一种用于肠道疾病检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于肠道疾病检测的试剂盒，该试剂盒含有结合Metrnl的适体，能够快速高效的鉴定溃瘍性结肠炎。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的应用价值。
【专利说明】
一种用于肠道疾病检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种用于肠道疾病检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 炎症性肠病（Inf lammatcxryBowelDisease，IBD)又称肠炎，是一组反复发作的慢 性肠炎症性肠道疾病。炎症性肠病主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎 (ulcerativecolitis，UC)两类。在发达国家，发病率达到了 1/1000。在中国，近十年间炎症 性肠病的总病例约为35万。值得注意的是，该病患病人数在逐年增加，与前10年相比，炎症 性肠病总病例数增长约超过24倍，其中，克罗恩病患者数量增长甚至超过15倍。溃疡性结肠 炎病变主要位于结肠的黏膜层，且以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，但可向近端扩展， 导致遍及整个结肠，其重要症状有腹泻、脈血便、腹痛和里急后重，该病病程长，病情轻重不 一，常反复发作，与结肠癌的发病有关，临床上常常表现为反复发作而治愈难度大，被世界 卫生组织列为现代难治病之一。
[0003] 目前，肠镜、病理学及影像学检查是诊断及炎症性肠病患者定期复查的主要手段， 该些检查费用较高，大多数为侵入性的有创检查，风险高，而该疾病病程偏长，患者常需反 复定期复查肠镜及其他检查，患者的忍受性差，严重影响了患者的生活质量及工作。因此， 急需寻找一种对炎症性肠病诊断特异性高，创伤小，操作简单，方便高危人群，能够检测疾 病的发展及预后的血清标志物，该样无论是对临床还是对患者带来很大的利益。
[0004] Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，在NCBI中的注册号为NM_001004431.1，注释为 人神经胶质细胞分化调节因子meteorin样分子。Metrnl蛋白已经在人、小鼠、牛、鸡、非洲瓜 赡和斑马鱼中鉴定出来。
[0005] CN104977415 A中公开了关于Metrnl蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应 用。虽然可以采用抗体通过酶联免疫反应来定量分析Metrnl的含量，但是该方法对抗体的 要求比较高，并且检测成本也比较高，因此，对于贫穷落后地区，并不适宜大面积推广。
[0006] SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可 以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是 体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合 的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮 的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的 核酸分子被洗去，而与革G物质有强未和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯 度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体 后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技术，筛选特定的结合ESP的适配体，进而将适配体制备成为特异性检测ESP的试剂盒，准 确、快速、简便地进行肺吸虫病的诊断与鉴别诊断、以及疗效考核具有重要意义及广阔的应 用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的技术方案通过以下步骤实现：
[0008] 本发明的目的是提供一种Metrnl蛋白的核酸适配体序列。
[0009] 本发明中，所述的Metrnl的核酸适配体(序列1-22)能够特异结合Metrnl蛋白。
[0010] 本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序 列应用，可进一步用于制备特异性结合Metrnl蛋白的试剂盒。
[0011] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5 '-AACATTGACGAAGCGTAGAT(N35) AGAACTTGAGCAGATGCGAC-3 '），其中N35为35个随机寡核苷酸;从中筛选出与METRNL蛋白特异 结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物PI : AACATTGACGAAGCGTAGAT ;引物P2 : GTCGCATCTGCTCAAGTTCT，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司）， 转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司）；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒 并测序反应，上测序仪测序。
[0012]本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以METRNL蛋白为正筛靶标，筛选 与METRNL特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合Metrnl的序列，本发明中命名为适配 体METRNL-1~22。序列如下：
[0035] 以上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行 替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或 缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核 酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。
[0036] 以上述核酸适配子筛选文库为基础，可随机改变文库中间的随机序列区的核苷酸 组成，通过计算机软件模拟寡核苷酸序列的二级结构或三级结构，设计出核酸适配子或改 造从本文库筛选出的核酸适配子。
[0037] 可利用上述任何一个原始或简单改造后的文库进行核酸适配子的筛选、分析、改 造和应用。
[0038] 本发明的有益效果:本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核苷酸文库。文 库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的 多样性。文库固定序列（引物序列）的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效获 得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于METRNL的核酸适配子筛选 获得成功，所述的适配子可以用于制备检测试剂盒，从而用于人肠道疾病的检测。
【具体实施方式】
[0039]实施例1人Metrnl蛋白的获得
[0040] 根据人Metrnl蛋白的氨基酸序列NP_001004431.1获得相应的基因序列，利用CN 1318594 C中实施例1的真核表达蛋白的方法，进行蛋白的表达，采用常规的蛋白纯化方法 得到纯化的蛋白，浓度为150mg/ml，4度储存备用。
[0041] 实施例2适配子的获得
[0042] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，5' -AACATTGACGAAGCGTAGAT(N35) AGAACTTGAGCAGATGCGAC-37 〇
[0043] 所用引物：
[0044] F:5，-AACATTGACGAAGCGTAGAT-3 '
[0045] R:5，-GTCGCATCTGCTCAAGTTCT-3
[0046] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80yg RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与30ug Metrnl蛋白37°C孵育40min，反应 液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素， 0.7mo 1/L醋酸铵，1.6mmo 1/L EDTA，0.15 % SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用 于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出 适配子库，筛选共进行15轮。将最后一轮筛选得到的适配子上测序仪测序。测定得到序列如 SEQ ID NO :1-22所示。
[0047]实施例3特异性高亲和力的Metrnl结合适配子的获得
[0048] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的适配子;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32Ρ]ΑΤΡ于去磷酸化的适配子分子末端。lOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（1_200ηΜ)的Metrnl蛋白37°C孵育30min，各组反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样 品平行做两次测定。计算各个适配子与Metrnl蛋白的解离常数。结果如下：
[0051]从以上结果可以看出，本发明的22个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合Metrnl蛋白。
[0052]实施例4降解活性分析
[0053]分别采用人血白蛋白、IgA、血红蛋白，外周血单核细胞P-糖蛋白，胰腺酶原粒的糖 蛋白2、Metrnl蛋白与22条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与 这些蛋白相结合，而只与Metrnl蛋白结合保持较高的特异性。
[0054] 将所述的适配子，取0.4ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0055]实施例5临床试验分析
[0056] 将22个适配子分别与Metrnl蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检测的标 准曲线。然后将40组样本的血清样本(30组为溃疡性结肠炎患者，10组为正常人群)分别去 1〇μ1加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的22组适配子与40组 的样本溶液混合孵育2〇分钟（一种适配子对应检测50组血清样本），而后磁分离，即可获得 相应的分离的Metrnl蛋白，通过标准曲线浓度检测获得相应的蛋白浓度结果，通过检测，针 对同一个样本，各适配子检测出的浓度几乎没有差距;而各组之间的浓度存在明显的差异， 以正常人的蛋白浓度的平均值作为对照，结果如下：
[0058]从以上结果可以看出，溃疡性结肠炎Metrnl蛋白浓度显著的增加，与正常人之间 可以显著的区分开来。说明本发明的适配子可以用于检测分析。
[0059]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肠道疾病检测的试剂盒，其特征在于:含有结合Metrnl的适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述适体为SEQ ID No. 1-22任一条序列所 示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒用于检测溃疡性结肠炎的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106018828SQ201610451600
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】曹帅
【申请人】曹帅