检测呼吸道合胞病毒感染的分子标志物-TXN基因及其表达产物的制作方法

本发明属于分子诊断领域，涉及检测呼吸道合胞病毒感染的分子标志物，具体涉及检测呼吸道合胞病毒感染的分子标志物-txn基因及其表达产物。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(respiratorysycytialvirus，rsv)属于副粘病毒科肺病毒属，是一种具被膜的非节段单链rna(负链)病毒。它是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒，主要通过呼吸道侵入人体，并通过空气(飞沫、尘埃)传播，病毒主要在鼻咽上皮细胞中增殖。呼吸道合胞病毒是5岁以内儿童病毒性肺炎的最主要病原体，也是婴儿猝死的病因之一。儿童对rsv普遍易感，且再感染率很高。成人急性感染也很常见，老年人可引起严重肺炎，并发展为成人呼吸窘迫综合征(ards)。rsv感染症状主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状。婴幼儿常伴发热，气急。x线胸片常显示明显的支气管肺炎和/或毛细支气管炎表现。在成人和年长儿，感染可能不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染(普通感冒)。多种病毒性肺炎之间依靠临床症状几乎无法区别。在发达国家，有0.5-1.5％的住院婴幼儿死于rsv感染。rsv在老人聚居地易发生暴发性流行，患病率和死亡率极高。全世界每年有6千5百万例感染，16万人死亡。

目前临床使用的检测该病毒的方法主要是免疫学方法，如鼻咽分泌物等标本中特异抗原检测或是血清中抗体检测。常见的快速胶体金法检测时间短，但灵敏度低；免疫荧光法进行抗原检测时对于低浓度感染样本的检测效果不理想[casiano-colon，a.e.，b.b.hulbert，etal.(2003).lackofsensitivityofrapidantigentestsforthediagnosisofrespiratorysyncytialvirusinfectioninadults.jclinvirol28(2)：169-74；rabagliati，r.，m.serri，etal.(2007).utilityofrealtimepolymerasechainreactioninthediagnosisofrespiratorysyncytialvirusinfectionamongadultpatients.revchilenainfectol24(6)：441-5]，需经病毒培养后再进行检测，且对于操作人员要求较高，存在非特异染色等问题。病毒培养又需要有活病毒存在才能实现，且操作繁琐。

通过对患者血清抗体测定来诊断rsv感染，不能为临床医生适时提供诊疗依据。因为体内特异性抗体产生慢，且滴度低，检测的敏感性不高，而且这种检测的免疫学方法反映的是感染的一个间接指标，不能替代直接的病原学检测。因此检测rsv抗原成为了疾病早期诊断的重要途径，但是诊断rsv感染不论是通过血清学方法还是抗原检查，都比较困难，因为病毒滴度在分泌物分钟较低，因此需要开发敏感、特异且实用的早期诊断方法，为临床提供及时和准确的病原检测报告，这对于明确病因，控制疾病的蔓延，采用特异性针对性治疗手段，防止抗生素滥用均有重要意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于呼吸道合胞病毒感染早期诊断的分子标志物。相比传统的呼吸道合胞病毒感染的诊断方法，使用基因标志物来诊断呼吸道合胞病毒感染的具有及时性、特异性和灵敏性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了检测txn基因表达的产品在制备诊断呼吸道合胞病毒感染的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测txn基因表达的产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测txn基因表达水平以诊断呼吸道合胞病毒感染的产品。

进一步，通过rt-pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增txn基因的引物；通过实时定量pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增txn基因的引物；通过免疫检测诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：与txn蛋白特异性结合的抗体；通过原位杂交诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：与txn基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片诊断呼吸道合胞病毒感染的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与txn蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与txn基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，通过实时定量pcr诊断呼吸道合胞病毒感染的产品至少包括一对特异扩增txn基因的引物的序列，其序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种诊断呼吸道合胞病毒感染的工具，所述工具包括检测样本中txn基因表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括能够结合txn基因的核酸或者能够结合txn蛋白的物质。所述核酸能够检测txn基因的表达水平；所述物质能够检测txn蛋白的表达水平。

更进一步，所述核酸包括扩增txn基因的引物，引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为qpcr实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

更进一步，所述物质包括针对txn蛋白的抗体。

进一步，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测txn基因转录水平的针对txn基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的txn蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括txn基因在内的多个基因(例如，与呼吸道合胞病毒感染相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括txn蛋白在内的多个蛋白质(例如与呼吸道合胞病毒感染相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与呼吸道合胞病毒感染的标志物同时检测，可大大提高呼吸道合胞病毒感染诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测txn基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括txn蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测txn基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对txn基因的引物和/或探针。根据txn基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测txn基因表达水平的引物和探针。

与txn基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测txn基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测txn基因的转录水平。

进一步，txn蛋白的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。txn蛋白的抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与txn蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对txn基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。

进一步，本发明提到的样本包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，所述样本是血液。

在本发明的上下文中，“txn基因”包括txn基因以及txn基因的任何功能等同物的多核苷酸。txn基因(nc_000009.12(110243812..110256640,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

在本发明的上下文中，txn基因表达产物包括txn蛋白以及txn蛋白的部分肽。所述txn蛋白的部分肽含有与呼吸道合胞病毒感染相关的功能域。

“txn蛋白”包括txn蛋白以及txn蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括txn蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与txn的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是txn蛋白的融合蛋白。对于与txn蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留txn蛋白的生物学活性即可。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种检测呼吸道合胞病毒感染的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取待试者含有基因组dna的样本；

(2)检测样本中txn基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的txn基因或蛋白的表达水平与是否感染呼吸道合胞病毒关联起来。

(4)与正常对照相比，如果txn基因或蛋白的表达水平显著升高，则代表该待试者感染了呼吸道合胞病毒。

在本发明的上下文中，“诊断呼吸道合胞病毒感染”既包括判断待试者是否已经感染了呼吸道合胞病毒、也包括判断待试者是否存在感染呼吸道合胞病毒的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了txn基因表达与呼吸道合胞病毒感染相关，通过检测txn表达，可以判断待试者是否感染了呼吸道合胞病毒、或者判断待试者是否存在感染呼吸道合胞病毒的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-txn基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现呼吸道合胞病毒感染的早期诊断，从而降低呼吸道合胞病毒感染的死亡率。

附图说明

图1显示利用qpcr检测txn基因在呼吸道合胞病毒感染患者和正常人中的表达差异；

图2显示利用免疫印迹检测txn蛋白在呼吸道合胞病毒感染患者和正常人中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选呼吸道合胞病毒感染患者和正常人中差异表达的基因

1、病例收集人群

医院儿科住院部治疗的患儿(rsv感染组，5例)及儿科生长发育门诊常规体检儿童(对照组，5例)。

2、临床病例筛选标准

2.1rsv感染组纳入标准

(1)年龄：1月-1岁；

(2)既往史：无rsv感染和/或喘息发作；

(3)临床症状：咳嗽和/或喘息和/或呼吸急促；

(4)体格检查：呼吸频率加快/吸气三凹征/肺部听诊哮鸣音或湿啰音；

(5)辅助检查：咽拭子检测rsv抗原阳性；

(6)影像学检查：胸部x片提示支气管炎或支气管肺炎。

2.2对照组纳入标准

(1)年龄：1月-1岁；

(2)既往史：无rsv感染和/或喘息发作；

(3)体格检查：正常；

(4)辅助检查：咽拭子检测rsv阴性。

2.3排除标准

(1)年龄：>1岁；

(2)既往史：rsv感染和/或喘息发作；

(3)辅助检查：其他病毒感染(检测外周血病毒抗体)，如eb病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、衣原体、流感病毒等；

(4)支气管肺发育不良、哮喘、神经系统疾病、遗传性疾病、营养不良等其他可能导致严重并发症的疾病。

3、临床样本标本的收集及预处理

用紫色无菌抗凝真空管抽取2毫升外周静脉血置于4℃条件下保存。血液标本使用tripure试剂预处理并置于-80℃条件储存。

4、血液样本总rna的提取

使用百泰克血液总rna快速提取试剂盒。按照说明书记载的步骤进行rna提取：

(1)裂解细胞。取0.25ml血液样品，用灭菌水按照1:1比例稀释后，加入0.75mltripurelsreagent，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中的细胞。tripurelsreagent和液体样品的终体积比总是3:1。

(2)将裂解后的样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟。

(3)在4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，取上清液转入新的rnasefree离心管中。

(4)每lmlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

(5)在4℃条件下12,000rpm离心10分。样品分为三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新ep管中。

(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。

(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

(8)加500μl去蛋白液re,12,000rpm离心45秒，弃掉废液。

(9)加入700μl漂洗液rw,12,000rpm离心60秒，弃掉废液。

(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。

(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(12)取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50μlrnasefreewater(提前在65-70℃水浴中加热)，室温放置2分钟，12，000rpm离心1分钟。如果需要较多rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外再加30μlrnasefreewater，离心1分钟，合并两次洗脱液。

(13)总rna定量。如果无需立即定量，可将样品贮存于-80℃冰箱中。

5、总rna质检

(1)总rna的纯度。使用nanodrop紫外分光光度计测定，总rna需要稀释100倍上样，然后检测不同波长的吸光度值，记录a230,a260和a280的数值来计算待测总rna的纯度和浓度。待测总rna纯度＝a260/a280，比值范围:1.8-2.0。

(2)总rna的完整性。1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析软件glykobandscan5.0计算28s/18s的比值。

6、片段化rna

illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna是完整的rna序列，平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。

7、反转合成cdna

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。

8、连接adaptor

双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。

9、ung酶消化cdna二链

在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。

10、illuminahiseq2500上机测序

illuminahiseq2500测序平台，进行2*150bp测序。

11、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；

(4)cuffdiff比较对照组跟rsv感染组mrna的表达差异。

12、结果

显著差异mrna筛选条件：fdr<0.01。用以上标准筛选得到以下结果：与正常对照组相比，rsv感染组血液中差异表达mrna为1047个，其中上调的为499个，下调的为548个。

实施例2qpcr实验验证呼吸道合胞病毒感染患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

筛选标准同实施例1，rsv感染组和对照组各30例。

2、血液中总rna的提取

步骤同实施例1。

3、rt-pcr

(1)rt

rt反应体系(20μl)：

rt反应程序：

42℃15min

85℃5s

4℃---

(2)qpcr

pcr反应体系(20μl)：

pcr反应程序：

扩增程序：

设置每个样本3复孔，内参为gapdh。

(3)引物

txn基因和gapdh基因的引物序列如下：

gapdh基因

正向引物：5’-ccacatcgctcagacaccat-3’(seqidno.3)；

反向引物：5’-ggcaacaatatccactttaccagagt-3’(seqidno.4)。

txn基因

正向引物：5’-gatgttgcttcagagtgt-3’(seqidno.1)；

反向引物：5’-tccttattggctccagaa-3’(seqidno.2)。

(4)结果分析

ct值为管内荧光强度由本底达到指数增长阶段时对应的循环数。

公式为样品ct值-内参(gapdh)ct值＝^△ct；样品△ct值-阴性对照△ct＝^△△ct；样品mrna相对值＝2^-△△ct。

(5)数据统计

所有数据以平均值±标准差(mean±sd)显示。方差分析多组数据组间差异。p<0.05为有统计学差异。

4、结果

结果显示，与对照组平均水平相比，30例rsv感染组患者中有29例患者血液中txn基因的mrna水平显著上调。统计结果如图1所示，与对照组相比，rsv感染组患者血液中txn基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果测序实验。

实施例3免疫印迹实验验证呼吸道合胞病毒感染患者和正常人中差异表达基因的表达产物

1、研究对象：同实施例2。

2、单核细胞分离

rsv感染组患者和对照组人群取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚红1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的hbss洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用hbss溶液调整细胞至1×10⁶个/ml备用。

3、单核细胞总蛋白质提取

将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×10⁶个/ml)室温1000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。

4、westernblot检测

用常规方法即可。

5、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用imagej软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果显示，与对照组平均水平相比，30例rsv感染组患者中有29例患者血液中txn蛋白水平显著上调。统计结果如图2所示，与对照组相比，rsv感染组患者血液中txn蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>检测呼吸道合胞病毒感染的分子标志物-txn基因及其表达产物

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gatgttgcttcagagtgt18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tccttattggctccagaa18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccacatcgctcagacaccat20

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggcaacaatatccactttaccagagt26