cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及cry2ah-vp基因在抗黏虫中的应用。

背景技术：

玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，但由于虫害的发生每年玉米减产大约7％，严重时可达20％。1996年转基因抗虫作物开始商业化种植，bt作物的广泛种植有效的防治了害虫，减少了杀虫剂的使用，降低了生产成本，对环境、有益昆虫及人畜等均无不良影响[batessl,zhaojz,roushrt,sheltonam.insectresistancemanagementingmcrops:past,presentandfuture.naturebiotechnology,2005,23:57-62.estruchjj,carozzinb,desain,ducknb,warrengw,kozielmg.transgenicplants:anemergingapproachtopestcontrol.naturebiotechnology,1997,15:137-141.]。目前国际上抗虫转基因玉米主要转化的基因包括btcry1ab基因，如mon810和bt11；cry1f基因，如tc1507；vip3a基因，如mir162；cry1a.105(cry1f和cry1ac杂合)和cry2ab2基因的mon89034等；国内正在研制的抗虫玉米转化的基因主要有cry1ab、cry1ac、cry1ab/cry2aj和cry1ah等[韩岚岚,宋福平,张杰,赵奎军.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析.东北农业大学学报,2008,39(8):21-24.yangf,kernsdl,headgp,leonardbr,niuy,huangfn.occurrence,distribution,andeardamageofhelicoverpazea(lepidoptera:noctuidae)inmixedplantingsofnon-btandbtcorncontainingsmartstaxtmtraits.cropprotection,2014,55:127-132.]。黏虫(mythimnaseparata)是一种常见的玉米害虫，属鳞翅目夜蛾科，在幼虫时期暴食玉米叶片，严重发生时，可短期内吃光叶片，造成玉米减产甚至绝收[江幸福,张蕾,程云霞,罗礼智.我国黏虫发生危害新特点及趋势分析.应用昆虫学报,2014,51(06):1444-1449.]。现有的bt基因对玉米螟有良好的防治效果，但在黏虫防治上还需要有效的抗虫基因[杨素娟,黄闽忠,李艳秋,周子珊,江幸福,高继国,程云霞,张杰.对黏虫具有杀虫活性的bt蛋白筛选及分析.植物保护,2016,42(03):30-35.]。cry2ah基因是从土壤样本中混合收集免培养获得，cry2ah蛋白对玉米螟有体重抑制活性，对棉铃虫有生长抑制活性，同时对cry1ac抗性棉铃虫也有很好的生长抑制活性[shucl,zhangjt,chenguih,lianggm,hekl,crickmoren,huangdf,zhangj,songfp.useofapooledclonemethodtoisolateanovelbacillusthuringiensiscry2atoxinwithactivityagainstostriniafurnacalis.journalofinvertebratepathology,2013,114:31-33.]。现有的研究表明，cry2ah蛋白对黏虫有体重抑制，但没有致死作用(刘臣陈琳等，四种bt蛋白对六种重要鳞翅目害虫的杀虫活性评价，中国生物防治学报，2017，33(6)774-779)。将cry2ah的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到cry2ah1-vp突变体，其在突变位置上与cry2ab具有相同的碳骨架。将两个基因分别转入烟草植株后，进行了棉铃虫和cry1ac抗性棉铃虫杀虫活性的试验，结果表明cry2ah-vp与cry2ah相比具有更高的杀虫活性[lisy,wangzy,zhouyy,lich,wanggp,wangh,zhangj,lianggm,langzh.expressionofcry2ah1andtwodomainiimutantsintransgenictobaccoconfershighresistancetosusceptibleandcry1ac-resistantcottonbollworm.scientificreports,2018,8(1):508.]。本申请人在专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666)中对mcry2ah-vp基因序列及其转烟草的应用进行了详细的说明。

技术实现要素：

针对上述领域中的需求，本发明提供cry2ah-vp基因在抗黏虫中的应用，通过对btcry2ah-vp基因进行密码子优化，转入玉米中，实验表明，cry2ah-vp基因具有极好的抗黏虫效果。

蛋白cry2ah-vp在抗黏虫中应用，所述蛋白cry2ah-vp的氨基酸序列如seqidno.1所示。

所述应用，是将含编码蛋白cry2ah-vp的基因的载体转入玉米中，使其具有抗黏虫的特性。

所述编码蛋白cry2ah-vp的基因序列如seqidno.2所示。

所述载体为pc2hbvp，其骨架载体是pcambia3300。

所述载体pc2hbvp的结构如图2所示。

本申请人通过前期优化的cry2ah-vp蛋白见seqidno.1，即将cry2ah(seqidno.3)的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到cry2ah1-vp突变体(见专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666))，并期根据玉米基因的密码子偏好性同时考虑trna转运饥饿对btcry2ah-vp基因进行密码子优化(见seqidno.2)，优化后的cry2ah-vp基因构建植物表达载体pc2hbvp，利用农杆菌介导法转入玉米中，获得t0代转基因玉米。在本研究中通过草铵膦筛选、pcr鉴定及目的蛋白含量检测，筛选得到了转基因事件vp1-5，并对vp1-5转基因玉米进行拷贝数分析和抗虫性实验。southernblot检测结果表明cry2ah-vp基因是以单拷贝的形式插入玉米基因组中；qrt-pcr检测结果表明cry2ah-vp基因在vp1-5转基因玉米不同组织中可以正常转录；酶联免疫吸附测定(elisa)检测结果显示，六叶期cry2ah-vp蛋白在玉米各个部位的表达量最高，叶片的表达量为2.20μg/gfw(鲜重)，抽雄期和灌浆期各部位也有较高表达。抗虫实验结果显示vp1-5转基因玉米对黏虫有很好的杀虫活性，接虫3天后黏虫全部死亡；对玉米螟幼虫有明显的生长抑制作用。

黏虫危害严重影响玉米质量和产量，目前在其防治上亟需新的抗虫材料，cry2ah-vp蛋白是改造后具有很高抗黏虫活性蛋白，能够在玉米各个部位表达，因此vp1-5转基因玉米将会是玉米抗虫育种和害虫防治良好的种质资源，在玉米抗虫育种上有很好的商业化前景。

附图说明

图1植物表达载体pc2hb构建示意图，

图2植物表达载体pc2hb-vp构建示意图，

图3草铵膦喷施7天后植株生长状况及bar试纸条检测结果，

图4pcr扩增产物，其中a为cry2ah-vp，b为bar，

图中m：marker；ck+：阳性对照；1-5：vp1-5材料；ck-：郑58对照；0：空白对照；

图5vp1-5转基因事件的southernblot检测，

其中m：dnamarker；+：正对照；h：hindⅲ酶切后基因组；b：bamhi酶切后基因组；e：ecori酶切后基因组；s：saci酶切后基因组；-：负对照；

图6不同时期和组织中cry2ah-vp的rna表达分析，

图7不同时期和组织中cry2ah-vp蛋白的表达量，

图83天时室内生测结果，

其中：图a、c中为vp1-5叶片；图b、d中为郑58叶片；图a、b为黏虫处理组；图c、d为玉米螟处理组，

图9室内生测3天时的玉米螟生长状况，

其中：图a中为vp1-5叶片；图b中为郑58叶片，

图10田间接种黏虫幼虫生测结果，

其中a：vp1-5六叶期虫测；b：郑58六叶期虫测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1.1材料

植物材料转btcry2ah基因抗虫玉米材料(由本实验室保存)、玉米自交系郑58。

供试虫源黏虫、玉米螟卵购自北京美延农业科技有限公司。

供试农药草铵膦(水剂，有效成分含量：200克/升)购自浙江永农生物科学有限公司。

bar快速检测试纸条购自北京奥创金标生物公司。

1.2转基因玉米

1.2.1植物表达载体的构建

为了将改造的mcry2ah(seqidno.4)和mcry2ah-vp(seqidno.2)基因转入玉米中，构建了两个植物表达载体。植物表达载体的骨架载体是商用载体pcambia3300，在pcambia3300载体上已经存在筛选标记基因phosphinothricin(ppt)，可以用于草铵膦筛选。人工合成的mcry2ah和mcry2ah-vp基因的两端分别增加了多克隆位点，5’端含有hindiii、xbai、xmai、smai和bamhi，3’端含有kpni、xhoi和ecori，合成的基因构建到puc57载体，分别称为pum2ah和pum2ah-vp(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)。将来源于玉米的ubiquitin启动子和nos终止子分别连在两个基因的5’端和3’端，构建获得pubim2ahn和pubim2ahvpn(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，用hindⅲ和ecori双酶切pubim2ahn和pubim2ahvpn，连接到用同样酶切的pcambia3300，构建获得的载体称为pc2hb和pc2hbvp(载体构建示意图见图1，图2)。

1.2.2转基因玉米的获得

用农杆菌转化法将构建的pc2hb和pc2hbvp转化玉米，转化方法是农杆菌转化法，玉米农杆菌转化法已经是常规的转化方法，首先以玉米幼胚为受体组织，将玉米幼胚置于含植物表达载体pc2hb和pc2hbvp的农杆菌eha105的侵染培养基中侵染，在26℃黑暗条件下于共培养基上培养，再转至恢复培养基上诱导培养出愈伤组织；再将愈伤组织转移到含有1mm草铵膦的筛选培养基上培养；而后转移到再生培养基上见光分化，出现绿色芽点，将愈伤块切分使绿色芽点分开并转移到再生培养基上培养，待主茎伸长至至3-4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根；待玉米植株长得粗壮且根系发达后，种植到花盆或温室大棚或田间。通过玉米转化，获得转pc2hb载体植株10株，转pc2hbvp载体植株31株。通过田间草铵膦筛选，转pc2hbvp载体植株vp1-5抗性强。

所述培养基：

侵染培养液：n6盐和n6维生素(chu等，sciencesinica，1975，18:659-668)，1.5mg/l2,4-d，0.7/lg脯氨酸，68.4g/l蔗糖，36g/l葡萄糖(ph5.2)，过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(as)，终浓度为100μm；

共培养培养基：n6盐和n6维生素，1.5mg/l2,4-d，0.7g/l脯氨酸，30g/l蔗糖，3g/l植物凝胶(ph5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/l的硝酸银，100μm的as，300mg/l的半胱氨酸；

恢复培养基：n6盐和n6维生素，1.5mg/l2,4-d，0.7g/l脯氨酸，30g/l蔗糖，0.5g/lmes，4g/l植物凝胶(ph5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/l的硝酸银和200mg/l的羧苄青霉素；

筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mm草铵膦；

再生培养基：ms盐和ms维生素，30g/l蔗糖，100mg/l肌醇，3g/l植物凝胶(ph5.8)，高压灭菌。

所述玉米幼胚为新鲜剥离的1.2mm长的幼胚。

所述农杆菌菌液中添加有100μm乙酰丁香酮。

1.2.3转pc2hbvp载体植株检测

1.2.3.1草铵膦抗性筛选及bar试纸条检测

田间种植t1代玉米，进行草铵膦抗性筛选，配制浓度为2‰的草铵膦水溶液，在玉米四叶期进行喷施，7天后观察效果，统计活苗数。为了进一步确定存活植株为阳性，再用bar快速检测试纸条进行检测，剪取1㎝²左右大小的玉米叶片，放入装有0.5ml水的1.5ml的ep管中，使用尖头玻璃棒进行研磨，将试纸条插入ep管，等待2min左右，观察试纸条质控线和检测线。

1.2.3.2转化植株的pcr检测

采用ctab法从玉米叶片组织中分离出基因组dna[porebskis,baileylg,baumbr.modificationofactabdnaextractionprotocolforplantscontaininghighpolysaccharideandpolyphenolcomponents.plantmolecularbiologyreporter,1997,15:8-15.]。用cry2ah-vp和bar的特异性引物分别进行pcr检测，引物序列见表1。cry2ah-vp的检测以20μl反应混合物中含有100ng的dna模板，引物各0.1μm，10μl2×taqmastermix(dye)，ddh2o补足至20μl。反应条件为：94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃60s)30个循环，72℃5min。bar的检测以20μl反应混合物中含有100ng的dna模板，引物各0.1μm，10μl2×taqmastermix(dye)，ddh2o补足至20μl。反应条件为：94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃20s)30个循环，72℃5min。pcr产物通过1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳，用doc^tmxr+(bio-rad，美国)凝胶成像仪观察并存储。

表1pcr所用引物序列

1.2.3.3southernblot分析

50μg玉米基因组dna分别用hindⅲ、bamhi、ecori、saci进行酶切，并在0.7％(w/v)琼脂糖凝胶上30v过夜电泳，转移至hybord^tm-n+尼龙膜(ge，英国)。以cry2ah-vp基因的862bp片段为探针，探针制备采用正向引物5'-gagtggatggagtggaag-3'，反向引物5'-cgatgtttgggaaggtct-3'扩增出目的条带，切胶回收。探针dna用pcrdigprobesynthesiskit(roche,德国)标记为dig-11-dutp，按照地高辛dna标记和检测试剂盒ii(roche，德国)的方案进行。用ai600(ge，美国)自动化学发光成像分析系统进行图像分析。

1.2.3.4荧光定量rt-pcr分析

利用荧光定量pcr(quantitativert-pcr)检测cry2ah-vp基因在转录水平的表达差异。取玉米抽穗期和灌浆期的雄穗、心叶、平展叶、苞叶、花丝、穗轴、籽粒、茎、根组织，用trizol(transgen,中国)从100mg组织中提取总rna。利用反转录试剂盒(thermo，美国)逆转录合成cdna，定量rt-pcr使用设备3real-timepcrsystem(thermofisherscientific,美国)进行。采用sybrgreeni定量pcr试剂盒(roche，瑞士)，以actin基因为参考基因，分别用引物vp1-5-qf1/r1检测cry2ah-vp的转录，用引物actin-qf1/r1检测actin的转录，引物序列见表2。20μl反应混合物中含有10μl的2×topgreenqpcrsupermix(transgen,中国)，引物各0.2μm，cdna模板1μl。反应条件如下：95℃30s预变性，95℃5s和60℃34s进行40个循环，然后进行溶解曲线分析。

表2qpcr所用引物序列

1.2.3.4酶联免疫吸附测定(elisa)

采集vp1-5材料不同生长时期的三个株系，每个株系取3株阳性样品，分别为六叶期、抽穗期和灌浆期的雄穗、心叶、平展叶、苞叶、花丝、穗轴、籽粒、茎、根组织，利用酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)测定转基因植株的cry2ah-vp蛋白表达量。按照cry2a定量检测试剂盒(envirologix，美国)说明书，将100mg玉米叶片组织研磨提取cry2ah-vp蛋白，进行酶联免疫吸附测定。使用酶标仪biotekelx808(biotek，美国)在波长450nm处测量od，重复读取3次的结果，计算均值，根据cry2ah-vp蛋白标准品的od值，绘制标准曲线，使用excel和spass软件对数据进行分析。

1.2.3.5生物测定

玉米生长到六叶期时，进行室内和田间的生物测定。测定转基因玉米植株对黏虫、玉米螟幼虫的杀虫活性。黏虫和玉米螟幼虫的室内生物测定使用24孔培养皿，取1㎝²大小的玉米叶片放在24个孔内，每个孔内放入一头初孵幼虫，每天记录活虫、死虫的数量，记录7天。每种处理进行三次生物重复，自交系郑58材料的叶片作为对照。死亡率表示为死亡幼虫占总幼虫的比例(％)。田间生测在玉米六叶期时分别将初孵黏虫幼虫和初孵玉米螟幼虫用毛笔接种到不同玉米植株，郑58植株做对照，接虫2周后可以进行统计，观察植株受危害情况并拍照记录。

1.2.4转pc2hbvp载体植株检测结果

1.2.4.1转化植株的草铵膦筛选与试纸条检测

对大田种植的转化玉米植株进行草铵膦筛选，2‰的草铵膦喷施后7天观察植株，转化阳性植株能正常生长(图3中a)，阴性植株则出现发黄，萎蔫，死亡的情况(图3中b)。对获得的阳性植株进一步用bar试纸条检测，试纸条上条带为质控线，下条带为检测线，两条条带均有的为阳性植株(图3中c)。图3中c中试纸条a-e为vp1-5材料的检测结果，显示为阳性，f为郑58，检测为阴性。

1.2.4.2转化玉米植株的pcr鉴定

ctab法提取玉米叶片基因组利用pcr检测转基因植株(图4)，结果显示，图4中a以cry2ah-vp为引物，以vp1-5材料基因组dna为模板进行pcr，扩增产物长度为1353bp。图4中b中以bar为引物，以vp1-5材料基因组dna为模板进行pcr，扩增产物长度为495bp。表明cry2ah-vp基因和bar基因在vp1-5材料中都正常表达。

1.2.4.3southernblot杂交

将转基因玉米材料vp1-5的基因组dna分别用限制性内切酶hindiii、bamhi、ecori、saci进行酶切，使用地高辛试剂盒进行southernblot杂交，结果表明，在转基因玉米植株vp1-5材料中，cry2ah-vp基因以单拷贝的形式整合到玉米基因组中(图5)，对照植株郑58材料中未检测到杂交信号(图5)。southernblot杂交结果证实外源基因被成功转化并整合到玉米基因组中。

1.2.4.4cry2ah-vp基因在转基因玉米中的转录分析

vp1-5转基因植株利用qrt-pcr方法对cry2ah-vp的转录水平进行检测。选取了玉米抽雄期和灌浆期的根、茎、叶、花丝、穗轴等不同组织，以actin基因为参考基因，cry2ah-vp基因为目的基因，每个样品三次重复。采用2^-△△ct法对数据进行分析。qrt-pcr结果表明，cry2ah-vp基因在转基因玉米植株各组织中正确转录，不同时期不同部位转基因植株的转录水平存在差异，在抽雄期和灌浆期的叶片和花丝中转录水平最高(图6)。

1.2.4.5转基因玉米中cry2ah-vp蛋白的定量分析

elisa方法对vp1-5转基因玉米进行cry2ah-vp蛋白表达的定量检测，不同生长时期的三个株系，每个株系取3株样品，样品进行3次重复处理。六叶期、抽穗期和灌浆期的雄穗、心叶、平展叶、苞叶、花丝、穗轴、籽粒、茎、根组织定量分析结果见图7：六叶期的cry2ah-vp蛋白在根、茎、叶中的表达量都很高，叶片中表达量最高达2.20μg·g^-1fw(鲜重)，抽雄期cry2ah-vp蛋白在玉米各个部位的表达量高于灌浆期各部位表达量，而常规种材料郑58均未检测出cry2ah蛋白。不同时期的各个组织部位中均有cry2ah-vp蛋白的表达，可以保证玉米在生长过程免受靶标害虫为害，降低玉米产量损失。

1.2.4.6生物测定

为了研究转cry2ah-vp基因玉米对黏虫和玉米螟的杀虫活性，对vp1-5转基因玉米和常规玉米郑58进行抗虫性分析。室内生测结果显示：与对照组相比，转基因玉米植株在接种初孵幼虫三天后对黏虫表现出明显的抗性(图8中a)，对玉米螟表现出明显的生长抑制作用。对照组郑58叶片受损严重，大多数幼虫存活，且虫体较大活力旺盛(图8中b，d)，相反所有转基因植物的叶子损伤轻微，只有少数针刺状虫孔，绝大多数幼虫死亡，存活幼虫生长受到明显抑制(图8中a，c)。以vp1-5植株为食的黏虫幼虫三天全部死亡，校正死亡率为96.82％±4.40％；以vp1-5植株为食的玉米螟幼虫三天时的校正死亡率为25.00％±15.59％(表3)。虽然玉米螟的死亡率低于黏虫，但玉米螟虫体明显小于对照组，活力低下，几乎不进食，不能进一步完成生长发育(图9)。同时对转pc2hb载体植株2ahl246、2ahl247和2ahl248进行了抗虫性检测，黏虫的校正死亡率低于vp1-5(表3)。对转pc2hb载体植株的抗虫检测效果与“四种bt蛋白对六种重要鳞翅目害虫的杀虫活性评价”基本相符。

表33天时黏虫和玉米螟的校正死亡率统计分析

玉米生长到6-8叶期时，接种初孵黏虫幼虫在转基因材料vp1-5和常规种材料郑58，接虫两周后观察植株生长情况，vp1-5材料叶片表面光滑无孔洞(图10，a)，郑58材料叶片有缺刻及虫孔(图10，b)。

实验表明cry2ah-vp是一个对鳞翅目害虫黏虫具有杀虫活性的bt杀虫基因；转cry2ah-vp基因玉米vp1-5对黏虫有高杀虫活性，可用于抗虫玉米育种，有很好的产业化前景。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>cry2ah-vp基因在抗黏虫中的应用

<141>2019-03-14

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>633

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metasnasnvalleuasnserglyargalathrasnglyaspalatyr

151015

asnvalvalalahisasppropheserpheglnhislysserleuasp

202530

thrileglngluglutrpmetglutrplyslysaspasnhisileleu

354045

tyrvalaspproilevalglythrvalalaserpheleuleulyslys

505560

valglyserleuvalglulysargileleusergluleuargasnleu

65707580

ilepheproserglyserthrasnleumetglnaspileleuargglu

859095

thrglulyspheleuasnglnargleuasnthraspthrleualaarg

100105110

valasnalagluleuthrglyleuglnalaasnvalgluglupheasn

115120125

argglnvalaspasnpheleuasnproasnargasnalavalproleu

130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

glnasnhisleuargasntyrthrargglutyrserasntyrcysile

210215220

thrthrtyrglnthralapheargglyleuasnthrargleuhisasp

225230235240

metleuglupheargthrtyrmetpheleuasnvalpheglutyrval

245250255

seriletrpserleuphelystyrglnserleuleuvalsersergly

260265270

alaasnleutyralaserglyserglyproglnglnthrglnserphe

275280285

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290295300

asntyrvalleuasnglypheserglyalaargleuthrglnthrphe

305310315320

proasnilevalglyleuproglythrthrthrthrhisalaleuleu

325330335

alaalaargvalasntyrserglyglyvalserserglyaspilegly

340345350

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355360365

leuleuthrprophevalargsertrpleuaspserglyserasparg

370375380

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385390395400

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405410415

tyrpheproasptyrpheileargasnileserglyvalproleuval

420425430

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435440445

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450455460

valservalhisasnarglysasnasniletyralavalhisgluasn

465470475480

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485490495

serproilehisalathrglnvalasnasnglnthrargthrpheile

500505510

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545550555560

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565570575

asnaspglyvalasnaspasnglyalaargpheseraspileasnile

580585590

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595600605

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610615620

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<211>1902

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaacaacgtcctcaacagcggcagggctacgaacggcgacgcgtacaacgtggtcgcc60

cacgaccccttctccttccagcacaagagcctcgacaccatccaggaggagtggatggag120

tggaagaaggacaaccacatcctctacgtggacccgatcgtgggcaccgtcgcctccttc180

ctcctgaagaaggtcggcagcctcgtcgagaagcgcatcctctccgagctgaggaacctc240

atcttcccgtccggcagcacgaacctcatgcaggacatcctgcgcgagaccgagaagttc300

ctgaaccagcgcctcaacacggacaccctggctagggtcaacgctgagctgaccggcctc360

caggctaacgtcgaggagttcaaccgccaggtggacaacttcctcaacccgaacaggaac420

gccgtccccctgtccatcacgtccagcgtgaacaccatgcagcagctcttcctgaacagg480

ctcccccagttccagatgcagggctaccagctcctgctcctgccactgttcgctcaggct540

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