短双歧杆菌c11及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)C11及其用途。本发明短双歧杆菌C11(CCFM683)能够有效改善小鼠腹泻、大便隐血、便血等结肠炎症状，并能够抑制疾病活动指数(DAI)的升高，改善小鼠结肠长度的变化，显著减低髓过氧化物酶(MPO)活性，可以制备用于预防和治疗肠道炎症的药物或者用于生产益于肠道健康的食品。CGMCC No. 1182820151204
【专利说明】短双歧杆菌C11及其用途 【技术领域】
[0001 ]本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)Cll的用途。 【【背景技术】】
[0002] 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一组慢性、复发性肠道炎症疾 病，分为溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's Disease，⑶），发病 机理尚不明确。目前对IBD发病机理的研究普遍认为IBD可能与易感基因、粘膜免疫、肠道微 生物和环境四个因素有关，且粘膜免疫在IBD发病过程中具有重要地位。近年来，随着人们 生活水平的改变以及饮食结构的变化，该病在我国的患病率正逐年上升。
[0003] IBD严重影响人们生活质量和身体健康，耗费卫生资源。目前IBD的治疗药物包括 抗生素、氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂(6-MP，AZA，MTX)和生物制剂（infliximab) 等，但副作用大，难以实现长期治疗，如生物制剂infliximab通常选用TNF-α单克隆抗体，尽 管能有效达到IBD治疗目标，但使用inf 1 iximab常见的不良反应有感染、充血性心力衰竭、 自身免疫反应、神经系统病变、肝损害、恶性肿瘤等，所以需寻找新的IBD预防和治疗新方 法。
[0004] 肠道微生物与人体健康息息相关，且被形象的称为"微生物器官"。利用肠道益生 菌来预防和治疗肠道疾病越来越受到关注。例如中国发明专利申请CN 102210717 A公开了 含有与丹宁组合的一种或多种产生丹宁酶的乳杆菌菌株的组合物，所述菌株具有粘附到肠 粘膜上的能力，该组合物可以用于治疗IBD。
[0005] 肠道益生菌可通过调节粘膜免疫系统，增强肠上皮细胞间的紧密连接，降低肠道 通透性，抑制肠上皮细胞凋亡，改善肠道物理屏障功能，调节肠道菌群平衡等作用来减轻肠 道炎症。乳酸菌是存在于人体肠道内的益生菌，近年来，乳酸菌对结肠炎治疗的研究报道有 增无减，且产生着积极的影响。
[0006] 中国发明专利申请CN 102711778A公开了一株动物双歧杆菌乳亚种DN-173010,并 通过TRUE小鼠实验和组织学研究验证了其发酵乳能减轻溃疡性结肠炎。然而，该申请仅通 过组织学、通过小鼠结肠炎改善结果一个指标进行表征，这种检验方式及指标受人为认知 的影响较大，存在主观因素。此外，该申请在实施时给小鼠灌胃含有培养基组分的乳双歧杆 菌组合物，因此，培养基的复杂组分对其结果造成的影响也必须被考虑。 【
【发明内容】
】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术缺陷，获得一株具备改善结肠炎特别是的短双歧杆 菌C11，其具备降低结肠炎后小鼠结肠病理评分、降低结肠炎后小鼠结肠粘液层破坏、上调 抑炎性因子并下调促炎性因子转录并对免疫有调节作用。
[0008] 为了实现以上目的，本发明提供一株短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Cll，该 菌株已于2015年12月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏 号为CGMCC No.11828。
[0009]这株短双歧杆菌Cl 1也被命名为CCFM683,留存于江南大学食品生物技术菌种保藏 中心。
[0010]本发明的菌株经分离、筛选后，采用了包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引 物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤进行种属鉴定，鉴定为短双歧杆菌，并 命名为短双歧杆菌C11 (或CCFM683)。
[0011]短双歧杆菌C11具有下述生物学特性：
[0012] 菌体特征:呈乳白色。
[0013] 菌落特征：在mMRS固体平板上菌落突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为1~ 2mm
[0014] 生长特性:在37°C恒温厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约24h达到对数末期。
[0015] 短双歧杆菌是双歧杆菌属中的一种。双歧杆菌属共包含35个种，包括青春双歧杆 菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳酸亚种（即乳双歧杆菌）、两歧双歧杆菌、熊峰 双歧杆菌、布姆双歧杆菌、短双歧杆菌、链双歧杆菌、豚双歧杆菌、棒状双歧杆菌、家兔双歧 杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚 种、大双歧杆菌、最小双歧杆菌、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌假长亚种、假长双歧杆菌球 旋虫亚种、小鸡双歧杆菌、细长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等。
[0016] 由于双歧杆菌属种类繁多，同属不同种的双歧杆菌在形态、生理、代谢及生理功能 等多方面存在显著差异，目前为止，尚未有研究发现短双歧杆菌能够改善炎症性肠病特别 是溃疡性结肠炎或克罗思病，仅少数同属不同种的菌株具备相似用途。目前也尚未有研究 确定导致差异的原因或机理。
[0017] 本发明还提供短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Cll在制备用于治疗或预防 炎症性肠病的药物中的用途。
[0018] 特别地，所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克罗思病。
[0019] 溃疡性结肠炎(UC)是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性 疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠， 甚至整个结肠。病程漫长，常反复发作。克罗恩病(CD)是一种原因不明的肠道炎症性疾病， 在胃肠道的任何部位均可发生。克罗恩病临床表现为腹痛、腹泻、肠梗阻，伴有发热、营养障 碍等肠外表现。克罗恩病尚无根本的治愈方法，还会出现并发症，需手术治疗，而术后复发 率很高。
[0020] 优选地，所述药物还包括在药学上可接受的载体和/或辅料。
[0021] 本发明的药物含有短双歧杆菌C11菌剂，所述菌剂是将含有所述短双歧杆菌C11的 菌液通过冷冻干燥制备所得到的粉剂，所述粉剂含有l〇 1()CFU/g以上短双歧杆菌Cl 1。
[0022] 在本发明中，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充 剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂的载体。
[0023] 根据本发明，所述的填充剂应该理解是一种用来增加药物与载体重量和体积，以 利于将它们压制成片剂的稀释剂;或者应该理解是用以吸收药物与载体中多余液体成分的 辅料吸收剂。凡是具有这种性能而又不会影响本发明菌剂效果的物质都可以用于本发明， 也都在本发明保护范围之内。具体地，本发明使用的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或 微晶纤维素，优选地选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素，更优选地选自淀粉或微晶纤维素。
[0024] 根据本发明，所述的润湿剂应该理解是一种在药物本身无粘性时能够使其药物润 湿并诱发其具有粘性，故能够制成颗粒的液体。凡是具有这种性能而又不会影响本发明菌 剂效果的物质都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。具体地，本发明使用的润湿 剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆，优选地选自水、乙醇或淀粉，更优选地选自水或淀粉。
[0025] 根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够促进片剂在胃肠液中快速崩解成 细小粒子的辅料。凡是具有所述这种性能而又不会影响本发明菌剂效果的物质都可以用于 本发明，也都在本发明保护范围之内。具体地，本发明使用的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟 丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠，优选地选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤 维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠，更优选地选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联 羧甲基纤维素或碳酸氢钠。
[0026] 根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当药物本身无粘性或粘性不足时需要加入 一种粘性物质以便将其药物制成颗粒剂，这种粘性物质称为粘合剂。凡是具有所述这种性 能而又不会影响本发明菌剂效果的物质都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。 具体地，本发明使用的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮，优选地 选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮，更优选地选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
[0027] 根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种在制粒过程中能够提高片剂流动性， 防止片剂粘附在制片机上，有利于片剂脱模的物质。凡是具有所述这种性能而又不会影响 本发明菌剂效果的物质都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。具体地，本发明使 用的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇，优选地选自滑石粉、硬 脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇，更优选地选自滑石粉或硬脂酸钙。
[0028] 根据本发明，所述的矫味剂应该理解是一种在药品中用以改善或屏蔽药物不良气 味和味道(例如强烈苦味或其它异味等)的辅料。凡是具有这种性能而又不会影响本发明菌 剂效果的物质都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。具体地，本发明使用的矫味 剂选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆甜味剂;柠檬、茴香、薄荷油芳 香剂;海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠胶浆剂;枸橼酸、酒石酸与碳 酸氢钠混合物泡腾剂，优选地选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆、樱桃糖浆甜味剂;柠檬、薄荷油 芳香剂;海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、羧甲基纤维素钠胶浆剂;酒石酸与碳酸氢钠混合物泡腾 剂，更优选地选自蔗糖、橙皮糖浆、樱桃糖浆甜味剂;柠檬芳香剂;海藻酸钠、阿拉伯胶胶浆 剂;酒石酸与碳酸氢钠混合物泡腾剂。
[0029] 在本发明中，填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂的用量应该根据实 际使用的需要进行确定，这些对于制药技术领域的技术人员而言是不存在任何技术困难 的。
[0030] 在本发明中，所述的药物的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
[0031] 本发明的短双歧杆菌C11菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各 种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可 以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的技术 人员都是容易确定的，也是显而易见的。
[0032] 所述的剂型一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所 需药物量的预定活性物质，例如本发明的短双歧杆菌C11菌剂。
[0033]此外，本发明还提供短双歧杆菌C11在食品添加剂中的用途，特别地作为食品发酵 剂。
[0034]本发明证实短双歧杆菌Cl 1 (CCFM683)能够有效改善小鼠腹泻、大便隐血、便血等 结肠炎症状，并能够抑制疾病活动指数(DAI)的升高，改善小鼠结肠长度的变化，与现有技 术相比还具有显著减低髓过氧化物酶(ΜΡ0)活性，还可调节结肠免疫系统稳态，包括上调抑 炎性细胞因子IL-10及核转录因子PPARy的mRNA转录量，并显著下调促炎性细胞因子IL-1 f3、IL-6及核转录因子NF-κΒ p65和TNF-α的mRNA水平，表现出对溃疡性结肠炎和克罗恩病更 好的治疗或预防效果，因此可以制备用于预防和治疗肠道炎症的药物。
[0035] 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Cll，该菌株于2015年12月04日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 11828。 【【附图说明】】
[0036] 图1表示各组造模期间疾病活动指数的变化，表明短双歧杆菌C11显著降低小鼠的 疾病活动指数；
[0037] 图中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0038] 图2表示各组结肠长度的变化，表明短双歧杆菌C11改善DSS诱导结肠炎后小鼠结 肠长度变化；
[0039] 图中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0040] 图3表示各组髓过氧化物酶(ΜΡ0)活力的变化，表明短双歧杆菌Cl 1显著降低ΜΡ0活 力；
[0041] 图中：ns:P>0.05，*:P〈0.05，**:P〈0.01，***:P〈0.001。
[0042] 图4表示各组结肠组织HE染色（图4-A，图4-B，图4-C)及组织损伤评分（图4-D)， [0043] 图4-A:正常组；
[0044] 图4-B:造模组；
[0045] 图4-C:短双歧杆菌C11处理组；
[0046]图4-D:短双歧杆菌C11显著降低DSS诱导结肠炎后小鼠结肠病理评分；
[0047] 图中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0048] 图5表示各组结肠组织阿利新蓝染色（图5-Α，图5-Β，图5-C)
[0049] 图5-Α:正常组；
[0050] 图5-Β:造模组；
[0051 ] 图5-C:短双歧杆菌C11处理组；
[0052]图6表示短双歧杆菌C11改善肠道组织的紧密连接蛋白的合成；
[0053] 图7表示短双歧杆菌C11调节肠道免疫应答；
[0054] 图中：ns:P>0.05，*:P〈0.05，**:P〈0.01，***:P〈0.001。 【【具体实施方式】】
[0055] 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
[0056]在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度或比例的"％"或百分比均为重量百分 比。
[0057]本发明涉及以下培养基：
[0058] mMRS液体培养基:胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二 铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温801mL与0.5g半 胱氨酸，加水至l〇〇〇mL。
[0059] mMRS固体培养基是在以上基础添加以液体培养基总重计1.5%琼脂得到的。
[0060] 实施例1:短双歧杆菌C11(CCFM683)采集、分离和鉴定
[0061] 于无锡市第九人民医院采集新生儿粪便样品。取lg新生儿粪便样品，梯度稀释后 涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下在37 °C下培养72h，观察记录菌落形态，挑去菌落 划线纯化，然后在mMRS液体培养基中在37°C下培养48h，所得菌落进行革兰氏染色并记录菌 株形态，弃除菌落中的革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌，经过 过氧化氢酶分析后弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株，以果糖-6-磷酸激 酶检测以弃除阴性菌株，所得均经过16S rDNA测序鉴定为短双歧杆菌。所得短双歧杆菌进 行传代培养，收集菌体置于离心管中3000rpm离心10min洗涤，重复3次，所得菌体加入基体 保护剂中进行冷冻保存，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号为CGMCC No.11828
[0062] 16S rDNA 扩增条件：95°C5min;35 个循环（95Γ3〇8,55Γ3〇8,72Γ2π?η);72Γ 10min
[0063] 扩增引物：
[0064] 27F:(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）
[0065] 1492R:(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'
[0066] 扩增产物纯化和序列比对过程按文献（Turroni F et al .Exploring the Diversity ofthe Bifidobacterial Population in the Human Intestinal Tract[J] .Appl Environ Microb. 2009;75(6) :1534-45)记载的方法进行。
[0067] 该短双歧杆菌(Bifidobacterium breve Cl 1(CCFM683))的基本特性见表l〇
[0068] 表1短双歧杆菌C11(CCFM683)的基本特性
[0069]
[0070]
[0071]实施例2:短双歧杆菌C11(CCFM683)改善DSS诱导的结肠炎的动物实验 [0072] 1、实验动物
[0073] 6-8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠24只（购自苏州苏普思生物科技有限公司），在22 ±2°C、自由取食、自由饮水和12h昼夜交替的条件下饲养，所用饲料为苏州双狮实验动物饲 料科技有限公司生产的小鼠繁殖配合饲料，普通饮食饲养适应一周后进行实验。
[0074] 2、短双歧杆菌CCFM683培养
[0075] (1)活化培养：
[0076] 采用mMRS液体培养基，37°C厌氧工作站中静置培养。
[0077] 培养目标:取冷冻保存的菌体，挑单菌落于液体mMRS液体培养基中，在37°C厌氧工 作站中静置培养约24h，活化短双歧杆菌C11。
[0078] (2)-级培养：
[0079] 采用mMRS液体培养基，37°C厌氧工作站中静置培养。
[0080] 培养目标:将活化培养的短双歧杆菌Cl 1以培养基体积计1 %接种量转接至mMRS液 体培养基，传两代。
[0081] (3)二级培养：
[0082]培养基及培养条件同一级培养。
[0083]将经过一级培养的短双歧杆菌Cl 1以培养基体积计1 %接种量转接至1L mMRS液体 培养基中，37 °C厌氧工作站中静置培养约24h，收集菌体。用pH 7.4的PBS洗涤两遍，接着重 悬于浓度以重量计13%脱脂乳溶液中，活菌数为1 X 101()CFU/mL，用于后续试验。
[0084] 3、实验方法
[0085] (1)结肠炎小鼠模型的建立
[0086] C57BL/6J小鼠自由饮用2%DSS(葡聚糖硫酸钠，Mff:36000-50000,购自MP公司）溶 液，连续7天。
[0087] (2)实验分组及给药
[0088] 将24只C57BL/6J小鼠随机分为3组，即正常组，模型组和短双歧杆菌C11(CCFM683) 处理组，每组8只。短双歧杆菌Cl 1处理组给药方式为灌胃，灌胃剂量为2 X 109CFU/200yL/ 只/天。C11处理组在造模前7天开始每天灌胃短双歧杆菌C11，直到实验结束(含造模过程）， 连续14天，正常组和模型组均灌胃重悬后的13%脱脂乳粉作为对照，连续14天，至实验结 束。
[0089] (3)指标测定
[0090] I.小鼠造模期间，观察小鼠进食、活动状态、毛发整齐程度，每日称量体重，观察粪 便性状及检测粪便隐血情况按照文献(Murthy SNS，DigDis Sci，1993)进行疾病活动指数 (DiseaseActivity Index，DAI)评分，DAI =体重下降分数+大便性状+便血分数，具体评分 标准见表1。
[0091] 表1:DAI评分标准
[0092]
[0093] 表中：
[0094] *正常大便:成形大便;松散大便:不粘附于肛门的糊状、半成形大便;稀便:可粘附 于肛门的稀水样便；
[0095] #便血情况：鼠粪便正常者为便血阳性，粪便呈红色或褐色者为肉眼血便，对肉眼 血便不明显又可疑隐血者，用四甲基联苯胺检测隐血情况。
[0096] Π ·处死小鼠，取结肠，测量结肠长度;取远端结肠 lcm于Carnoy's Solution固定、 常规组织脱水、石蜡包埋、切片、H&E染色;根据组织学损伤评分标准(Murthy SNS，Dig Dis Sci，1993)对结肠进行组织学损伤评分，具体评分标准见表2Xarnoy's Solution固定后的 结肠组织采用改良Steedman法(Steedman HF，Q J Microsc Sci，1950)进行阿利新蓝和核 固红染色，对结肠的粘液层进行分析，最终粘液层染成蓝色，而细胞核则染为红色，如图4、5 所示。
[0097]表2:组织学损伤评分标准 [0098]
[00"] m ·结肠样品髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，ΜΡ0)测定
[0100] 按照由南京建成生物工程研究所有限公司销售的ΜΡ0试剂盒使用说明书描述的方 法进行测定。
[0101] IV.处死小鼠后取lcm结肠样品放入液氮，再转入-80°C下保存，待用；用TRIzol (购 自美国Invitrogen公司）提取结肠样品总RNA，取lyg RNA按照PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明书进行反转录，参照iTaq? Universal_SYB.R?Green Supermix的说明书准备实时焚光定量体系，用Bio-Rad CFX Connect? Real-time System 进行实时荧光定量PCR分析，同时通过溶解曲线和扩增曲线评估RT-qPCR数据的质量。
[0102] qPCR程序如下：50°C2min;95°C10min;40个循环（95°C15s，60°C30s);95°C15s，所 检测基因引物序列见表3,数据用2- AA5i(Li-Xuan 3&即，111^1〇1.5(^，2014)分析。
[0103] 表3: RT-qPCR引物序列表
[0104]
[0105] 4、实验结果
[0106] (1)短双歧杆菌CCFM683显著降低小鼠的疾病活动指数
[0107] 通过日常称量小鼠体重，观察小鼠粪便性状、检测粪便隐血及肉眼血便情况，根据 疾病活动指数评分标准得到的结果列于图1。
[0108] 造模期间，正常组小鼠活泼好动，毛发光亮，体重持续增长，大便正常;模型组小鼠 第三天开始大便开始松散，大便开始出现褐红色血迹，体重下降，并随着造模时间的推移， 模型组小鼠体重持续下降，大便不成形，且粘附于肛门，肉眼血便，且肛门出现红色的血迹； 短双歧杆菌C11(CCFM683)处理组与模型组相比，上述临床症状显著改善，显著降低了DAI评 分，具体结果参见附图1。
[0109] (2)短双歧杆菌Cl 1 (CCFM683)改善DSS诱导的小鼠结肠组织病变
[0110] -方面，DSS结肠炎模型有结肠缩短、水肿等特征，结肠长度的缩短在一定程度上 可以作为反映炎症严重程度的一个指标。观察各组结肠长度的变化，短双歧杆菌CCFM683改 善DSS诱导结肠炎后小鼠结肠长度变化结果列于附图2中。
[0111] 附图2表明，模型组小鼠与正常组相比对肠长度明显缩短，短双歧杆菌CCFM683可 良好地抑制这种结肠缩短的趋势。
[0112] 另一方面，髓过氧化物酶活性反映了中性粒细胞侵润数目和活性，已被公认为评 价炎症严重程度的一个指标。各组髓过氧化物酶(ΜΡ0)活力的变化，短双歧杆菌CCFM683显 著降低髓过氧化物酶活力结果列于附图3。
[0113] 附图3表明模型组髓过氧化物酶活力较正常组明显增加，而短双歧杆菌CCFM683处 理组较造模组显著下降，说明短双歧杆菌CCFM683能有效减轻结肠组织的中性粒细胞浸润。
[0114] 在处死小鼠后取各组每只小鼠远端结肠样本，H&E染色考察各组小鼠病变病理情 况，其结果列于附图4A。如图4A所示，正常组小鼠粘膜上皮排列整齐，隐窝腺体明显完整，无 炎性细胞浸润；图4B显示，DSS诱导的结肠炎组织病变主要表现为溃疡形成，粘膜上皮细胞 变性坏死脱落、缺损最严重者可达肌层，并伴有大量炎性细胞浸润，隐窝腺体变形或消失， 粘膜下层和肌层有不同程度的血管扩张充血和细胞浸润；图4C显示，通过病理切片和组织 损伤评分可以看出，短双歧杆菌CCFM683可显著抑制上述症状，保护了上皮结构，减轻了炎 症细胞浸润和水肿程度。
[0115] 以上结果清楚表明，短双歧杆菌C11(CCFM683)显著降低DSS诱导结肠炎后小鼠结 肠病理评分。
[0116] 各组结肠组织的粘液层通过阿利新蓝染色进行考察，结果列于图5。如图5-A所示， 正常组小鼠的粘液层几乎布满于所有粘膜上皮细胞的间隙，图5-B显示DSS处理后，粘膜上 皮席间间隙的粘液层几乎完全消失，而图5-C显示短双歧杆菌CCFM683可极大程度保留粘液 层，这些结果清楚表明，短双歧杆菌CCFM683显著降低DSS诱导结肠炎后小鼠结肠粘液层破 坏。
[0117] (3)短双歧杆菌CCFM683改善DSS引起的肠道组织的紧密连接蛋白破坏
[0118] 短双歧杆菌CCFM683调节肠道紧密连接蛋白结果列于附图6中。
[0119] 根据前述指标测定IV，与正常组相比，模型组的紧密连接蛋白Claudin 3、Z01、 CDH1的转录水平显著下降，表明结肠组织的致密程度受到破坏，而短双歧杆菌CCFM683抑制 了紧密连接蛋白转录水平下降的趋势，甚至在一定程度上增加紧密连接蛋白的表达水平 (表现在处理组的Claudin 3、Z01表达量显著高于正常组），表明短双歧杆菌CCFM683除治疗 用途以外、能够提高正常肠道的紧密程度，更好地维护宿主的肠道屏障。
[0120] (4)短双歧杆菌CCFM683改善DSS引起的肠道免疫应答紊乱
[0121] 根据前述步骤IV，短双歧杆菌CCFM683调节肠道免疫应答结果列于附图7中。
[0122] 与正常组相比，模型组的核转录因子NF-κΒ p65及促炎性细胞因子IL-6、IL_li3、 TNF-α显著升高，而短双歧杆菌CCFM683有效地抑制了这种上升趋势、其表达量与正常组基 本一致，并显著降低了核转录因子NF-kB p65及促炎性细胞因子IL-6、IL-lf3、TNF-c^mRNA 的转录水平，且短双歧杆菌CCFM683促进核转录因子PPAR γ及抗炎细胞因子IL-10的上调。
[0123] 总体表明，短双歧杆菌CCFM683能通过显著上调抑炎性因子并下调促炎性因子转 录实现改善炎症反应，并对免疫有一定的调节作用，最终体现为对结肠炎具有较显著的缓 解效果。
[0124] 以上实验结果表明，短双歧杆菌Cl 1 (CCFM683)能有效改善小鼠腹泻、大便隐血、便 血等结肠炎症状，并能够抑制疾病活动指数(DAI)的升高，改善小鼠结肠长度的变化，显著 减低髓过氧化物酶(ΜΡ0)活性，显著优于现有技术。结肠病理切片结果表明，短双歧杆菌 CCFM683可显著改善DSS引起的小鼠结肠的病理损伤，有效降低炎性细胞浸润、上皮细胞紊 乱程度和隐窝破坏。RT-qPCR结果表明，短双歧杆菌CCFM683还可调节结肠免疫系统稳态，包 括上调抑炎性细胞因子IL-10及核转录因子PPARy的mRNA转录量，并显著下调促炎性细胞 因子IL-10、IL-6及核转录因子NF-κΒ p65和TNF-a的mRNA水平。
[0125] 综上所述，短双歧杆菌CCFM683可显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎，它可以制备用 于预防和治疗肠道炎症的药物或保健品，或者生产益于肠道健康的食品，例如作为益生菌 饮料、酸豆奶、发酵果冻、发酵茶饮料或乳制品（如酸奶、奶酪制品、乳酸菌、奶粉）的食品添 加剂等。
[0126] 应用实施例1:制备含有短双歧杆菌CCFM683菌剂的片剂
[0127] 具体制作工艺基本步骤如下:菌种活化-扩大培养-收集菌体-菌悬液制备-冷 冻干燥-总混-压片
[0128] 1、菌种活化:短双歧杆菌CCFM683以培养基体积计1 %的接种量在mMRS液体培养基 中在37 °C厌氧工作站中静置培养，连续活化两代。
[0129] 2、扩大培养:将活化的短双歧杆菌CCFM683以培养基体积计1 %的接种量转接到1L mMRS液体培养基中进行扩大培养，在37°C厌氧工作站中静置培养24h。
[0130] 3、收集菌体、制备菌悬液：扩大培养结束后，在4 °C低温离心收集菌体，用PBS (pH7.4)洗涤两次后，用以重量计13 %脱脂乳水溶液制成101()CFU/mL的菌悬液。
[0131 ] 4、冷冻干燥:根据常规冷冻干燥工艺制成菌粉。
[0132] 5、总混:加入以菌粉总重计2 %硬脂酸作润滑剂，3 % CMC-Na作粘合剂，混匀。
[0133] 6、压片:根据常规压片工艺通过压片机压片。
[0134] 应用实施例2:制备含有短双歧杆菌CCFM683菌剂的粉剂
[0135] 具体制作工艺基本步骤如下:菌种活化-扩大培养-收集菌体-菌悬液制备-冷 冻干燥
[0136] 菌种活化、扩大培养、收集菌体、制备菌悬液步骤如前所述。
[0137] 冷冻干燥:根据常规冷冻干燥工艺制成冻干菌体粉剂。
【主权项】
1. 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Cl 1在制备用于治疗或预防炎症性肠病的药 物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克罗 思病。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物还包括在药学上可接受的载体和/ 或辅料。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物含有短双歧杆菌C11菌剂，所述 菌剂是将含有所述短双歧杆菌C11的菌液通过冷冻干燥制备所得到的粉剂，所述粉剂含有 10 1QCFU/g以上短双歧杆菌C11。5. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自 在药学上通常使用的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂的载体。6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、 丸剂或口服液。7. 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)C11在食品添加剂中的用途。8. 根据权利要求6所述的用途，所述食品添加剂是发酵剂。
【文档编号】A61K35/745GK106038611SQ201610546786
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】陈卫, 陈海琴, 杨波, 王俊通, 赵建新, 张灏, 陈永泉
【申请人】江南大学