具有抗炎活性的Pyxinol酯化衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物化学和药物应用领域，具体涉及一类pyxinol酯化衍生物及其制备方法与作为抗炎的用途，属于新化合物的提出、制备与应用技术领域。

背景技术：

炎症反应是机体应对异物刺激的一种防御性反应，在大多数情况下，炎症是有益的，然而，在炎症过程中的炎症因子也会直接或间接对健康组织造成破坏，在临床上表现为发红、肿胀、发热、疼痛等症状。另一方面，很多慢性疾病也都涉及到炎症，如类风湿关节炎等。因此，抑制前炎症因子的产生成为各种疾病的治疗靶点。一氧化氮(no)是一种重要的前炎症介质，过多的no产生，与各种炎症疾病有关。目前，临床上使用的抗炎药物包括非甾体抗炎药、甾体抗炎药等，这些药物在相关炎症疾病的治疗中发挥了不错的疗效，如效果优良的临床药物—氢化可的松琥珀酸钠，然而，其作为糖皮质激素，存在明显的严重不良反应，如骨质疏松等。因此，寻求高效、低毒的抗炎药物变得尤为重要。

人参在我国已有数千年的用药史，具有除邪气、安神定魂、延年益寿等多重功效，人参皂苷作为其主要活性成分，具有广泛的药理作用。pyxinol作为四环三萜类天然产物，早在1972年从苔藓植物--地衣中分离出来。近年来，研究发现pyxinol及其c24位差向异构体为20s原人参二醇型皂苷在体内的关键代谢产物，前期研究发现其可以通过人参皂苷元直接氧化环化大量制备(chin.j.org.chem.37(2017),2109-2114)，并且发现其衍生物有抗心肌缺血再灌注损伤的活性(专利申请公布号cn106967143a)和肿瘤耐药逆转活性(eur.j.med.chem.161(2019),118-130，专利申请公布号cn109021058a、cn108992453a)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种pyxinol酯化衍生物及其制备方法与用途；本发明的另一个目的是提供一种抗炎药物，并将其应用于治疗和预防急性肺损伤、脓毒血症等有关疾病的药物或药物组合物中。

本发明是通过以下技术方案实现的：

提供一种pyxinol酯化衍生物，其结构如下列通式(i)所示：

其中，r1代表氢、boc、甲酰基、乙酰基或c1～c4烷基；r2、r3代表氢、c1～c4烷基、含羟基或卤素的c1～c4烷基。

优选地，所述的r1为boc、甲酰基、乙酰基、c1～c4烷基；r2、r3代表氢、c1～c4烷基。

本发明同时提供了上述通式(i)的pyxinol酯化衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：以原人参二醇(20s-ppd)为原料，与间氯过氧苯甲酸(m-cpba)按照摩尔比1：1～2投料反应制得(20s,24r)–环氧达玛琓–3β,12β,25–三醇(pyxinol)；

反应溶剂为非质子溶剂；反应温度为-20℃～80℃；

优选地，反应溶剂为二氯甲烷；反应温度为-10℃～30℃。

步骤(2)：pyxinol和对应的氨基boc修饰的氨基酸等羧酸类按照摩尔比1：1～5投料反应制得通式(i)pyxinol酯化衍生物；

反应溶剂为非质子溶剂；反应试剂为缩合剂或脱水催化剂；反应温度为-20℃～100℃；

优选地，反应溶剂为二氯甲烷；反应试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)、4-二甲氨基吡啶(dmap)、二环己基碳二亚胺(dcc)等缩合剂或浓硫酸、五氯化磷、氯化亚砜、三氟化硼等催化剂；反应温度为-5℃～30℃。

步骤(3)：通式(i)pyxinol酯化衍生物通过三氟乙酸或盐酸处理制备获得含自由氨基的通式(ii)pyxinol酯化衍生物；

反应溶剂为二氯甲烷或三氟乙酸或盐酸。

步骤(4)：将含自由氨基的通式(ii)pyxinol酯化衍生物与对应含单取代氨基的氨基酸等羧酸类按照摩尔比1：1～5投料反应制得通式(i)的pyxinol酯化衍生物；

反应溶剂为非质子溶剂；反应试剂为缩合剂或脱水催化剂；反应温度为-20℃～100℃；

优选地，反应溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺；反应试剂为1-羟基苯并三唑(hobt)、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)等缩合剂与三乙胺或浓硫酸、五氯化磷、氯化亚砜、三氟化硼等脱水催化剂；反应温度为-5℃～30℃。

本发明还公开了所述通式(i)的pyxinol酯化衍生物在制备抗炎类药物或药物组合物中的应用；具体地，是在制备治疗和预防急性肺损伤、脓毒血症等有关的疾病的药物或药物组合物中的应用。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。

本发明的化合物临床所用剂量为0.01mg～1000mg/天，也可根据病情的轻重或剂型的不同偏离此范围。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明所提供的通式(i)pyxinol酯化衍生物及其医学上可接受的盐，具有可逆、选择性的抗炎活性，在抑制炎症信号分子no的产生上显著优于现有临床药物氢化可的松琥珀酸钠，其中部分优选的pyxinol酯化衍生物在20μm浓度下对no产生的抑制率超过60％，显示出很强的抑制活性。

附图说明

图1为pyxinol酯化衍生物(1和2)对raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的no释放的抑制作用。

图2为化合物1对raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的tnf-α释放的抑制作用。

图3为化合物1对raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的inos和cox-2蛋白表达量的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1

(20s,24r)–环氧–3β–o–(boc–甘氨酰甘氨酰基)–达玛烷-12β,25–二醇(1)；

将20s–原人参二醇(8.000g,17.36mmol)溶于二氯甲烷(160ml)中，加入m-cpba(4.490g，19.51mmol)，室温搅拌3h。氯仿稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得到pyxinol[(20s,24r)–环氧达玛琓–3β,12β,25–三醇](5.184g,10.87mmol,63％)。

pyxinol，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.84(dd,j＝8.8,6.8hz,1h),3.51(td,j＝10.5,4.6hz,1h),3.18(dt,j＝9.9,4.5hz,1h),2.19(td,j＝10.9,3.6hz,1h),1.28(s,3h),1.27(s,3h),1.14–0.96(m,3h),1.09(s,3h),0.98(s,3h),0.97(s,3h),0.90(s,3h),0.85(s,3h),0.77(s,3h).

将pyxinol(42mg,0.088mmol)，n-boc-2-氨基乙酸(26mg,0.148mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，51mg，0.266mmol)溶于无水二氯甲烷(1.0ml)中,在冰浴里,氩气保护下加入4-二甲氨基吡啶(dmap，3mg，0.024mmol),缓慢升至室温搅拌1d.用水猝灭反应,用氯仿萃取,合并的有机相经无水硫酸钠干燥,浓缩,经柱层析得到中间产物(iii)(56mg,0.088mmol,100％),¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.01(br,1n),4.54(dd,j＝9.8,6.6hz,1n),3.89(d,j＝5.5hz,2n),3.85(dd,j＝8.9,6.6hz,1n),3.51(td,j＝10.5,4.6hz,1n),2.19(td,j＝10.1,3.2hz,1n),1.45(s,9n),1.28(s,3n),1.27(s,3n),1.09(s,3n),0.98(s,3n),0.90(s,3n),0.88(s,3n),0.85(s,6n)。

将中间产物(iii)(43mg，0.067mmol)溶于无水tfa(三氟乙酸，0.5ml)中，于室温下反应10min后结束反应。其浓缩物和boc-甘氨酸(26mg，0.148mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(1ml)中，加入hbtu(59mg，0.156mmol)和三乙胺4滴，室温搅拌4h。乙酸乙酯稀释，加饱和碳酸氢钠水溶液猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析，得到目标产物1(43mg，0.062mmol，93％),¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.66(s,1h),5.21(s,1h),4.54(dd,j＝8.8,7.2hz,1h),4.08(dd,j＝18.4,4.8hz,1h),4.02(dd,j＝18.4,4.8hz,1h),3.86(d,j＝5.6hz,2h),3.85(dd,j＝9.2,5.6hz,1h),3.51(td,j＝10.4,4.4hz,1h),1.46(s,9h),1.28(s,3h),1.27(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.88(s,3h),0.84(s,6h)。

实施例2

(20s,24r)–环氧–3β–o–(boc–l-丙氨酰甘氨酰基)–达玛烷-12β,25–二醇(2)

将中间产物(iii)(43mg，0.067mmol)溶于无水tfa(三氟乙酸，0.5ml)中，于室温下反应10min后结束反应。其浓缩物和boc-l-丙氨酸(28mg，0.148mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(1ml)中，加入hbtu(59mg，0.156mmol)和三乙胺4滴，室温搅拌4h。乙酸乙酯稀释，加饱和碳酸氢钠水溶液猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析，得到目标产物2(44mg，0.062mmol，93％),¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.54(dd,j＝8.8,7.2hz,1h),4.08(dd,j＝18.4,4.8hz,1h),4.02(dd,j＝18.4,4.8hz,1h),4.04-3.95(m,1h),3.85(dd,j＝9.2,5.6hz,1h),3.51(td,j＝10.4,4.4hz,1h),2.19(td,j＝10.1,3.2hz,1n),1.46(s,9h),1.28(s,3h),1.27(s,3h),1.10(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.88(s,3h),0.84(s,6h)。

实施例3

pyxinol酯化衍生物对no产生的抑制活性检测：

no是一种重要的炎症介质。当体内发生某些病理改变时体内产生的no量就会超过正常水平。因此，no抑制剂有潜在的可能和机会去寻找新的治疗炎症相关疾病的方法。为了评估pyxinol酯化衍生物的抗炎作用，使用griess试剂检测raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的no的释放水平。将raw264.7细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在96孔板中并培养6小时；然后用lps(1μg/ml)刺激造模，并用20μm浓度的衍生物、pyxinol及阳性药物(氢化可的松琥珀酸钠)处理细胞24小时后，使用griess试剂(beyotime，china)检测亚硝酸盐水平来确定no产生的量；然后在微孔板读数器(spectramaxm3)中测量样品在540nm处的吸光度(od540)；其中，空白组为无lps和药物处理组；对照组为lps刺激造模但无化合物处理组；

no抑制率＝[对照(od540)-化合物(od540)]/[对照(od540)-空白(od540)]×100％；

本发明所述pyxinol酯化衍生物的生物活性检测的结果如图1所示

图例说明如下：

(1)每个数值来自三个平行实验平均±sd(n＝3)；

(2)各组数据间不同字母表示差异显著(p<0.05)；

实施例3的结果表明：

本发明提供的pyxinol酯化衍生物具有良好的抗炎活性，显著优于pyxinol及阳性药物(氢化可的松琥珀酸钠)的抗炎活性；

本发明涉及的pyxinol酯化衍生物均显著抑制了lps诱导的no释放增加，其抑制no产生的抗炎活性比临床药物氢化可的松琥珀酸钠更高效。尤其是衍生物1显示出最强的抑制活性，并且在20μm的浓度下其对no释放的抑制率超过60％。

实施例4

tnf-α是另一种重要的炎症因子。对lps诱导tnf-α的抑制能力，可以显示该化合物的抗炎能力强弱。为了评估pyxinol酯化衍生物的抗炎作用，使用elisa试剂盒检测raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的tnf-α的释放水平。将raw264.7细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在96孔板中并培养1小时；然后用30、15和7.5μm浓度的化合物1预处理细胞2小时，经lps(1μg/ml)刺激4小时后，使用elisa试剂盒(beyotime，china)检测亚硝酸盐水平来确定tnf-α的释放水平；

图例说明如下：

(1)每个数值来自三个平行实验平均±sd(n＝3)；

(2)与空白组相比，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；

(3)与lps刺激组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

实施例4的结果表明：

在30、15和7.5μm浓度下，与模型组相比，化合物1对lps诱导的raw264.7所产生的tnf-α均有抑制作用且成浓度依赖性。且在30μm浓度下对tnf-α的抑制作用显著强于阳性药，提示了其在对tnf-α抑制能力的抗炎活性上优于临床药物氢化可的松琥珀酸钠。

实施例5

inos和cox-2蛋白的表达情况，可以进一步说明化合物的抗炎能力。药物对lps诱导产生的inos和cox-2蛋白的抑制能力强弱，可以显示其抗炎能力的强弱。为了评估ocotillol型皂苷元衍生物的抗炎能力，使用westernblot检测raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的inos和cox-2蛋白的表达情况。将raw264.7细胞以2×10⁶个细胞/孔接种在6孔板中并培养24小时；然后用lps(1μg/ml)刺激细胞并用30、15和7.5μm浓度的化合物1处理细胞，经过刺激24小时后，通过westernblot检测raw264.7细胞中脂多糖(lps)诱导的inos和cox-2蛋白的表达情况；

实施例5的结果表明：

化合物1在30、15和7.5μm浓度下，与模型组相比，化合物1能够抑制lps诱导的raw264.7炎症模型所产生的inos和cox-2蛋白的表达且成浓度依赖性，且在30μm浓度下对inos和cox-2蛋白表达的抑制作用强于阳性药，在15μm时抑制作用与阳性药20μm浓度下的抑制作用相当，这些结果说明了化合物1在抑制inos和cox-2蛋白表达的抗炎活性上优于临床药物氢化可的松琥珀酸钠。

药理试验证明，本发明的pyxinol酯化衍生物具有明显抗炎作用，且其活性显著优于现有临床药物—氢化可的松琥珀酸钠(阳性药)，用于制备抗炎药物，能够发挥良好的抗炎活性。

实施例6

以常规方法制备下列组成的试剂

取上述配方，用常规方法制备成片剂。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的但不限于具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。