美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及其制备方法

美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及其制备方法，所述冻干粉的制备方法，包括以下步骤：取美洲大蠊，粉碎成粉末，将所述粉末用石油醚脱脂，然后将脱脂后的粉末用乙醇浸泡，浸泡后的粉末再进行渗漉，收集渗滤液后浓缩，将浓缩液纯化后再冷冻干燥即得。本发明采用化学成分检测结合体外肿瘤细胞生长抑制强度试验，进行抗肿瘤的活性筛选，确定提取方法，并对提取工艺参数进行优化，得到最佳提取工艺参数；再用HP20大孔树脂对提取液进行纯化处理，筛选出抗肿瘤有效部位，以探讨美洲大蠊抗肿瘤的物质基础，为开发美洲大蠊有效部位的新制剂奠定基础。
【专利说明】
美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于中药化学，具体地说，涉及一种美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 美洲大蠊(Periplaneta americana(L.))为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属 昆虫的干燥虫体，又名蟑螂、石姜、滑虫、偷油婆、茶婆子，入药始载于《神农本草经》，谓"味 咸，寒。主血瘀、症坚、寒热，破积聚，喉咽痹，内寒，无子"，具有活血化瘀、解毒消疳、利水消 肿等功效，用于治疗小儿疳积、疔疮、痈肿、喉蛾、无名肿毒、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬伤等疾 病。含有蛋白质、氨基酸、肽类、糖类等多种有效成分，现代研究表明，在抗癌、提高免疫力、 治疗心血管疾病、修复皮肤等方面具有显著的作用。
[0003] 癌症是仅次于心血管疾病的人类第二大杀手，严重危害人类健康，已逐渐成为重 大的社会公共卫生问题。西医对肿瘤的治疗仍以手术、放疗和化疗为主，毒副作用严重和广 泛，导致病人机体状况的恶化及生命质量的下降，多数患者因不能忍受而放弃治疗，甚至死 于过度治疗。中医药对肿瘤的治疗起着不可估量的作用，恶性肿瘤属于中医"癌"、"岩"、"恶 月中"、"积聚"等范畴，中药治疗恶性肿瘤立足于整体观念，扶正与祛邪相结合，标本兼治，从 而增强疗效，具有西医不可比拟的独特优势（多途径、多靶点和多环节的共同作用），逐渐成 为抗肿瘤研究的热点。
[0004] 美洲大蠊具有高蛋白的资源优势，其体内粗蛋白质含量在20%-70%之间，远远高 于猪肉、牛肉、鸡肉等肉类。美洲大蠊还富含氨基酸18种以上，包括人体半必需氨基酸2种和 人体必需氨基酸7种。文献报道现已从美洲大蠊中分离鉴定出50多种神经肽，如神经肽原肛 肽、昆虫抗菌肽等。其中昆虫抗菌肽是具有生物活性短链多肽，具对热稳定、广谱抗菌等特 点，能抑制多种肿瘤细胞及动物实体瘤的生长，且不会对正常细胞造成伤害。廖吉在"蜚蠊 油脂在保健食品和医药上的应用及制备方法"（CN1500495A)中指出："蜚蠊含油酸，亚油酸， 亚麻酸等不饱和脂肪酸，其含量高达71.903%，具有抗菌和修复创伤，增强免疫力等作用"。 蒙松年、焦春香等采用GC-MS对美洲大蠊的提取物进行分析，发现含有较多烯醇、烯酸类和 烷烃、多元醇、大环内酯类物质。此外，美洲大蠊体内还含有信息素、糖类(如粘多糖等），酶， 酯酶，辅酶A及丰富的矿物质和微量元素。
[0005] 蟑螂的不同溶剂提取物对小鼠518〇抑瘤实验，抑瘤率为43%~63%。采用E玫瑰花 环试验检测蟑螂油的细胞免疫反应，通过腹腔注射其蟑螂油可增强免疫反应。蒋永新等研 究指出康复新液(美洲大蠊提取物)有抑制肿瘤生长，阻滞细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡的 作用。廖剑英使用"康复新"治疗恶性纤维组织细胞瘤，效果良好。陈利铭研究发现蟑螂提取 物AT 2具有抗肿瘤活性，能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并使脾脏指数增加，在体外 则可增加 T淋巴细胞对ConA的转化反应。
[0006] 以美洲大蠊为原料开发的"康复新"产品，经研究发现其含多元醇类、粘糖氨酸和 表面细胞生长因子EGF等，能增强巨噬细胞和NK细胞的吞噬能力，消除炎症水肿，改善局部 血液循环;能使伤口周围中性粒细胞数量和趋化功能增加，促进表皮细胞生长和肉芽组织 增生，利于创面清理和加速创面修复。

【发明内容】

[0007] 有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干 粉及其制备方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉，冻 干粉分子量3Kd;多肽含量以牛血清蛋白计，不少于53.94%;氨基酸以丙氨酸计不少于 4.51 %;尿嘧啶彡0.22%，次黄嘌呤彡0.77%，肌酐彡4.62%。
[0009] 本发明还公开了上述美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，包括以下步 骤:取美洲大蠊，粉碎成粉末，将所述粉末用石油醚脱脂，然后将脱脂后的粉末用乙醇浸泡， 浸泡后的粉末再进行渗漉，收集渗漉液后浓缩，将浓缩液纯化后再冷冻干燥即得。
[0010] 进一步的，所述美洲大蠊粉碎成粗粉。
[00?1 ] 进一步的，所述渗漉速度为l-3ml/min/kg。
[0012]优选的，所述渗漉速度为3ml/min/kg。
[0013] 进一步的，所述乙醇浸泡步骤为用粉末10倍量的90%乙醇浸泡48h。
[0014] 进一步的，所述渗漉液浓缩条件为50-60°C浓缩至1: lml/g。
[0015] 进一步的，所述浓缩液纯化方法为:加纯化水使浓缩液浓度为0.3g/ml，用2BV浓缩 液以2BV/h的速度通过HP20大孔树脂色谱柱，静置lh，然后用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脱 lh，收集洗脱液，减压浓缩至1: 2ml/g。
[0016] 进一步的，所述冷冻干燥方法为:将纯化后的浓缩液在-60°C条件下预冷至-40°C， 保持2h，然后程序升温至-20°C，保持2h，快速升温至30°C解析干燥6h。
[0017] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0018] 1)本发明的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及制备方法采用化学成分检测结合 体外肿瘤细胞生长抑制强度试验，进行抗肿瘤的活性筛选，确定提取方法，并对提取工艺参 数进行优化，得到最佳提取工艺参数;再用HP20大孔树脂对提取液进行纯化处理，筛选出抗 肿瘤有效部位，以探讨美洲大蠊抗肿瘤的物质基础，为开发美洲大蠊有效部位的新制剂奠 定基础。
[0019] 2)本发明的制备方法技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易 掌握。
[0020] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0021] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0022] 图1为本发明实施例1中美洲大蠊不同提取方法对K562细胞增殖的浓度抑制率曲 线图（n = 3);
[0023] 图2为本发明实施例1中美洲大蠊不同提取方法对SMMC-7721细胞增殖的浓度抑制 率曲线图(n = 3);
[0024] 图3为本发明实施例1中美洲大蠊不同提取方法对HCT116细胞增殖的浓度抑制率 曲线图(n = 3);
[0025] 图4为本发明实施例1中牛血清白蛋白标准曲线图；
[0026] 图5为本发明实施例1中丙氨酸对照品标准曲线图；
[0027]图6为本发明实施例1中美洲大蠊乙醇不同浓度提取物对K562细胞增殖的浓度抑 制率曲线图(n = 3);
[0028] 图7为本发明实施例1中美洲大蠊乙醇不同浓度提取物对SMMC-7721细胞增殖的浓 度抑制率曲线图(n = 3);
[0029] 图8为本发明实施例1中美洲大蠊乙醇不同浓度提取物对HCT-116细胞增殖的浓度 抑制率曲线图(n = 3);
[0030] 图9为本发明实施例1中树脂对多肽的动态吸附曲线图；
[0031] 图10为本发明实施例1中不同乙醇浓度洗脱的美洲大蠊冻干粉对K562细胞增殖的 浓度抑制率曲线图(n = 3);
[0032] 图11为本发明实施例1中不同乙醇浓度洗脱的美洲大蠊冻干粉对SMMC-77 21细胞 增殖的浓度抑制率曲线图(n = 3);
[0033] 图12为本发明实施例1中不同乙醇浓度洗脱的美洲大蠊冻干粉对HCT116细胞增殖 的浓度抑制率曲线图(n = 3);
[0034] 图13为本发明实施例1中多肽洗脱曲线图；
[0035] 图14为本发明实施例2中美洲大蠊冻干粉电泳图。
【具体实施方式】
[0036] 以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0037] 实施例1美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法
[0038] 1、美洲大蠊不同提取方法对肿瘤细胞的影响
[0039] 1.1美洲大蠊不同的提取方法
[0040] 1.1.1 渗漉法
[0041] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脱脂后，药渣中加入90%乙醇搅匀，密闭放置 待药粉充分膨胀后，装渗漉筒，再加入10倍量90 %乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度渗漉， 收集滤液，于50 °C下减压浓缩，定容。
[0042] 1.1.2超声法
[0043] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脱脂后，药渣用10倍量90%乙醇浸泡48h，超 声20min X 3，滤过，药渣再加入8倍量90 %乙醇超声2次，每次20min X 3，滤过，合并3次滤液， 于50°C下减压浓缩，定容。
[0044] 1.1.3乙醇回流法
[0045] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脱脂后，药渣用10倍量90%乙醇浸泡48h，回 流lh，滤过，药渣再加入8倍量90 %乙醇回流2次，每次lh，滤过，合并3次滤液，于50°C下减压 浓缩，定容。
[0046] 1.2阳性对照样品配制
[0047] lmg/ml的顺铂(DDP)用培养基液配制为0 · lμg/ml，lμg/ml，10μg/ml三个浓度。
[0048] 1.3供试样品的制备
[0049] 取三种不同提取方法制得的提取液减压浓缩至l:2(ml:g)，再冷冻干燥成粉末。取 不同供试品，加水或DMS0溶解，再加入适量水，配置为不同浓度梯度进行加板，所有样品均 经过一次性滤膜过滤灭菌。
[0050] 1.4细胞培养
[00511 人肝癌SMMC-7721细胞株，人红白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株HCT116，采用 含10 %胎牛血清的RPMI 1640pH7.4的完全培养基，在37 °C、5 % C02条件下常规培养。
[0052] 1.5美洲大蠊不同提取方法对肿瘤细胞增殖的影响
[0053]取对数生长期的肿瘤细胞，将肿瘤细胞浓度调整为(4X104~5X104)个/ml，以90μ 1/孔种入96孔培养板中。细胞种板后，置37°C、5%C02培养箱中培养24h，受试组分别加 ?ομL 不同浓度的样品，阴性对照(DMS0)和阳性对照(DDP:0. lμg/ml，lμg/ml，10μg/ml三个浓度）， 空白对照孔仅加培养基，每组设3个复孔。样品终浓度设为12.5、25、50、100、200、400μg/ml 进行加药，加药后将96孔板置37°C，5 %⑶2培养箱中继续培养48h，每孔加10μ1的CCK-8，置 37°C，5%⑶2培养箱中继续培养2h，以450nm为测量波长，630nm为参考波长测定各孔的0D 值，每个实验至少重复3次。细胞增殖抑制率计算公式如下:抑制率=[1_(0D给药组-0D空白 孔)/(0D阴性对照组-0D空白孔）]X100%。半数抑制浓度（IC50)采用LOGIT法计算。不同部 位的浓度抑制率曲线见图1-3，IC50见表1。
[0054] 表1美洲大蠊不同提取方法对不同肿瘤细胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0055] _
[0056] 从表1可知，采用乙醇渗漉法、超声法、回流法提取的美洲大蠊则表现出不同程度 的体外抗肿瘤活性，其中渗漉法提取的药液对三种肿瘤细胞的抑制作用最强，其IC50均最 小，故选择渗漉法提取。
[0057]根据文献报道，结合美洲大蠊抗肿瘤的临床研究，选择人肝癌SMMC-7721细胞株， 人红白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株HCT116采用体外肿瘤细胞生长抑制强度试验对 美洲大蠊乙醇渗漉液、乙醇超声提取液、乙醇回流提取液进行考察，试验结果显示采用乙醇 渗漉法提取的美洲大蠊药液对三种肿瘤细胞的抑制作用最强，抗癌活性最明显。美洲大蠊 含有大量的脂肪油，在前期细胞毒性试验中发现脂肪油对肿瘤细胞株无抑制作用，为无效 成分，故先采取石油醚脱脂后再进行提取工艺研究。
[0058] 2、美洲大蠊乙醇渗漉工艺的研究
[0059]中药成分的复杂性也决定自身具有多种药理作用，乙醇的溶解范围相当广泛，不 同乙醇浓度渗漉提取的物质基础差异较大，所产生的药效也截然不同，如果仅用化学成分 作为考察指标，很难确保制剂的有效性，故对影响药效成分提取的主要因素乙醇浓度采用 体外肿瘤细胞生长抑制强度试验来考察，即考察乙醇不同浓度提取物对人肝癌SMMC-7721 细胞株，人红白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株HCT116的细胞毒活性，确定乙醇浓度后， 以多肽、氨基酸含量及干膏率收率为评价指标，对其余2个影响因素一乙醇用量和渗漉速度 采用单因素进行考察，以优选合理可行的乙醇渗漉提取工艺参数。
[0060] 2.1评价指标的选择
[0061 ] 2.1.1对肿瘤细胞增殖的抑制作用
[0062]参照"1.5美洲大蠊不同提取方法对肿瘤细胞增殖的影响"。
[0063] 2.1.2干膏收率测定
[0064] 精密吸取25ml各渗漉液于蒸发皿中（干燥至恒重），水浴挥干后，在105°C干燥3小 时，迅速移置干燥器中，冷却30min后，精密称定重量，计算收膏率。
[0065] 2.1.3多肽含量的测定
[0066]多肽的测定方法较多，主要有凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、考马斯亮蓝G-250 法、BCA法等，凯氏定氮法最准确但操作繁琐，双缩脲法简单易行但灵敏度差，考马斯亮蓝法 与BCA法对小分子量的多肽显色不完全，Lowry法操作简单，重现性好，灵敏度高，对蛋白质 和小分子多肽，具有同样的显色反应，故选其作为美洲大蠊多肽的含量测定方法。
[0067] (1)对照品溶液的制备
[0068] 精密称取51.80mg牛血清白蛋白对照品（BSA)，置100ml容量瓶中，加水溶解至刻 度，摇勾，配成每lml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液。
[0069] (2)线性范围考察
[0070] 精密吸取BSA对照品溶液0 (空白），0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，加蒸馏水补足至 1.0ml。加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55 °C水浴15min，取出 冷却至室温，显色后，照分光光度法（中华人共和国药典2010年版I部，附录VA)，在740nm处 测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，多肽浓度X为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2和图4。
[0071] 表2多肽线性范围的考察
[0072]
[0073] 直线回归方程为：Y = 0.0071X+0.087(r = 0.9993)，表明牛血清白蛋白在15·938μ g/ml~79.692μg/ml内，样品浓度与吸光度线性关系良好。
[0074] (3)供试样品溶液制备
[0075]按单因素对样品进行渗漉提取，分别精密吸取各样品液置100ml容量瓶中，加蒸馏 水至刻度，再分别吸取lml样品液，照标准曲线制备项下的方法，自"加碱性铜试剂5.00ml" 起，依法测定吸收度。
[0076] 2.1.4氨基酸的含量测定
[0077]茚三酮显色法常常用于氨基酸含量的测定，该法重现性好，操作简单，灵敏度高， 便于工艺控制，故美洲大蠊渗漉液中游离氨基酸的含量采用茚三酮显色法测定。
[0078] (1)对照品溶液的配制
[0079] 精密称取16.08mg丙氨酸对照品，加适量10 %的异丙醇溶解，置100ml容量瓶中，并 稀释至刻度，作为母液。精密量取4ml，至50ml容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，配制成每lml 含12.86yg丙氨酸的对准品溶液。
[0080] (2)线性范围考察
[0081 ] 精密吸取丙氨酸对照品溶液（12 · 86μg/ml)0ml (空白）、0 · 4、0 · 8、1 · 2、1 · 6、2ml至 l〇ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至2ml，加0. lml新鲜配制的1 %Vc溶液，3ml茚三酮醇 溶液，混匀，在100 °C水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60 %乙醇至刻度，照分光光 度法（中华人共和国药典2010年版I部，附录VA )，在570nm处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐 标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3和图5。
[0082]表3氨基酸线性范围的考察
[0083]
[0084] 直线回归方程为：Y = 0.249X+0.1137(r = 0.9996)，表明丙氨酸在 0.5146μg/ml ~ 2.5728μg/ml内，样品浓度与吸光度线性关系良好。
[0085] (3)供试样品溶液制备
[0086]按单因素对样品进行渗漉提取，分别精密吸取各样品液置100ml容量瓶中，加蒸馏 水至刻度，再分别吸取2ml样品液，照标准曲线制备项下的方法，自"加0. lml新鲜配制的1% Vc溶液"起，依法测定吸收度。
[0087] 2.2乙醇浓度的考察
[0088] 称取美洲大蠊粗粉适量，石油醚脱脂，分别加10倍量90%、70%、40%的乙醇浸泡 48h，收集各渗漉液，于50°C下减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，照3.1.5项下方法测定对 肿瘤细胞增殖的影响，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50)，各供试品的浓度抑制 率曲线见图6-8，IC50见表4。
[0089] 表4美洲大蠊乙醇不同浓度提取物对不同肿瘤细胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0090]
[0091] 由表4和图6-8可知，美洲大蠊40%的乙醇提取物对K562、SMMC-7721和HCT116细胞 的增殖均无明显的抑制作用，不能计算IC50。但美洲大蠊90%、70%的乙醇提取物具有较强 的抑制作用，其中以90%的乙醇提取物对各肿瘤细胞的IC50最小，活性最强，因此提取溶剂 选用90%的乙醇进行渗漉。
[0092] 2.3吸醇率的测定
[0093]称取美洲大蠊饮片粗粉，石油醚脱脂后，加5倍量90 %乙醇浸泡，观察润湿程度，待 药粉充分润湿至透心为止，过滤，药渣称重，计算吸醇率，结果见表5。
[0094] 表5吸醇率试验结果
[0095]
[0096] 由表5可知，美洲大蠊饮片吸醇率约为146.9 %，因此提取时应额外加入1.5倍量 90%乙醇以补足药材的吸醇量。
[0097] 2.4乙醇用量的考察
[0098] 称取适量美洲大蠊粗粉，每份100g，石油醚脱脂后，加90 %乙醇搅匀，密闭放置一 段时间后，装渗漉筒，再分别加6倍、8倍、10倍、12倍量90 %乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的流 速渗漉，收集渗漉液，以多肽含量、氨基酸含量、出膏率为评价指标，照2.1项下方法分别测 定，结果见表6。
[0099]表6乙醇用量的考察 [0100]
[0101] ~由表6可知，乙醇用量在10倍以上对多肽与氨基酸含量影响不大，从节约出发，选_ 用10倍量90 %乙醇进行提取。
[0102] 2.5渗漉速度的考察
[0103] 称取适量美洲大蠊粗粉，每份100g，石油醚脱脂后，加90 %乙醇拌湿，密闭放置一 段时间后，装渗漉筒，加入10倍量90%乙醇浸润4811，分别以11111/111；[11/1^、31111/111；[11/1^、51111/ min/kg的速度进行渗漉，收集渗漉液，以多肽含量、氨基酸含量、出膏率为指标，照2.1项下 方法分别测定，结果见表7。
[0104] 表7渗漉速度的考察
[0105] _
[0106] 由表7可知，以lml/min/kg渗漉，多肽、氨基酸含量及出膏率均比以3ml/min/kg的 略高，但实际差异不大，为节约生产成本和时间，故确定乙醇渗漉流速为3ml/min/kg。
[0107] 2.6提取工艺的验证实验
[0108] 根据上述结果可知，美洲大蠊乙醇渗漉工艺为:取美洲大蠊饮片粗粉，石油醚脱脂 后，用10倍量90%乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度进行渗漉，收集渗漉液。为确保渗漉工 艺的重现性和可靠性，取三批美洲大蠊饮片进行验证试验，结果见表8。
[0109] 表8验证试验结果
[0110]
[0111] 由表8可知，该渗漉提取工艺合理可行，重现性好。
[0112] 渗漉法属于动态浸出方法，有效成分浸出完全，没有加热过程，避免了有效成分受 热分解。渗漉速度以1~3ml/min/kg提取效果为好，可能是因为美洲大蠊属于昆虫类，壁层 较厚，慢速渗漉更有利于溶剂渗入组织细胞。
[0113] 3、浓缩工艺研究
[0114] 美洲大蠊所含的主要成分为多肽、氨基酸类物质，温度过高会引起蛋白质肽键断 裂，结构发生改变，从而失去活性，而减压浓缩具有浓缩时间短，能够防止或减少热敏性物 质的分解，故本工艺考虑采用减压浓缩，以多肽、氨基酸的含量作为考察指标，比较了分别 在50 °C、60 °C、70 °C下减压浓缩前后其含量的变化，结果见表9。
[0115] 表9浓缩工艺考察结果
[0116]
[0117] 由表9可知，提取液在50 °C和60 °C下浓缩，多肽与氨基酸的含量变化较小，在70°C 时二者含量减少明显，考虑到生产效率及尽可能保留有效成分，选择50~60°C范围内进行 浓缩。
[0118] 4、分离纯化工艺研究
[0119] 中药的提取液中含有大量的无效成分和构材物质，为尽可能地富集有效成分，增 加药物的疗效、减少服用量以及有利于成型，常常对中药提取液进行一定的纯化处理。美洲 大蠊抗肿瘤的主要有效成分为多肽物质，目前该类成分的分离方法主要有：盐析法、超滤 法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、层析法等。文献表明对于多肽类化合物的分离纯化，大孔吸 附树脂具有较好的效果。大孔树脂分离具有选择性好、成本较低、吸附容量大、再生处理方 便等优点，是继离子交换树脂后发展起来的，近年来被广泛应用于中药产业，适合工业化生 产的分离提纯技术。因此，本研究采用大孔树脂分离纯化技术对美洲大蠊渗漉液中多肽进 行纯化，但大孔树脂根据极性大小分为不同的类型，从而对化合物的分离纯化也不尽相同， 考虑到中药成分的复杂多样性，故对大孔树脂的种类进行选择并对其吸附解吸的影响因素 进行了系统考察，以期得到最佳纯化工艺参数，为动物类药材中多肽的分离纯化及日后工 业化大生产提供一定的参考和依据。
[0120] 4.1美洲大蠊渗漉液的制备
[0121 ]按照"2、美洲大蠊乙醇渗漉工艺的研究"结果制备渗漉液。
[0122] 4.2树脂的预处理
[0123] 将一定量的NKA-9 (极性）、DM-301 (中极性）、AB-8 (弱极性）、D-101 (非极性）、DA-201(非极性）、HP20(非极性)型大孔吸附树脂先用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装 柱，用95%乙醇以3BV/h流速洗涤，洗至流出的乙醇与蒸馏水混合不浑浊为止，最后以蒸馏 水以3BV/h流速充分洗至无醇味，抽滤备用。
[0124] 4.3树脂的静态吸附、解吸性能考察
[0125] 分别称取2g已处理好的6种大孔树脂，于50ml具塞锥形瓶中，分别加入生药浓度为 〇. 2g/ml的美洲大蠊渗漉液30ml，置25°C恒温振荡器中，以150r/min振荡12h，过滤，收集滤 液，测定多肽含量，按照公式（1)计算树脂静态吸附率;将吸附饱和的美洲大蠊渗漉液树脂 抽干后，加入70%的乙醇3〇1111，置25°(：恒温振荡器中振荡1211(振荡速度为15(^/1^11)解吸， 分别取各解吸液测定多肽含量，按照公式(2)计算不同树脂对美洲大蠊多肽的解吸率，结果 见表10。
[0126] 吸附率（％ ) = (〇)-&)/0) X 100 (1)
[0127] 解吸率（％) = (C2Xv2)/[(C『C1)Xv1]X 100 (2)
[0128] 其中Co为原液多肽浓度(mg/ml)，Ci为吸附液多肽浓度(mg/ml)，νι为吸附液体积 (ml)，C2为解吸液多肽浓度(mg/ml)，V2为解吸液体积(ml)。
[0129] 表10不同大孔树脂对美洲大蠊多肽的静态吸附解吸情况(n = 3)
[0130]
[0131] 由表10可知，6种大孔树脂中AB-8、D-101、DA-201、HP20型大孔树脂的吸附率相差 不大，但HP20解吸率要明显大于其他几类，故选择HP20型大孔树脂来分离纯化美洲大蠊多 肽。
[0132] 4.4树脂的动态吸附性能考察
[0133] 将预处理好的HP20树脂湿法装柱(2cmX 30cm，30g树脂），取生药浓度为0.2g/ml的 美洲大蠊渗漉液适量，以2BV/h流速通过树脂，每20ml (即0.5倍BV)收集1个流份，共20个流 份。以流出液体积为横坐标，多肽质量浓度为纵坐标，绘制树脂对多肽的动态吸附曲线，见 图9。
[0134] 从图9可知，在开始0.5BV时，流出液中多肽浓度很低，随着上样体积的增加，流出 液中多肽浓度不断上升，从第2.5BV时，多肽浓度急剧增加，出现较大量泄漏，因此确定药液 上样量为2BV。
[0135] 4.5上样液质量浓度的考察
[0136] 分别量取生药浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/ml美洲大蠊渗漉液2BV，以2BV/ h通过树脂柱，收集流出液，测定流出液中多肽的含量，计算吸附率，结果见表11。
[0137] 表11上样液质量浓度的考察
[0138]
?0?39?~由表11可知，上样液质量浓度越低，多肽吸附率越大，吸附效果逐渐增强，这可能 由于浓度越低，多肽与树脂充分接触，从而吸附较完全，〇.l、〇.2、0.3g/ml的上样浓度，多肽 吸附率相差不大，但样品质量浓度越稀，耗费的时间越长，考虑到生产的实际可操作性，故 确定样品液质量浓度为〇. 3g/ml。
[0140] 4.6上样液流速对吸附的影响
[0141] 取生药浓度为0.3g/ml的美洲大蠊渗漉液2BV，分别以lBV/h、2BV/h、3BV/h的流速 通过树脂柱，测定流出液中多肽的含量，得不同流速上样液流速的吸附效果，考察流速对树 脂吸附率的影响，结果见表12。
[0142] 表12上样液流速对吸附的影响
[0143]
[0144] ~由表12可知，随着流速由lBV/h增加到3BV/h，多肽回收率逐渐减小，吸附效果减_ 弱，而lBV/h、2BV/h的上样流速对树脂的吸附效果影响不大，为缩短时间，提高效率，采用 2BV/h的上样速率。
[0145] 4.7洗脱溶媒对解吸效果的影响
[0146] 取生药浓度为0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通过树脂柱，静置lh，然 后分别用30%、50%、70%、90%乙醇（28￥/11，48￥)洗脱，收集不同乙醇浓度的洗脱液，测定 各洗脱液中多肽的质量浓度，得到不同乙醇浓度的解吸效果，结果见表13。
[0147] 表13不同乙醇浓度对解吸率的影响
[0148]
[0149] ~不同浓度的乙醇具有不同的洗脱能力，洗脱的物质基础有所差异，因而对药效也, 会存在一定的影响，为尽可能保证疗效，故本实验取不同乙醇浓度的洗脱液旋蒸至无醇味， 再冷冻干燥成粉末。其余照1.3项下方法制备供试样品，1.5项下方法测试对肿瘤细胞增殖 的影响，结果见图10-12和表14。
[0150] 表14不同乙醇浓度洗脱的美洲大蠊冻干粉对不同肿瘤细胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0151]

[0152] 由表13可知，不同乙醇浓度对多肽的洗脱有较大的影响，用50%和70%的乙醇洗 脱时解吸率较高，两者相差不明显，但由图10-12和表14可知，除30%乙醇洗脱冻干粉外， 50 %、70 %及90 %乙醇洗脱冻干粉均可抑制肿瘤细胞的增殖，但以70 %的乙醇洗脱的冻干 粉抑制率最强，IC50最小，故选择70 %的乙醇洗脱。
[0153] 4.8洗脱剂用量对解吸效果的影响
[0154] 取生药浓度为0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通过树脂柱，静置lh，用 70%乙醇（28￥/11，58￥)洗脱层析柱，每201111(8卩0.5倍阶)收集1个流份，共10个流份，以流出 液体积为横坐标，多肽质量浓度为纵坐标，绘制多肽洗脱曲线，见图13。
[0155] 由图13可知，用70 %乙醇洗脱，多肽浓度随洗脱体积的增加而逐渐增大，至2BV后， 洗脱液中几乎已无多肽，故选择2BV的70%乙醇洗脱。
[0156] 4.9洗脱剂流速对解吸效果的影响
[0157] 取生药浓度为0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通过树脂柱，静置lh，用 2BV的70 %乙醇以不同流速(1、2、3BV/h)洗脱层析柱，结果见表15。
[0158] 表15不同洗脱速度的影响
[0159]
[0160]由表15可知，在洗脱剂用量一定时，流速越小，洗脱剂与树脂接触的时间长，解吸 充分，洗脱效果越好，可见低流速有利于多肽的洗脱，但流速过小费时费力，综合考虑，选择 洗脱剂流速为2BV/h，保质保效。
[0161] 4.10验证试验
[0162] 根据上述试验结果，按照上述最佳条件重复3次试验，取生药浓度为0.3g/ml美洲 大蠊渗漉液，以2BV/h流速通过树脂柱，静置lh，用70%乙醇（2BV/h，2BV)洗脱层析柱，收集 乙醇洗脱液，测定洗脱液中多肽含量，计算回收率，结果见表16。
[0163] 表16验证试验结果
[0164]
[0165] 由表16可知，HP20大孔树脂纯化工艺合理可行，重现性好。
[0166] HP20大孔树脂对美洲大蠊提取液中多肽具有较好的吸附特性，用70%乙醇可以比 较集中地将提取液中的多肽类成分有效分离出来，以达到纯化的效果。
[0167] 大孔吸附树脂主要以甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯等为原料加入一定量致孔剂(二乙 烯苯)聚合而成的一种不溶于酸、碱及有机溶剂的高分子聚合物，根据极性大小的不同分为 非极性、弱极性和极性几种类型。大孔吸附树脂带有一定的极性基团，且颗粒的总表面积较 大，使大孔树脂具有较大的吸附能力，另一方面又具有不同孔径大小的网状孔穴结构，使得 它们根据化合物分子量的不同而具有一定的选择性，调整体系的亲水与疏水平衡及化合物 的性质，就可以引起吸附的增加或解吸。HP20为非极性树脂，主要是基于化合物的疏水集团 与非极性吸附剂之间的范德华引力进行吸附，降低洗脱剂极性，洗脱能力增加。从生产的可 行性和安全性综合考虑，本实验采用调整乙醇一水的比例来改变洗脱剂的极性，从而对多 肽进行富集。
[0168] 在用乙醇洗脱中发现，较高浓度的乙醇洗脱不仅在解吸率和抑制肿瘤细胞的增殖 方面效果都好于低浓度的乙醇，说明美洲大蠊提取液中多是疏水性较强的小分子肽段，能 很好地被HP20吸附，用较高浓度的乙醇洗脱多肽的解吸率高。
[0169] 5、冷冻干燥工艺确定
[0170] 冷冻干燥是在低温下将物料中含有的水分转化成固态的冰，然后在真空环境下加 热，让水分由固态的冰升华为气态的水蒸气除去，从而使物料脱水得以干燥获得冻干制品 的技术。常常用来干燥多肽、蛋白质、微生物等热敏性药品，防止药品的理化和生物学方面 的变性，从而保持药品生物活性的一种有效方法。为提高冻干的效率，本实验在前期研究工 作基础上，对美洲大蠊提取液的冻干工艺参数进行确定，制定工艺条件为，将提取液装如物 料拖盘，高度约l〇mm，放入冻干机冷阱内预冻(冷阱温度-60 °C )，冷至物料温度-40 °C，保持 2h，完成预冷冻。按照预先设定的梯度升温程序加热至-20°C进行升华干燥（冻干箱压力 30Pa左右），待冰层消失，再保持2h，且物料温度上升接近搁板的温度时，快速升温至30°C进 行解析干燥6h，即得美洲大蠊多肽类冻干粉。
[0171] 6、最终确定的制备工艺
[0172]根据美洲大蠊提取、纯化工艺考察结果，确定其多肽有效部位的制备工艺条件为： 取美洲大蠊l〇kg，粉碎成粗粉，将粉末用石油醚脱脂，然后用10倍量的90%乙醇浸泡48h，以 3ml/min/kg的速度进行渗漉，收集渗漉液，滤过，滤液在50-60°C浓缩至1: l(ml :g)，然后加 纯化水调整浓缩液浓度至〇.3g/ml，以2BV/h的速度通过HP20大孔树脂色谱柱，静置lh，然后 用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脱lh，收集洗脱液，减压浓缩至1:2(ml: g)，纯化后的浓缩液 在-60°C条件下预冷至_40°C，保持2h，然后程序升温至-20°C，保持2h，快速升温至30°C解析 干燥6h即得。
[0173]以上述方法制备三批冻干粉，结果见表17。
[0174]表17三批冻干粉样品含量测定结果
[0175]
[0176] 实施例2美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉质量研究
[0177] 1、多肽含量测定
[0178] 精密称取牛血清白蛋白对照品（BSA)51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至 刻度，摇匀，配成每lml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液。
[0179]精密称取冻干粉0.2g，置容量瓶中，加入70 %的乙醇2.0ml，精密称定重量，超声提 取lOmin，放冷，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液lml用70%乙醇定容于100ml容 量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
[0180] 取供试品溶液和对照品溶液各lml，分别加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚 试剂0.5ml，快速摇匀，55°C水浴15min，取出冷却至室温，显色后，照分光光度法，在740nm处 测定吸光度，计算即得。按上述方法测定三批冻干粉多肽含量，结果见表18。
[0181] 表18冻干粉多肽含量的测定
[0182]
[0183]由表18可知，冻干粉中平均多肽含量为67.43%，考虑到饮片的来源，加工，制剂生 产等因素，暂定冻干粉每克含多肽以牛血清白蛋白计不得少于53.94%。
[0184] 2、氨基酸含量测定
[0185] 精密称取16.08mg丙氨酸对照品，置100ml容量瓶中，加10%的异丙醇溶解，并稀释 至刻度，作为母液;精密量取所述母液4ml，至50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成每lml 含12.86yg丙氨酸的对照品溶液；
[0186] 精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70%的乙醇10ml，精密称定重量，超 声提取15min，放冷，用70 %乙醇补足减失的重量，摇均，滤过，取续滤液lml用70 %乙醇定容 于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
[0187] 取供试品溶液和对照品溶液各2ml至10ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至 2ml，加0. lml新鲜配制的1 % Vc溶液，3ml茚三酮醇溶液，混匀，在100°C水浴中加热15min，取 出迅速冷至室温，加入60%乙醇至刻度，在570nm处测定吸光度，计算即得。按上述方法测定 三批冻干粉氨基酸含量，结果见表19。
[0188] 表19冻干粉氨基酸含量的测定
[0189]
[0190] 由表19可知，冻干粉中氨基酸含量为5.64%，考虑到饮片的产地来源，制剂生产等 因素，暂定冻干粉每克氨基酸含量以丙氨酸计不得少于4.51 %。
[0191] 3、核苷类成分含量测定
[0192] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相 A，0.7 %冰乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温30 °C，流速0.7ml/ min〇
[0193] 洗脱梯度为： 时间（min) 流动相A ( % ) 流动相B ( % ) 0 0 100
[0194] 15 1 99 40 8 92 50 55 45
[0195] 对照品溶液的制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品，精密称定，置量瓶中，加超 纯水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黄嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合对照品溶液。
[0196] 供试品溶液的制备:精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，蒸馏水10ml，精密称 定重量，超声提取l〇min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇均，滤过，精密量取续滤液5ml， 蒸干，残渣加水定容至l〇ml量瓶中，0.45μπι滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
[0197] 测定方法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各ΙΟμΙ，注入液相色谱仪，测 定，计算即得。按上述方法测定三批冻干粉多肽含量，结果见表20。
[0198] 表20冻干粉核苷类成分的含量测定
[0199]
[0200]由表20可知，冻干粉中平均尿嘧啶含量为0.28%、平均次黄嘌呤含量为0.96%、平 均肌苷含量为5.78%，考虑到饮片的来源，加工，制剂生产等因素，暂定冻干粉每克含尿嘧 啶不得少于0.22%、次黄嘌呤不得少于0.77%、肌酐不得少于4.62%。
[0201] 4、多肽分子量研究
[0202] Tr i c ine-SDS-PAGE 电泳试剂的配制
[0203] 凝胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl pH 8.45):称取182.0g三羟基甲基氨基甲烷 (Tris)，用400ml超纯水将其充分溶解，调pH为8 · 45(lmol/L HC1)，加1 · 5g SDS充分溶解后， 加超纯水定容至500ml。
[0204] T = 49.5 %、C = 3 %的丙烯酰胺溶液(AB-3)，浓缩胶和夹层胶:称取48.0g丙烯酰 胺、1.5g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，加超纯水充分溶解，再定容至100ml，过滤，避光条件下(4 °C)保存，在1个月内使用。
[0205] T = 49.5%、C = 6%的丙烯酰胺溶液（AB-6)，分离胶：称取48·0g丙烯酰胺、3·0g N， N-亚甲基双丙烯酰胺，加超纯水充分溶解，再定容至100ml，过滤，避光条件下(4°C)保存，在 1个月内使用。
[0206] 10 %过硫酸铵溶液:称取1.0g过硫酸铵，加注射用水10ml充分溶解，临用新鲜配 制，或者配制后分装，_20°C保存，一周内使用。
[0207] Tris-HCl/SDS(pH6 · 8):称取3 ·025gTris，加超纯水20ml充分溶解，调pH至6 · 8(浓 HC1)，用超纯水定容至50ml，然后加入0.2g SDS，充分溶解，即得。
[0208] 阳极电泳缓冲液(pH8·9):称取121 · lgTris base，用400ml超纯水溶解，调pH为8 ·9 (mol/L HC1)，再加超纯水定容至500ml，用前稀释10倍。
[0209] 阴极电泳缓冲液(pH约8 · 25):称取60 · 55gTris base，89 · 58gTricine和5gSDS，用 超纯水充分溶解，再定容至500ml，用前稀释10倍。
[0210] 供试品缓冲液:巯基乙醇3.085g，溴酚蓝0.2g，用超纯水溶解，加入甘油20ml，10 % SDS 40ml，lmol/L的Tris-Hcl缓冲液 10ml(pH6.8)，再用超纯水定容至 100ml。
[0211] 0 · 005%Na2S2〇3溶液:称取0 · 05g Na2S2〇3，加超纯水溶解，定容至 1000ml。
[0212] 0.25 %考马斯亮蓝染色液:称取2.5g考马斯亮蓝R-250，加入甲醇450ml、冰醋酸 100ml、超纯水450ml充分溶解混匀，即得。
[0213] 考马斯亮蓝R-250脱色液：量取100ml甲醇、100ml冰HAc、加注射用水定容至 1000ml〇
[0214]供试品溶液的配制：取各标记样品，取1〇此置于EP管中，加入样品缓冲液，混勾，置 沸水中煮沸3_5min，取出冷却至室温，即得。
[0215]制备胶溶液:按表21制成分离胶溶液，夹层胶、浓缩胶，制板厚度1.0mm。
[0216] 表21胶溶液的配制
[0217]
[0218] 加样:将制备好的凝胶板，后放入电泳槽内，阴极电泳缓冲液加入两玻璃板间，阳 极电泳缓冲液加入电泳槽内。待浓缩胶聚合后拔出样品梳，点样，依次加入Marker对照品和 供试品。
[0219] 电泳：接通电泳仪电源后，开始电压70-80V，待样品进入分离胶后，电压调为90-100V;待溴酚蓝指示剂前沿距电泳胶板l-2cm时，停止电泳。
[0220] 凝胶板剥离与染色、脱色：电泳完毕后，取出玻璃板，标记区分，将胶片置于平皿 中，加入R250染色液染色2h左右，用超纯水漂洗数次，浸入脱色液脱色，直到蛋白质区带清 晰为止。
[0221] 结果:采用凝胶成像系统观察电泳图谱，结果见图14。图中1为超低分子量标准蛋 白（3313-20100Da)，2、3、4均为美洲大蠊冻干粉。由图14可以看出，超低分子量标准蛋白 Marker得到了初步的分析，在此条件下，美洲大蠊冻干粉中分子量为3kd左右的小分子多肽 能够有效的分离。
[0222] 5、氨基酸组成分析与相对含量检测
[0223] 离子交换柱：4.6mmX60mm(3ym);检测波长：频道l(570nm)，频道2,（440nm，脯氨 酸，Pro);流动相:柠檬酸纳和柠檬酸的缓冲液;茚三酮反应液;柱温:57 °C ;流速:柱栗1 (洗 脱溶液）：0.4ml/min，栗2(茚三酮溶液）：0.35ml/min，进样体积:20μ1。
[0224] 对照品溶液的制备：精密吸取0.200ml氨基酸混合对照品液于5ml容量瓶中，用 pH2.2的缓冲液稀释至刻度，0.2μπι滤膜过滤，取续滤液，即得。
[0225] 供试品溶液的制备：称取美洲大蠊有效部位0.2g，加70%乙醇50ml溶解，过滤，取 续滤液适量，加盐酸酸解剂(6mol/L)，置安瓿中，冲入氮气约lmin，于110°C恒温鼓风干燥箱 中，真空封管酸水解24小时，冷却后移入25ml量瓶中，并用6mol/L盐酸稀释至刻度，蒸去盐 酸，加入盐酸(0.02mo 1 /L)溶解，0.2μπι滤膜过滤，取续滤液，供测试用。
[0226] 供试品溶液的检测：以外标法测定供试品液中的氨基酸含量，结果见表22。
[0227] 表22美洲大蠊冻干粉中氨基酸的种类与含量
[0228]
[0229]由表22可知，美洲大蠊有效部位含有水解氨基酸18种（其中色氨酸通过碱水解）， 含游离氨基酸17种，含量为3.76% (天门冬氨酸没有检出），含结合型氨基酸即多肽约 55.64%〇
[0230]本发明的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉，冻干粉分子量3Kd;多肽含量以牛血清 蛋白计，不少于53.94% ;氨基酸以丙氨酸计不少于4.51 % ;尿嘧啶多0.22 %，次黄嘌呤多 0.77%，肌酐彡 4.62%。
[0231]本发明的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉及制备方法采用化学成分检测结合体 外肿瘤细胞生长抑制强度试验，进行抗肿瘤的活性筛选，确定提取方法，并对提取工艺参数 进行优化，得到最佳提取工艺参数;再用HP20大孔树脂对提取液进行纯化处理，筛选出抗肿 瘤有效部位，以探讨美洲大蠊抗肿瘤的物质基础，为开发美洲大蠊有效部位的新制剂奠定 基础。本发明的制备方法技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。 [0232]如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非 用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0233]还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0234]上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:取美洲大 蠊，粉碎成粉末，将所述粉末用石油醚脱脂，然后将脱脂后的粉末用乙醇浸泡，浸泡后的粉 末再进行渗漉，收集渗漉液后浓缩，将浓缩液纯化后再冷冻干燥即得。2. 如权利要求1所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 美洲大蠊粉碎成粗粉。3. 如权利要求2所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 渗漉速度为l_3ml/min/kg。4. 如权利要求3所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 渗漉速度为3ml/min/kg。5. 如权利要求4所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 乙醇浸泡步骤为用粉末10倍量的90 %乙醇浸泡48h。6. 如权利要求5所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 渗漉液浓缩条件为50-60°C浓缩至1: lml/g。7. 如权利要求6所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 浓缩液纯化方法为:加纯化水使浓缩液浓度为0.3g/ml，用2BV所述浓缩液以2BV/h的速度通 过HP20大孔树脂色谱柱，静置lh，然后用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脱lh，收集洗脱液，减 压浓缩至1:2ml/g。8. 如权利要求7所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉的制备方法，其特征在于，所述 冷冻干燥方法为:将纯化后的浓缩液在_60°C下预冷至_40°C，保持2h，然后程序升温至-20 。(：，保持2h，快速升温至30°C解析干燥6h。9. 美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉，其特征在于，所述冻干粉分子量3Kd;多肽含量以 牛血清蛋白计，不少于53.94% ;氨基酸以丙氨酸计不少于4.51 % ;尿嘧啶多0.22%，次黄嘌 呤彡0.77%，肌酐彡4.62%。10. 如权利要求9所述的美洲大蠊抗肿瘤有效部位冻干粉，其特征在于，所述冻干粉采 用权利要求1 -8的方法制备得到。
【文档编号】A61K9/19GK106038607SQ201610632815
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月3日
【发明人】张丹, 徐良, 廖芳, 刘明华, 余昕, 何颖, 陈斯玮, 傅超美
【申请人】西南医科大学