日本医蛭制剂的制备方法及其制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了日本医蛭制剂的制备方法，包括冷冻、干燥和粉碎步骤，冷冻步骤中，冷冻的温度为?80~?4℃之间，冷冻的时间为12~120h；干燥步骤中，采用真空冷冻干燥；粉碎步骤中，采用超微粉碎。本发明要解决的技术问题是提供一种抗凝血活性高、有效成分溶出率高的日本医蛭制剂的制备方法及其制剂。
【专利说明】
曰本医蛭制剂的制备方法及其制剂
技术领域
[0001] 本发明涉及医用配置品领域，具体涉及一种日本医蛭制剂的制备方法及其制剂。
【背景技术】
[0002] 日本医蛭为医蛭科医蛭属的动物，俗名稻田医蛭、蚂蝗、线蚂蝗、水蛭、日本医水 蛭;分布于日本、俄罗斯的远东地区、蒙古以及中国大陆的北起东北各省、内蒙古、西至四 川、甘肃、南达广东等地，一般栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中以及特别是 常年积水或排水不良的怄田和畈心田中数量最多。
[0003] 水蛭之名始于《神农本草经》，载："水蛭，味咸、平。主逐恶血;瘀血月闭，破血瘕积 聚，无子;利水道。生池泽。"已有两千余年的药用史，是一味传统的活血化瘀动物药。《中国 药典》2015年版收载的三个种分别为:蚂蟥（ZfAitffla/jia j〇i>ra ZfAitffla/?)、日本医輕(Z/iiWo fiifloo/jica 或柳叶妈蛾（ZfAitffla/jia aora/3t/_/aie 的干燥全体入药。日本 医蛭作为中药在我国已有两千多年的药用史，其性味咸、苦、平;有小毒，归肝经，具有破血、 逐瘀、通经之功效，临床广泛用于脑血栓形成、高血脂等抗凝血的治疗。在被收载的三种药 材中，日本医輕/3iA〇o/3ica )为嗜血輕类，其抗凝血活性最强，抗凝血药 理作用已得到非常详尽的研究，已明晰其抗凝血物质基础一一蛋白质（如水蛭素等）。切丝、 切段或全体风干干燥入药是《药典》采用的常规方法，由于抗凝血物质对高温及机械条件敏 感，极易造成蛋白质变性失活，影响抗凝血活性。近年来，因农业上肆意使用化肥农药，农田 水质整体下降造成野生水蛭资源严重枯竭，加之人工养殖技术尚不成熟，日本医蛭资源需 求量较大，致使资源量已处于供不应求的状态。目前，临床上脉血康胶囊是以日本医蛭为原 料，其生产工艺中采用30°C_55°C的热干燥及常温机械粉碎的处理方式，使抗凝血酶活性大 大降低，另外，由于医蛭为软体动物，全体主要为蛋白质成分构成，韧性强，按传统干燥、粉 碎工艺只能将其粉碎成3-5mm大小的组织颗粒，无法进一步粉碎成细粉，因此，有效成分转 移率不高、溶出偏低，对药材造成极大的浪费;再者，日本医蛭原料腥臭味较重，易引起反胃 败胃，给患者带来很多不适应性。
[0004] 中国发明专利，申请号为201010595610.2的一种水蛭为原料的肠溶胶囊的制备方 法，其公开了先冷冻鲜活水蛭，再用组织捣碎机捣碎，再真空干燥粉碎的方式，但是，本发明 人研究发现，虽然冷冻后再捣碎可控制抗凝血活性的降低，但是粉碎和干燥的过程中，会再 次导致抗凝血酶的活性大大降低，另外，此发明还增加药用辅料混合，使得使用者服用了无 药效的辅料，限制了日本医蛭的药效发挥。
[0005] 综上所述，如何较好地保存其内在药效成分、提高有效成分溶出率、提高抗凝血活 性等药效学指标是日本医蛭制剂亟需解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种抗凝血活性高、有效成分溶出率高的日本医 蛭制剂的制备方法及其制剂。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：日本医蛭制剂的制备方法，包 括冷冻、干燥和粉碎步骤， 冷冻步骤中，冷冻的温度为-80-4 °C之间，冷冻的时间为12~120h; 干燥步骤中，采用真空冷冻干燥； 粉碎步骤中，采用超微粉碎。
[0008] 采用本发明技术方案的日本医蛭制剂的制备方法，针对冷冻温度、粉碎工艺、粉碎 温度、干燥工艺进行了研究，以抗凝血酶活性为指标，优选出新的加工工艺方法，其工艺方 法是避免高机械剪切力、高温等因素，保持了日本医蛭的超高活性，抗凝血活性高且有效成 分的溶出率高。另外，本发明在保持高抗凝血酶活性基础上，通过改变及优化干燥、粉碎工 艺参数，解决了日本医蛭原药材微粉化的技术问题，为动物组织入药的高效利用提供了一 种新思路及新方法。
[0009] 进一步，所述的冷冻步骤中，冷冻的温度为-80~_25°C之间。
[0010] 进一步，所述的冷冻步骤中，冷冻的时间为24~72h之间。
[0011] 进一步，所述的干燥步骤中，冷凝温度为-60~-40°c。经实验研究，干燥温度越高， 日本医蛭抗凝血酶活性越低，干燥温度越低，抗凝血酶活性越高，经真空冷冻干燥法处理后 的日本医蛭抗凝血酶活性极强，且达到样品规定含水量所耗时间最短。
[0012] 进一步，所述的粉碎步骤中，粉碎的温度为-25~-4°C之间。实验研究发现，当粉碎 温度低于〇°C以下时，抗凝血酶活性显著提高，与温度成正相关。
[00?3]进一步，所述的粉碎步骤中，粉碎的时间为5~30min之间。超微粉碎作用时间越久 所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利。
[0014] 进一步，所述的粉碎步骤中，粉碎的温度为-10~-4°C之间。虽然当粉碎温度低于0 °C以下时，抗凝血酶活性显著提高，与温度成正相关。但是，在粉碎过程中发现，温度越低对 粉碎设备要求更高，能耗更大。因此，综合考虑对设备要求和抗凝血酶活性，优选粉碎加工 温度范围为-l〇°C至-4°C。
[0015] 进一步，所述的粉碎步骤中，粉碎的时间为10~15min之间。虽然超微粉碎作用时间 越久所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利，但随着粉碎时间的延长，将产生大量 的热量，对抗凝血酶活性将产生一定的影响。同时，整体粉末粒径越小将导致粉体流动性变 差，不利于灌装。
[0016] 本发明还提供另一个技术方案，通过日本医蛭制剂的制备方法制成的制剂，为胶 囊剂，且除胶囊肠衣外含100%日本医蛭。用纯的日本医蛭制成的胶囊剂，不添加药用辅料的 情况下使用者不必多服用无药效的辅料，可以尽可能地保证日本医蛭以高活性地发挥药物 作用。另外，胶囊剂避免由于日本医蛭原料腥臭味较重，引起患者的反胃败胃，给患者带来 很多不适应性。
[0017] 本发明还提供另一个技术方案，通过日本医蛭制剂的制备方法制成的制剂，为片 剂，片剂外包覆有肠衣，且除肠衣外含100%日本医蛭。用纯的日本医蛭制成的带肠衣的片 状，不添加药用辅料的情况下使用者不必多服用无药效的辅料，可以尽可能地保证日本医 蛭以高活性地发挥药物作用。另外，带肠衣的片剂，避免由于日本医蛭原料腥臭味较重，弓丨 起患者的反胃败胃，给患者带来很多不适应性。
【具体实施方式】
[0018] 实验一:前处理方法对抗凝血酶活性的影响 鲜活日本医蛭为软体动物，可自行收缩前后移动，极不利于干燥及开展下一步处理，为 了尽可能地保持日本医蛭的抗凝血酶活性及利于下一步干燥处理，对不同前处理方法进行 了比较研究，具体方法包括前处理、干燥、粉碎后，前处理如试验组1H式验组11，然后用真空 度彡-0.09Mpa、50 °C真空干燥机干燥至含水量彡10%，再用普通粉碎机组将其粉碎5min后， 测定抗凝血酶活性，结果见表1。
[0019] 试验组1:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，用沸水烫死，置阴凉通风处晾干； 试验组2:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，直接用细竹签串起置阴凉通风处晾干； 试验组3:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入冰箱内冷冻直至 彻底僵硬，冷冻温度-4 °C; 试验组4:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入冰箱内冷冻直至 彻底僵硬，冷冻温度-10 °C; 试验组5:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入冰箱内冷冻直至 彻底僵硬，冷冻温度-15 °C; 试验组6:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-25 °C ; 试验组7:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-35 °C ; 试验组8:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-45 °C ; 试验组9:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-55 °C ; 试验组10:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-65 °C ; 试验组11:鲜活日本医蛭在清水中洗净后，均匀地置于装量瓶中，放入低温冰箱内冷冻 直至彻底僵硬，冷冻温度-80 °C ; 表1
从表1可以看出：鲜活日本医蛭经沸水烫死或自然风干死亡均不利于保持其抗凝血酶 活性，且发现动物体完全僵硬干燥时耗费时间达8天以上，周期长，不利于实际大生产。利用 低温冷冻方法后，抗凝血酶活性得到较好保持，试验组3~试验组11的抗凝血酶活性均显著 性优于试验组1和试验组2;动物全体僵硬时间随冷冻温度的降低而变短，考虑到实际大生 产对设备的要求及动物全体僵硬时间，兼顾抗凝血酶活性，选取冷冻温度范围为-80°C~-25 Γ。
[0020] 实验二:干燥工艺的研究 取鲜活日本医蛭，在清水中洗净，筛网过滤，放入冷冻盘中摊开，在温度为-25°c条件下 低温冷冻24h后；取冷冻僵硬的日本医蛭，采用不同方法进行干燥，干燥完成后在干燥完成 后普通中药材粉碎机粉碎5min，按中国药典2015年版水蛭项下抗凝血酶活性测定方法进行 测定，比较不同干燥方式对活性成分的影响。
[0021] 干燥方法组别设定： 试验组1:普通干燥箱60°C恒温干燥至含水量< 10%; 试验组2:普通干燥箱50°C恒温干燥至含水量< 10%; 试验组3:30 °C真空干燥，真空度彡-0.09MPa，至含水量彡10%; 试验组4:40 °C真空干燥，真空度彡-0.09MPa，至含水量彡10%; 试验组5:50 °C真空干燥，真空度彡-0.09MPa，至含水量彡10%; 试验组6:60 °C真空干燥，真空度彡-0.09MPa，至含水量彡10%; 试验组7:真空冷冻干燥，冷凝温度-60°C，真空度18pa，至含水量< 10%; 试验组8:真空冷冻干燥，冷凝温度-50°C，真空度18pa，至含水量< 10%; 试验组9:真空冷冻干燥，冷凝温度-40°C，真空度18pa，至含水量< 10%; 试验结果见表2: 表2不同干燥方法对日本医蛭抗凝血酶活性的影响
表2试验结果表明：干燥温度越高，日本医蛭抗凝血酶活性越低，干燥温度越低，抗凝血 酶活性越高，经真空冷冻干燥法处理后的日本医蛭抗凝血酶活性极强，且达到样品规定含 水量所耗时间最短，可运用于实际生产，因此，确定采用真空冷冻干燥方法进行样品的干 燥。
[0022] 实验三:粉碎工艺的研究 方法:取鲜活日本医蛭，在清水中洗净，筛网过滤，放入冷冻盘中摊开，在温度为_25°C 条件下低温冷冻24h;干燥:将冻结僵硬的日本医蛭在冷凝温度-50°C，真空度18pa的条件下 冷冻真空干燥24h;取干燥后的日本医蛭，经不同粉碎设备进行粉碎后，按中国药典2015年 版水蛭项下抗凝血酶活性测定方法进行测定，比较不同粉碎方式对活性成分的影响，试验 结果见表3: 试验组1:普通中药粉碎机，粉碎5分钟，LFP-800T永康市红太阳机电有限公司； 试验组2:组织捣碎机组，粉碎5分钟，DS-1上海科劳机械设备有限公司； 试验组3:胶体磨机组，粉碎5分钟，SF-JM60上海科劳机械设备有限公司； 试验组4:高速剪切机组，粉碎5分钟，HYA80启东市华宇机械制造有限公司； 试验组5:超微粉碎机组，粉碎5分钟，SQW-100L山东三清不锈钢设备有限公司； 表3不同粉碎方法对日本医蛭抗凝血酶活性的影响
从表3得出：不同的粉碎方法对日本医蛭细胞组织的破碎程度不一样，致抗凝血酶活性 差异明显，采用超微粉碎方法所得日本医蛭粉末抗凝血酶活性最强。因此，确定采用超微粉 碎方法进行日本医蛭的破碎加工。
[0023]实验四：超微粉碎工艺参数及粉体性质的研究 在以上工艺中发现采用超微粉碎工艺日本医蛭抗凝血酶活性强，药材微粉化后质地细 腻、腥味降低，颜色变浅，有利于有效成分溶出，但粉末粒径过细，易团聚、难分散，吸湿性增 强，导致分装稳定性和准确性降低，造成装量差异，不利于工业化生产。因此，对超微粉碎工 艺中的粉碎温度、粉碎时间及相应粉体性质进行了如下研究： 粉碎温度的考察 取鲜活日本医蛭，在清水中洗净，筛网过滤，放入冷冻盘中摊开，在温度为-25°C条件下 低温冷冻24h;干燥:将冻结僵硬的日本医蛭在冷凝温度-50°C，真空度18pa的条件下冷冻真 空干燥24h;取干燥后的日本医蛭，经不同温度的超微粉碎5min后，按中国药典2015年版水 蛭项下抗凝血酶活性测定方法进行测定，比较不同粉碎温度对活性成分的影响，如表4所 不。
[0024]试验组1:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度25°C (常温），粉碎时间5min; 试验组2:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度10°C，粉碎 时间5min; 试验组3:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度4°C，粉碎时 间5min; 试验组4:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度0°C，粉碎时 间5min; 试验组5:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎 时间5min; 试验组6:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-10°C，粉碎 时间5min; 试验组7:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-15°C，粉碎 时间5min; 试验组8:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-20°C，粉碎 时间5min; 试验组9:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-25°C，粉碎 时间5min; 表4不同粉碎温度对粉末活性的影响
在粉碎过程中，会产生大量的热量，控制粉碎过程中的热量产生对保持抗凝血酶活性 具有重要的意义，从表4可以看出：在其它处理条件相同的情况下，粉碎温度越低，越有利于 保持日本医蛭抗凝血酶活性，且粉末流动性均较好。试验组1到试验组3可能是在粉碎过程 中产生了大量的热量从而影响了日本医蛭的抗凝血酶活性;当粉碎温度低于〇°C以下时，抗 凝血酶活性显著提高，与温度成正相关。但是，在粉碎过程中发现，温度越低对粉碎设备要 求更高，能耗更大。因此，综合考虑对设备要求和抗凝血酶活性，优选粉碎加工温度范围为-HTC 至-4。。。
[0025]实验五:粉碎时间的考察 方法:取鲜活日本医蛭，在清水中洗净，筛网过滤，放入冷冻盘中摊开，在温度为_25°C 条件下低温冷冻24h;干燥:将冻结僵硬的日本医蛭在冷凝温度-50°C，真空度18pa的条件下 冷冻真空干燥24h;取干燥后的日本医蛭，经温度为-4°C下超微粉碎不同时间，按中国药典 2015年版水蛭项下抗凝血酶活性测定方法进行测定，比较不同粉碎温度对活性成分的影 响，如表5所示。
[0026]试验组1:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C， 粉碎时间5min; 试验组2:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C，粉碎 时间lOmin; 试验组3:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C，粉碎 时间15min; 试验组4:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C，粉碎 时间20min; 试验组5:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C，粉碎 时间25min; 试验组6:取低温冷冻干燥后的日本医蛭500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4° C，粉碎 时间30min; 表5不同粉碎时间对粉末活性的影响
超微粉碎作用时间越久所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利，但随着粉碎 时间的延长，将产生大量的热量，对抗凝血酶活性将产生一定的影响。同时，整体粉末粒径 越小将导致粉体流动性变差，不利于灌装。从表5可看出当粉碎时间超过lOmin时，各组抗凝 血酶活性差异不显著，表明作用时间超过lOmin即有利于有效成分利用。从粉末休止角而 言，当粉碎时间超过20min时，休止角超过40 °，表明粉末流动性差，不利于灌装。因此，综 合考虑优选粉碎加工时间范围为l〇min-15min为宜。
[0027]实验六:不同工艺方法比较 申请号为201010595610.2中公开了一种以水蛭为原料的肠溶胶囊的制备方法，其经历 冷冻、组织捣碎、30°C -50°C真空干燥等制备工艺；申请号为201010283280.3中公开了一种 以蚂蝗、森林山蛭、水蛭、柳叶蚂蝗、菲牛蛭、鼻蛭中的部分或全部为原料的抗凝血酶制剂及 其制备方法，历经绞肉成匀浆，<55°C真空干燥后过80目药筛，再配合药用辅料等工艺制备 成肠溶制剂。由于以上方法公开的方法中所用水蛭原料来源多样，不同蛭类的抗凝血酶物 质基础不尽相同，抗凝血酶活性差异显著，同时肠溶制剂中添加了药用辅料，造成装量不 同，亦影响抗凝血酶活性，导致无法直接通过抗凝血酶活性来比较工艺优劣。为了进行较客 观的比较，均以同样的纯日本医蛭作为原料，灌装成肠溶胶囊之前的处理工艺均采用上述 的工艺，以抗凝血酶活性为检测指标，比较不同工艺方法对日本医蛭抗凝血酶活性的影响， 试验安排及结果见表6: 表6不同专利报道的工艺方法对日本医蛭抗凝血酶活性的影响
试验结论:从表6可看出通过对已报道专利中的工艺方法比较研究表明，其它条件相同 的情况下，按本工艺技术所制得的肠溶胶囊抗凝血活性均显著优于试验组1和试验组2，上 述试验表明，本发明中的工艺方法得到的抗凝血酶制剂活性更强，说明较少剂量及可达到 相同或更优的药理效果，对于临床制剂的开发及现有制剂的提升具有重要的科学意义和应 用价值。
[0028] 实施例： 本发明各实施例的各步骤中的控制参数如表7所示： 表7
现以实施例为例，具体说明本发明的制备方法。
[0029] 实施例一： 冷冻:取鲜活日本医蛭，在清水中洗净，筛网过滤，放入冷冻盘中摊开，在温度为-25°C 条件下低温冷冻24h; 干燥:将冻结僵硬的日本医蛭在冷凝温度_50°C，真空度18pa的条件下冷冻真空干燥 24h； 粉碎:在粉碎温度-10 °C的条件下超微粉碎15min。
[0030] 实施例二~实施例九的制备方法除表7中的不同之外，其余操作方法均一致。实施 例一~实施例五制成胶囊剂，在粉碎完成后，用C〇60辐射灭菌后填充至肠溶胶囊中，即得成 品。实施例六~实施例九制成片剂，即为取日本医蛭超微粉碎粉250g，压片，制粒，过14目整 粒，压片，得片芯(每片重〇.25g);将等量的聚丙烯酸树脂II与聚丙烯酸树脂ΙΠ 加入85%乙 醇中，搅拌，待完全溶解后，配制成8%肠溶包衣溶液，依次加入邻苯二甲酸二乙酯与聚山梨 酯80,混匀备用。将片芯加入到包衣锅内，包薄膜衣，增重8~10%，干燥即得。
[0031 ]以下为实施例一~实施例九的抗凝血活性及微生物指标检测，如表8所示。
[0032]表 8
实施例一~实施例九的抗凝血活性均远远高于实验六中的实验组1和实验组2,且实施 例一~实施例九微生物符合要求。
[0033]对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若 干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和 专利的实用性。
【主权项】
1. 日本医蛭制剂的制备方法，包括冷冻、干燥和粉碎步骤，其特征在于， 冷冻步骤中，冷冻的温度为-80-4 °C之间，冷冻的时间为12~120h; 干燥步骤中，采用真空冷冻干燥； 粉碎步骤中，采用超微粉碎。2. 根据权利要求1所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的冷冻步骤中， 冷冻的温度为-80-25 °C之间。3. 根据权利要求1所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的冷冻步骤中， 冷冻的时间为24~72h之间。4. 根据权利要求1所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的干燥步骤中， 冷凝温度为-60~-40°C之间。5. 根据权利要求1所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的粉碎步骤中， 粉碎的温度为-25~-4°C之间。6. 根据权利要求1所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的粉碎步骤中， 粉碎的时间为5~30min之间。7. 根据权利要求5所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的粉碎步骤中， 粉碎的温度为-l〇~_4°C之间。8. 根据权利要求6所述的日本医蛭制剂的制备方法，其特征在于:所述的粉碎步骤中， 粉碎的时间为10~15m i η之间。9. 根据权利要求1~8中任意一项所述的通过日本医蛭制剂的制备方法制成的制剂，其 特征在于:为胶囊剂，且除胶囊肠衣外含100%日本医蛭。10. 根据权利要求1~8中任意一项所述的通过日本医蛭制剂的制备方法制成的制剂，其 特征在于:为片剂，片剂外包覆有肠衣，且除肠衣外含100%日本医蛭。
【文档编号】A61K35/62GK106038605SQ201610358365
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】贺宗毅, 陈仕江, 李卿
【申请人】重庆市中药研究院