一种肿瘤归巢穿膜肽tLyP-1修饰的去铁蛋白纳米笼及其制备方法与流程

本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的重组去铁蛋白纳米笼及其制备方法。

背景技术：

治疗恶性肿瘤最常用的方法是化学治疗，但由于大多数的化疗药物缺乏靶向选择性，对病人的正常组织、器官造成严重伤害，所以实现化学药物诊断治疗靶向性是目前癌症治疗的主要目标。去铁蛋白是由24亚基自组装形成球形笼状结构其内径8nm，外径12nm。该蛋白可通过调节ph、使用不同浓度的尿素等方法实现亚基的解聚与重组，使药物载入纳米笼中；该纳米笼水溶性、生物相容性好，稳定性佳，尺寸均一，且能与肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体1(tfr1)特异性结合，并在该受体的介导作用下实现有效入胞，从而达到主动靶向效果，同时还可使用化学、基因工程等方法对该蛋白内表面、外表面进行修饰，构建新型多功能纳米材料。这些自身优越性使铁蛋白成为一种理想的新型多功能纳米药物载体。

但是，未经修饰的铁蛋白因其自身靶向单一只能实现少部分肿瘤的靶向且只能实现对肿瘤细胞的靶向，通过表面修饰tlyp-1，去铁蛋白不仅可与神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的肿瘤细胞过量表达的nrp-1特异性结合，还可与其肿瘤新生血管过量表达的nrp-1特异性结合，并可在nrp-1的介导下进入细胞，有效的抑制肿瘤的增长与扩散，大大提高了肿瘤治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服天然人工去铁蛋白作为诊断治疗神经胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤细胞纳米载药载体靶向性单一或靶向性不足，而提供一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白，该铁蛋白不仅可实现药物靶向递送至肿瘤细胞，也可递送至肿瘤新生血管中，还有望通过血脑屏障，达到靶向诊断治疗神经胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤的效果。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码基因，所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码基因的序列为seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白，所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码蛋白为seqidno.2所示的氨基酸序列。

本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白纳米笼，将肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰于去铁蛋白亚基的n端，得到tlyp-1-hftn，其中tlyp-1表示一种肿瘤归巢肽，hftn为由24个去铁蛋白亚基组成的纳米蛋白笼。

进一步地，所述的去铁蛋白为人体重链铁蛋白。

本发明的所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白纳米笼的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)重组蛋白笼表达工程菌的构建

在hftn基因编码序列的5'端修饰tlyp-1和连接肽的编码基因，克隆至质粒载体中，并转化至大肠杆菌感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性单克隆转化子，以获得目的重组蛋白表达工程菌；

(2)重组蛋白的表达和收集菌种

将表达目的重组蛋白的工程菌以1％的接种比例接种于含有氨苄青霉素的培养基中，待菌液od600值达到0.6-0.8时，加入iptg诱导表达，离心收集菌体；

(3)重组蛋白的分离纯化

将步骤(2)得到的菌体超声破碎，离心收集上清，将上清水浴加热，再次离心，采用亲和层析法对上清液中杂蛋白及目的重组蛋白进行分离纯化，通过体积排阻色谱对目的重组蛋白进行再次纯化，得到所述的目的重组蛋白tlyp-1-hftn。

进一步地，在步骤(1)中，以hftn编码基因为基础，在其5'端修饰肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1和连接肽ggggs的编码基因tgtggtaataaacgtacccgtggtggtggtggtagc并将该基因序列亚克隆至pet-20b(+)质粒载体中，即得到含有目的基因的质粒。将该质粒热激至大肠杆菌感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性及基因测序等手段筛选出阳性单克隆，对阳性单克隆进行大量培养，并将该重组菌保存在10％的甘油中。

进一步地，在步骤(2)中，培养至od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为5mm的iptg诱导表达，离心收集菌体。

更进一步地，在步骤(3)中，将步骤(2)收集的菌体超声破碎，离心收集上清，将收集的上清60℃水浴加热后再次离心，将上清与镍柱结合，用不同浓度的咪唑缓冲液分离出目的蛋白，收集洗脱液并进行sds-page分析，选择目的蛋白含量最多杂蛋白含量最少的洗脱液，置于100kda超滤管中离心脱盐置换到gfc缓冲液(50mmnah2po4，150mmnacl，ph＝7.0)中，再通过体积排阻色谱(sec)对目的重组蛋白进一步纯化，得到所述的目的重组蛋白tlyp-1-hftn。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、透射电镜(tem)对目的蛋白进行表征。

有益效果：本发明在达到深度除磷效果的同时，减少水体中铁盐的投加量，同时，不引入其余潜在的有机污染物，保证水体的清洁和安全。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

(1)本发明采用这一工序处理实际生活污水，在达到地表四类水这一水质标准要求的水中总磷含量的条件(tp<0.3mg/l)下，同时，使用该复合工艺可将出水ss值降至10mg/l以下，而仅采用氯化铁无法达到这一目标，这保证了出水符合国家污水排放标准。

(2)本发明得到的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的重组人体重链铁蛋白不仅能与高表达nrp-1的肿瘤细胞特异性结合，还能与高表达nrp-1的肿瘤新生血管特异性靶向结合，并在nrp-1介导下有效进入胞内，实现对肿瘤细胞、肿瘤新生血管双重靶向，大大提升治疗效果。为抗肿瘤药物及基因药物提供了一种理想的新型纳米载体。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为本发明的实施例3中tlyp-1-hftn在镍柱亲和层析法纯化过程中各流出组分的sds-page图；m：proteinmarker1：菌液裂解后上清；2：菌液裂解后加热上清；3:5mm咪唑洗脱产物；4:10mm咪唑洗脱产物；5:250mm咪唑洗脱产物。

图2为本发明的实施例3中tlyp-1-hftn的体积排阻色谱图；

图3为本发明的实施例4中tlyp-1-hftn(b)的透射电镜图，其中hftn(a)作为对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释和说明，但应理解，所给出的实施例只作为举例说明，不以任何方式对本发明构成任何限制。

本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码基因，所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码基因的序列为seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白，所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白的编码蛋白为seqidno.2所示的氨基酸序列。

本发明的一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白纳米笼，将肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰于去铁蛋白亚基的n端，得到tlyp-1-hftn，其中tlyp-1表示一种肿瘤归巢肽，hftn为由24个去铁蛋白亚基组成的纳米蛋白笼。

所述的去铁蛋白为人体重链铁蛋白。

本发明的所述的肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白纳米笼的制备方法，包括如下步骤：

(1)重组蛋白笼表达工程菌的构建

以hftn编码基因为基础，在其5'端修饰肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1和连接肽ggggs的编码基因tgtggtaataaacgtacccgtggtggtggtggtagc并将该基因序列亚克隆至pet-20b(+)质粒载体中，即得到含有目的基因的质粒。将该质粒热激至大肠杆菌感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性及基因测序等手段筛选出阳性单克隆，对阳性单克隆进行大量培养，并将该重组菌保存在10％的甘油中。(2)重组蛋白的表达和收集菌种

将表达目的重组蛋白的工程菌以1％的接种比例接种于含有氨苄青霉素的培养基中，待菌液培养至od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为5mm的iptg诱导表达，离心收集菌体。

(3)重组蛋白的分离纯化

将步骤(2)收集的菌体超声破碎，离心收集上清，将收集的上清60℃水浴加热后再次离心，将上清与镍柱结合，用不同浓度的咪唑缓冲液分离出目的蛋白，收集洗脱液并进行sds-page分析，选择目的蛋白含量最多杂蛋白含量最少的洗脱液，置于100kda超滤管中离心脱盐置换到gfc缓冲液(50mmnah2po4，150mmnacl，ph＝7.0)中，再通过体积排阻色谱(sec)对目的重组蛋白进一步纯化，得到所述的目的重组蛋白tlyp-1-hftn。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、透射电镜(tem)对目的蛋白进行表征。

实施例1

如图1至图4所示，pet-20b(+)/tlyp-1-hftn表达重组工程菌的构建

在文献报道的hftn基因编码序列的5'端加上tgtggtaataaacgtacccgtggtggtggtggtagc序列，

实施例2

tlyp-1-hftn目的重组蛋白可溶性表达形式的分析

将阳性重组菌加入至含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃下，200r/min，震荡过夜将菌种活化。以1％的接种量转移至5ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃，210r/min，培养至菌液od600达到0.6-0.8，向培养基加入终浓度为0.5mm的iptg，30℃诱导培养6h。取2ml菌液，4℃，8000×g，离心5min收集菌体，弃上清，加入200μl结合缓冲液(50mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph＝7.9)进行重悬，在相同的条件下再次离心，弃上清收集菌体，再次重悬于200μl结合缓冲液，于4℃保存。将菌体超声破碎，取出样品作为总菌；离心后收集上清，取出样品作为上清。

实施例3

tlyp-1-hftn目的重组蛋白的表达与收菌

将阳性重组菌加入至含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃下，210r/min，震荡过夜将菌种活化。以1％的接种量转移至200ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃，210r/min，培养至菌液od600达到0.6-0.8，向培养基加入终浓度为0.5mm的iptg，30℃诱导培养6h。4℃，8000×g，离心5min收集菌体，弃上清，加入5ml的结合缓冲液进行重悬，重悬后再次在相同的条件下离心，弃上清收集菌体，再次重悬于5ml结合缓冲液，4℃保存。

实施例4

tlyp-1-hftn目的重组蛋白的分离纯化

取出菌液将其超声破碎，超声条件为：功率480w，超声3s，间歇4s，共超声25min。4℃，8000×g，离心30min。收集上清置于60℃水浴，10min以除去不耐热的杂蛋白。再次4℃，8000×g，离心30min，获得含有目的蛋白的上清液。由于目的重组蛋白中含有组氨酸标签，因此采用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化。将预装镍柱用5ml无菌水洗两次，加入结合缓冲液洗两次后，将含有目的蛋白的上清液用滤径为0.22μm滤膜过滤后与镍柱结合，放置于旋转培养器上，4℃下低速旋转过夜，使目的蛋白与镍柱充分结合，再用梯度咪唑溶液(5、10、20、250mm)先后洗脱出杂蛋白及目的重组蛋白，并收集洗脱液体经sds-page法分析洗脱液中的蛋白成分。sds-page结果如图所示，结果表明，在250mm咪唑洗脱液中目的重组蛋白含量最大且该咪唑浓度下杂蛋白含量也很少，因此选用250mm咪唑洗脱液用100kda超滤管进行超滤，并将液体置换到gfc缓冲液中，经fplc进一步纯化得到最终目的重组蛋白。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种肿瘤归巢穿膜肽tlyp-1修饰的去铁蛋白纳米笼及其制备方法

<130>2018

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>585

<212>dna

<213>人工序列(去铁蛋白的编码基因的核苷酸序列)

<400>1

tgtggtaataaacgtacccgtggtggtggtggtagcatgactaccgcatcgacaagtcag60

gttcgccagaactaccatcaagatagcgaggccgccatcaaccgccagatcaacctggag120

ttgtatgcttcgtacgtgtatctctctatgagctattactttgaccgtgatgatgttgcg180

ctgaagaactttgccaaatatttcctccatcagtcgcatgaggaacgtgaacatgcagaa240

aaacttatgaagctgcaaaaccaacgcggcggtcgtatctttcttcaggacattaaaaaa300

ccagattgcgacgactgggagtcaggtctcaatgcaatggagtgtgcgctgcatctggaa360

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catttgtgcgattttatcgagacgcactacctgaacgagcaggtcaaagctattaaagaa480

ttgggcgaccatgtaaccaatcttcgcaaaatgggcgccccggaaagcggtctggcggaa540

tatctgttcgataagcacacactgggtgactctgataacgaaagc585

<210>2

<211>195

<212>prt

<213>人工序列(去铁蛋白的氨基酸序列)

<400>2

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151015

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