一种在IBD炎症性肠病中高表达的NCAPD2/NCAPD3序列及其检测方法与流程

本发明涉及一种ncapd2/ncapd3序列及其检测方法，特别是涉及一种在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列及其检测方法，属于细胞分子生物学技术领域。

背景技术：

炎症性肠病ibd是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎uc和克罗恩病cd，ibd病程迁延反复，治疗手段虽多，效果均不理想且预后不佳，严重影响患者生活质量，耗费大量卫生资源且是导致肠道肿瘤的癌前病变之一，研究表明，ibd在既往高发病率的西方国家趋于稳定，而在亚洲国家呈逐渐增加的趋势。

中国ibd诊断存在的最大一个问题是与感染性肠道疾病的鉴别诊断，而最难的是与肠结核的鉴别诊断；近年来有很多报道提出血清学标志物对于ibd的鉴别诊断具有较大价值；欧美国家多数研究表明抗中性粒细胞胞浆抗体anca、人抗酿酒酵母抗体asca约诊断敏感度达60％，特异度达70％；但国际上关于血清标志物诊断的价值在不同种族疾病人群中存在差异，且其他血清标志物(如抗胰腺腺泡抗体pab)尚未应用于我国临床中，其临床价值还有待进一步探讨；因此，寻找并研制能够准确诊断ibd、监测ibd疾病进展状况的临床试剂盒对提高我国ibd患者的临床治疗具有重要意义和价值。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的主要目的是为了提供一种在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列及其检测方法。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列，该ncapd2/ncapd3序列具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。

一种在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列的检测方法，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的长链非编码rna设计并合成出特异性用于lamp检测的特异性引物。

进一步的，特异性引物包括内引物fip和内引物bip和一对外引物f3和b3，其分别为：

内引物fip为pair1上游引物：seqidno.2；

内引物bip为pair1下游引物：seqidno.3；

外引物f3为pair2上游引物：seqidno.4；

外引物b3为pair2下游引物：seqidno.5。

进一步的，包括如下步骤：

步骤1：取血液样本于离心管中，加入细胞裂解液，混匀，室温孵育离心；

步骤2：弃清上清，加入核裂解液，混匀，向裂解物中加入蛋白沉淀液，室温离心，取上清；

步骤3：加入异丙醇溶液，使dna沉淀出现，离心，弃上清；

步骤4：加入等体积的乙醇洗涤沉淀，离心，弃去乙醇，自然挥干，加无核酶水溶解沉淀，吸取dna样品用于dna定量。

进一步的，步骤1中，取300ul血液样本于1.5ml离心管中，加入900ul细胞裂解液，上下颠倒离心管5-6次混匀，室温孵育10min，13000g室温离心30s。

进一步的，步骤2中，加入300ul核裂解液，充分混匀，以裂解细胞，向裂解物中加入蛋白沉淀液100ul，剧烈震荡10-20s，13000g，室温离心3min，取上清。

进一步的，步骤3中，加入300ul异丙醇溶液，来回颠倒2-3次，dna沉淀出现，13000g离心2min，弃上清。

进一步的，步骤4中，加入等体积的70％室温乙醇洗涤沉淀，13000g离心2min，弃去乙醇，置超净台中自然挥干，加100ul无核酶水溶解沉淀，吸取dna样品1ul用于dna定量。

进一步的，反应体系级条件如下：内引物fip：0.8mm；内引物bip：0.8mm；外引物f3：0.2mm；外引物b3：0.2mm；dntps：1.6mm；betaine：1m；反应缓冲液：20mmtris-hcl(ph8.8)；10mmkcl；10mm(nh4)2so4；4mmmgso4；0.1％tritonx-100；bstdnapolymeraselargefragment：8ui；模板dna1ug。

进一步的，模板dna在恒温扩增前95℃反应5min，加入体系后65℃反应60min，形成循环扩增始发物及循环延伸。

本发明的有益技术效果：本发明提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列及其检测方法，为了系统研究与ibd炎症性肠病发生密切相关的ncapd2/ncapd3序列，由20个ibd炎症细胞和配对的15个正常组织标本，取得新鲜的标本后存冻于液氮罐中，集齐后采用t-ucr芯片检测筛选出两条在ibd炎症细胞中高表达的ucr，其中ncapd2/ncapd3显著表达高，其基因序列如seqidno.1所示。

附图说明

图1为发明的ncapd2uc与正常样本比较实验图；

图2为发明的ncapd2uc与正常样本比较实验图；

图3为发明的ncapd2uc与正常样本比较组统计量；

图4为发明的ncapd2uc与正常样本比较独立样本检验表；

图5为发明的ncapd3uc与正常样本比较实验图；

图6为发明的ncapd3uc与正常样本比较实验图；

图7为发明的ncapd3uc与正常样本比较组统计量；

图8为发明的ncapd3uc与正常样本比较独立样本检验表；

图9为发明的ncapd2uc与nc、crc比较实验图；

图10为发明的ncapd2uc与nc、crc比较实验图；

图11为发明的ncapd2uc与nc、crc比较组统计量；

图12为发明的ncapd2uc与nc、crc比较独立样本检验表；

图13为发明的ncapd3uc与nc、crc比较实验图；

图14为发明的ncapd3uc与nc、crc比较实验图；

图15为发明的ncapd3uc与nc、crc比较组统计量；

图16为发明的ncapd3uc与nc、crc比较独立样本检验表。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

在本实施例中，本实施例提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列，该ncapd2/ncapd3序列具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。

在本实施例中，本实施例提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列的检测方法，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的长链非编码rna设计并合成出特异性用于lamp检测的特异性引物，特异性引物包括内引物fip和内引物bip和一对外引物f3和b3，其分别为：

内引物fip为pair1上游引物：seqidno.2；

内引物bip为pair1下游引物：seqidno.3；

外引物f3为pair2上游引物：seqidno.4；

外引物b3为pair2下游引物：seqidno.5。

引物序列如下表1所示：

表1引物序列

在本实施例中，本实施例提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：取300ul血液样本于1.5ml离心管中，加入900ul细胞裂解液，上下颠倒离心管5-6次混匀，室温孵育10min，13000g室温离心30s；

步骤2：弃清上清，加入300ul核裂解液，充分混匀，以裂解细胞，向裂解物中加入蛋白沉淀液100ul，剧烈震荡10-20s，13000g，室温离心3min，取上清；

步骤3：加入300ul异丙醇溶液，来回颠倒2-3次，dna沉淀出现，13000g离心2min，弃上清；

步骤4：加入等体积的70％室温乙醇洗涤沉淀，13000g离心2min，弃去乙醇，置超净台中自然挥干，加100ul无核酶水溶解沉淀，吸取dna样品1ul用于dna定量。

在本实施例中，本实施例提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列的检测方法，其反应体系级条件如下：内引物fip：0.8mm；内引物bip：0.8mm；外引物f3：0.2mm；外引物b3：0.2mm；dntps：1.6mm；betaine：1m；反应缓冲液：20mmtris-hcl(ph8.8)；10mmkcl；10mm(nh4)2so4；4mmmgso4；0.1％tritonx-100；bstdnapolymeraselargefragment：8ui；模板dna1ug；模板dna在恒温扩增前95℃反应5min，加入体系后65℃反应60min，形成循环扩增始发物及循环延伸。

图1-图4为本发明的ncapd2uc与正常样本比较实验图、组统计量及独立样本检验表；图5-图8为本发明的ncapd3uc与正常样本比较实验图、组统计量及独立样本检验表；图9-图12为本发明的ncapd2uc与nc、crc比较实验图、组统计量及独立样本检验表；图13-图16为本发明的ncapd3uc与nc、crc比较实验图、组统计量及独立样本检验表。

综上所述，在本实施例中，本实施例提供的在ibd炎症性肠病中高表达的ncapd2/ncapd3序列及其检测方法，由20个ibd炎症细胞和配对的15个正常组织标本，取得新鲜的标本后存冻于液氮罐中，集齐后采用t-ucr芯片检测筛选出两条在ibd炎症细胞中高表达的ucr，其中ncapd2/ncapd3显著表达高。其基因序列如seqidno.1所示。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。