种贮存和运输工作。在人体内的半衰期可达19天，它是人体血浆中主要的运输载体。把药物肽或者蛋白直接偶联到hsa上，或者利用能够与hsa特异结合的多肽与蛋白药物融合来延长药物肽或者蛋白药物在体内的半衰期，是一种重要的延长分子药物体内半衰期的研究策略。

不仅血清白蛋白融合技术能够有效延长蛋白质药物的半衰期，而且与血清白蛋白黏附也是蛋白质药物长效化的新策略。

将一段可黏附hsa的小肽或蛋白质与细胞因子、抗体、抗原等连接，其在血浆中特异性结合hsa形成一个较大的分子，从而使其半衰期延长。

通过与hsa黏附肽(humanserumalbuminbandingpeptide，hsabp)融合的蛋白药物与融合白蛋白的药物想比，其分子量远远小于后者，更有利于药物从血浆扩散到目标组织。对于多肽和蛋白质药物而言，通过基因工程和蛋白质工程使其与hsa黏附不仅可延长药物半衰期，并且可保持其与靶蛋白的结合特性，保证了药物的疗效。

干扰素(interferon，ifn)是人和动物细胞受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等多种因素诱导后，由受体细胞分泌的一类细胞因子。抗病毒活性是干扰素家族的一项基本功能之一。干扰素主要是通过机体细胞来发挥其抗病毒作用，自身并不能杀死或抑制病毒。细胞经病毒感染可诱导ifn的产生和释放，随后被感染细胞死亡及崩解，ifn分子被释放并随血液循环扩散至全身。ifn分子与周围细胞膜上的受体特异性结合，增强细胞膜腺苷酸环化酶的活性，促使环磷腺苷的形成。环磷腺苷增高能够抑制dna的合成、细胞的分裂等，进而抑制病毒的复制。

延长药物体内半衰期，减少给药次数，保持血药浓度平稳，减轻不良反应，同时提高治疗应答率，提高患者治疗依从性，为开发新型长效干扰素的重要发展方向。

通过将人干扰素α-2b(ifnα-2b)融合hsa黏附肽的策略，解决人干扰素a-2b在人体内半衰期短的问题，该技术不仅可延长药物半衰期，并且可保持其与靶蛋白的结合特性，保证了药物的疗效。

有鉴于此特提出本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种新型人血清白蛋白黏附肽及其应用，本发明提供的新型人血清白蛋白黏附肽具有较高的has黏附性，并且该黏附肽作为载体可提高目标蛋白体内半衰期。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种人血清白蛋白黏附肽，所述的人血清白蛋白黏附肽的氨基酸序列选自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3或seqidno:4所示序列中的至少一种。

本发明运用生物信息学的方法，分析has黏附肽的空间结构特征及人血清白蛋白表面电荷等特点，设计出一系列新的多肽分子，用化学合成法进行直接合成，然后测定多肽分子与hsa的亲和力，选出能够结合has且结合力较高的hsa黏附肽。经过以上步骤，我们惊喜的获得了4条具有高结合力的多肽序列。本发明提供的人血清白蛋白黏附肽(has粘附肽)具有较高的has黏附性，并且该黏附肽作为载体可以提高目标蛋白在体内的半衰期。

本发明的第二目的是提供一种编码如上所述的人血清白蛋白黏附肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

本方案中所指的人血清白蛋白黏附肽的核苷酸序列为任意一种可以编码如上所述的任意一种人血清白蛋白黏附肽氨基酸序列的序列。

为了在大肠杆菌中表达上述的人血清白蛋白黏附肽，本发明按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，选择适合的密码子以及密码子组合来编码具有高结合力的多肽序列，从而进一步提高大肠杆菌中has黏附肽的结合力。

进一步的方案，适合大肠杆菌中表达的人血清白蛋白黏附肽的核苷酸序列包括：

编码如seqidno:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:5所示；

和/或，编码如seqidno:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:6所示；

和/或，编码如seqidno:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:7所示；

和/或，编码如seqidno:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:8所示。

本方案可以采用上述四种可以编码人血清白蛋白黏附肽的核苷酸序列的一种或者几种在大肠杆菌中表达使用。本发明经过多次试验，在氨基酸序列不变的前提下，将同一位置的碱基变为与其不同碱基，并将各位置不同的优化方案进行结合，人工合成多条编码has黏附肽的核苷酸序列(在此不一一列出)，构建载体进行表达，结果发现尽管均利用大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，但表达的血清白蛋白黏附肽的结合力也具有差异。本发明经过筛选，获得了适合大肠杆菌表达的hsa黏附肽核苷酸序列。

本发明的第三目的是提供一种载体，所述的载体具有如上所述的一种或者几种核苷酸序列。

本方案中所指的载体可以为表达载体、穿梭载体、整合载体等。

本发明的第四目的是提供一种重组菌或重组细胞，所述的重组菌或重组细胞含有如上所述的一种或者几种核苷酸序列，且能产生如上所述的人血清白蛋白黏附肽的一种或者几种氨基酸序列。

重组菌可以为细菌、可以为真菌，重组细胞可以为病毒，可以为动物细胞等。

优选的，所述的重组菌包括大肠杆菌。

本发明的第五目的是提供一种复合物，所述复合物包括如上所述的人血清白蛋白黏附肽和货物分子；

优选的，所述的人血清白蛋白黏附肽和货物分子相互偶联；

优选的，所述货物分子偶联在人血清白蛋白黏附肽的末端。

本方案中，所述的货物分子为需要以人血清白蛋白黏附肽为载体延长其体内半衰期的大分子，该大分子优选但不局限于具有药物活性的分子、具有标记作用的分子、具有靶向作用的分子中的至少一种。

所述的偶联可以是通过共价键或非共价键的方式进行连接。

本发明的第六目的是一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括如上所述的人血清白蛋白黏附肽和干扰素蛋白，所述的人血清白蛋白黏附肽连接在干扰素蛋白的n端。

本方案将筛选出的人血清白蛋白黏附肽连接到干扰素的n端，构建到载体上表达人血清白蛋白黏附肽-干扰素的融合蛋白，获得的融合蛋白具有干扰素的活性，同时干扰素的体内半衰期也大大延长，可以提高在病毒感染方面的治疗效果。

本发明以筛选出的hsa黏附肽作为载体，将人干扰素α-2b与其融合，制备hsa黏附肽-人干扰素α-2b融合蛋白，具有干扰素的活性，同时可以大大延长人干扰素α-2b的半衰期。

进一步的方案，所述的干扰素蛋白选自α干扰素、β干扰素或γ干扰素及同源类型干扰素；

优选的，干扰素为干扰素α-2b。

本发明的第七目的是提供一种如上所述的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将人血清白蛋白黏附肽的核苷酸序列连接到干扰素核苷酸序列的n端，构建到目标载体上，获得重组载体；

(2)将重组载体转入目标菌株，筛选获得重组菌；

(3)将工程菌进行发酵培养，收集菌体并裂解，纯化获得包括人血清白蛋白黏附肽和干扰素的融合蛋白。

进一步具体的方案包括：

hsa黏附方法延长蛋白质药物半衰期的关键是选择有特异性和高亲和力的hsa黏附肽。其步骤如下：1)根据国内外报道，筛选出一批能特异性结合人血清白蛋白的has黏附肽，运用生物信息学的方法，分析has黏附肽空间结构特征及人血清白蛋白表面电荷等特点，设计出一系列新的多肽分子；2)用化学合成法进行直接合成；3)运用表面等离子体共振技术(surfaceplasmonresonance,spr)测定多肽分子与hsa的亲和力，选出能够结合has且结合力较高的hsa黏附肽。经过以上步骤，我们筛选出了4条多肽序列，分别为hsabp-1，hsabp-3，hsabp-9，hsabp-16。

根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出对应的核苷酸分子，分别对应编码hsabp-1,hsabp-3,hsabp-9,hsabp-16的氨基酸序列。

将筛选出的hsabp分别连接在ifnα-2b的n段，构成融合蛋白(hsabp-x-ifnα-2b)。将hsabp序列与ifnα-2b序列拼接在一起(hsabp-1-ifnα-2b)，构建到我公司原核可溶表达载体phx53上，于宿主菌bl21(de3)中，表达融合蛋白hsabp-x-ifnα-2b。

经ni柱纯化后，得到纯的蛋白hsabp-x-ifnα-2b。

上述获得的hsabp-x-ifnα-2b进一步进行动物药代动力学试验评价，为证明本发明的先进性，全程实验均以未融合的ifnα-2b作为对照组进行实验。

本发明的第八目的是提供如上所述的人血清白蛋白黏附肽在制备半衰期延长的蛋白质类药物中的应用。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明提供了四种筛选出的新型人血清白蛋白黏附肽，提供了氨基酸序列，该些新型人血清白蛋白黏附肽易于制备、分子量小、具有较高的has黏附性；并且该黏附肽作为载体可提高目标蛋白体内半衰期，具有广泛的应用。

2、本发明采用筛选出的新型人血清白蛋白黏附肽与干扰素形成的融合蛋白，具有干扰素的活性，同时可以大大延长人干扰素的半衰期，可以提高在病毒感染方面的治疗效果。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为ifnα-2b及hsabp-ifnα-2b融合蛋白的血药活性-时间曲线图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

(1)hsa黏附肽的筛选

根据国内外报道，筛选出一批能特异性结合人血清白蛋白的has黏附肽，运用生物信息学的方法，分析has黏附肽空间结构特征及人血清白蛋白表面电荷等特点，设计出一系列新的多肽分子；用化学合成法进行直接合成；运用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance，spr)测定多肽分子与hsa的亲和力，选出能够结合has且结合力较高的hsa黏附肽。经过以上步骤，我们筛选出了4条多肽序列(如表1)，分别为hsabp-1，hsabp-3，hsabp-9，hsabp-16。

然后根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出对应的核苷酸分子，分别为hsabp-1，hsabp-3，hsabp-9，hsabp-15，hsabp-16。

表1hsabp序列及与人血清白蛋白亲和力

实施例二

制备融合蛋白hsabp-x-ifnα-2b

(1)构建载体和重组工程菌

将上述筛选到的4条hsabp分别连接到ifn的n段，构成融合蛋白(hsabp-x-ifnα-2b)。具体为将hsabp与ifnα-2b基因序拼接在一起(hsabp-x-ifnα-2b)，进行全基因合成，构建到我公司原核可溶表达载体phx53上，然后转化感受态细胞bl21(de3)，经过酶切、测序，筛选获得基因工程菌。

ifnα-2b直接构建到phx53上作为本发明的对照。

(2)发酵培养工程菌

将上述获得的工程菌按照1％的接种量接种到50ml含氨苄青霉素的sob培养基中，37℃、220rpm摇床培养od600至0.6-0.8；按5％的接种量接种到10l含氨苄青霉素的2×yt培养基中(ph7.0)，于15l发酵罐中37℃培养；

发酵过程：调节转速控制溶氧值在50-65％之间，用氨水控制ph在6.0-7.5之间；当od600达到0.8后加入除菌过滤的iptg至工作浓度1mm，继续25℃诱导培养6小时；室温放罐，12000rpm管式离心收集菌体；菌体用纯水洗涤离心两次，除去发酵液中的杂质。

(3)菌体破碎

菌体按1：20(m/v)，悬浮于裂解液(20mmpb,5mmol/ledta,0.1％triton-x100,ph6.0)中，置于冰水混合物上，超声破碎；12000rpm离心30分钟，取上清。

(4)层析纯化

细胞裂解液，经ni柱纯化，收集洗脱峰。sds-page凝胶电泳检测上述色谱柱分离纯化得到的融合蛋白，结果均在95.5％以上。

试验例一

融合蛋白hsabp-x-ifnα-2b活性检测

用《中华人民共和国药典》2015版第(三部)》规定的“干扰素活性测定法”测定融合干扰素的生物学活性，其比活性检测结果如表2所示。

结果表明，本发明获取的hsabp融合ifnα-2b，具有较理想的比活性。

表2hsabp融合ifnα-2b比活性

试验例二

融合蛋白hsabp-x-ifnα-2b药代动力学试验

将30只体重为290g左右的成年sd大鼠，雌雄各半每组6只，分为5组；每组分别注射7.25×10⁶iu的ifnα-2b与上述hsabp-x-ifnα-2b融合蛋白；分别于0，0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48，72，96小时经鼠尾静脉取血，收集血清，检测血清中保留的干扰素生物学活性。绘制“血药活性-时间曲线”，采用软件进行数据拟合(如图1所示)，分析药代动力学参数(如表3)。

表3ifnα-2b及hsabp融合ifnα-2b药代动力学参数

结果表明，ifnα-2b的半衰期t1/2β为1.73h，融合蛋白hsabp-1-ifnα-2b的t1/2β为4.22h，hsabp-3-ifnα-2b的t1/2β为3.65h，hsabp-9-ifnα-2b的t1/2β为4.14h，hsabp-16-ifnα-2b的t1/2β为3.11h，说明hsabp融合ifnα-2b半衰期较天然ifnα-2b均有较大程度的延长。

进一步说明，本发明所提供的hsabp，在体内可提高其携带目标蛋白的半衰期。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。