检测泛素蛋白酶基因PSMB1启动子多态性的方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子多态性的方法和试剂盒。

背景技术：

psmb1基因位于6q27，大小约为22kbp，其编码的产物属于蛋白酶体b型家族，是一种泛素-蛋白酶复合物中的20s核心β-亚单位。蛋白酶体是一种存在于胞质和胞核内的蛋白水解酶复合物，负责降解细胞内大部分蛋白质，在mhci类分子包括hla-b27分子的表达及相关抗原呈递过程中起关键作用。mhci类分子呈递的抗原均来源于蛋白酶体的降解产物。蛋白酶体的功能受其结构组成的调控，其核心部分是由α和β亚单位组成的四环状圆柱形结构，与pa28结合后成为免疫蛋白酶体。psmb1是β环中重要的结构亚单位。β环的改变会影响到降解蛋白质的速度及切割位点，以及内源性蛋白质的降解和抗原的呈递。

并且，psmb1基因的启动子多态性影响着基因的表达情况，引起降解内源性蛋白质产生的抗原肽的数量和性质发生改变。

因此，本领域有必要开发进行psmb1基因的启动子多态性检测的新型方法及试剂，以实现快速、方便、准确的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子多态性的方法和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种利用基因型检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子区多态性的试剂盒，包括：特异性扩增psmb1基因或基因片段的引物，所述的引物扩增出含有相应于seqidno:1中第321位的核苷酸的扩增产物。

在一个优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

1)特异性与seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)结合的探针；

2)识别seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述第321位存在以下的单核苷酸多态性：

第321位t→a；其中，核苷酸位置编号基于seqidno:1。

在另一优选例中，所述引物的序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

在另一优选例中，所述扩增产物的长度为100-2000bp。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的物质：dna的抽提试剂，pcr扩增试剂(如dna聚合酶等)，酶切反应试剂，电泳试剂，和/或说明多态性检测方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种非诊断性地检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子区多态性的方法，包括：

(1)获取待测样品的核酸样品；

(2)检测该核酸样品的psmb1基因，确定是否存在相应于seqidno:1中第321位的核苷酸的多态性。

在一个优选例中，所述第321位存在以下的单核苷酸多态性：第321位t→a；其中，核苷酸位置编号基于seqidno:1。

在另一优选例中，步骤(2)中，采用pcr扩增以及测序法来进行检测。

在另一优选例中，以序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物来进行pcr扩增；并且，pcr反应条件为：

(1)94℃预变性2分钟；

(2)94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；

(3)94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行30个循环；

(4)72℃延伸7分钟。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明所述的snp位点及其邻近序列的多核苷酸序列的示意图；其中方框位置即为本发明所述的多态性位点；两段下划线位置为引物结合位置。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，针对于泛素蛋白酶基因psmb1启动子多态性(snp)，本发明人设计了一种基于pcr以及测序的检测方法，该方法具有准确、便捷、可操作性强的特点。

本发明提供了一种非诊断性地检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子区多态性的方法，包括：(1)获取待测样品的核酸样品；(2)检测该核酸样品的psmb1基因，确定是否存在相应于seqidno:1中第321位的核苷酸的多态性。所述第321位存在以下的单核苷酸多态性：第321位t→a；其中，核苷酸位置编号基于seqidno:1。

在本发明的优选方式中，用pcr扩增以及测序法来进行检测。通过针对泛素蛋白酶基因psmb1启动子设计引物，只需通过一个常规pcr反应，外加依托于现有测序平台的测序技术，即可达到检测snp基因型的目的。经验证，本发明的方法操作简单，且灵敏度高、重现性好。适用于对泛素蛋白酶基因psmb1启动子多态性的检测。

本发明人通过对引物的筛选，获得一种可特异扩增泛素蛋白酶基因psmb1启动子特定区段的引物，所述的引物具seqidno:3和seqidno:4所示的核苷酸序列，其特异性扩增效果良好，pcr扩增成功率接近100％，特别适用于复杂体系的pcr扩增。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明的技术方案中，也可以进一步采用特异性与seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)结合的探针来进行检测；或则，采用特异性识别seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)的限制性内切酶本来检测。

例如，可采用taqman实时荧光pcr方法来进行所述snp的鉴定。taqman探针法是高度特异的定量pcr技术，其核心是利用taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

获取待测样品的dna的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的dna提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

利用本发明的引物及探针，只需进行聚合酶链反应(pcr)和测序，并通过判断相应的多态性位点的核苷酸，而且所需的样品量很少。pcr技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异dna片段的方法。

pcr反应的体系中通常包括：pcr反应缓冲液、dntps、待测dna样品、上/下游引物、dna聚合酶、灭菌去离子水。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或dna芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用psmb1蛋白特异的引物进行rna-聚合酶链反应(rt-pcr)体外扩增也可检测psmb1蛋白的转录产物。

本发明所述的检测可以针对cdna，也可针对基因组dna；所述的检测可以是针对复杂体系的样品。

作为本发明的优选方式，为了配合seqidno:3和seqidno:4所示的核苷酸序列，优化pcr扩增效果，本发明人还提供了优化的pcr反应条件包括如下的步骤：

(1)94℃预变性2分钟；

(2)94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；

(3)94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行30个循环；

(4)72℃延伸7分钟。

本发明还提供了一种利用基因型检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子区多态性的试剂盒，所述试剂盒中含有seqidno:3和seqidno:4所示的引物。在本发明的优选方式中，所述的试剂盒中还含有特异性与seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)结合的探针，或识别seqidno:1中第321位的核苷酸(较佳地，还包括其邻近的核苷酸)的限制性内切酶。

此外，所述的试剂盒还可含有其它试剂，如(但不限于)：

(a)各种pcr反应用试剂，例如但不限于：taq酶，pcr缓冲液，dntp，dna聚合酶等；或

(b)各种提取dna(即制备pcr反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、nacl等；或

(c)提取dna的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有说明试剂盒操作方法的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明的试剂盒可用于psmb1蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，psmb1蛋白的多聚核苷酸的多态性可用于判断psmb1蛋白的表达与否或在疾病状态下psmb1蛋白的异常表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、snp的获取和鉴定

一、研究对象

在知情同意的基础上，收集了人的外周血样本。

二、实验方法和结果

1、dna提取

用常规酚-氯仿法从人的外周血样本中提取dna(也可采用商业化的试剂盒，提取dna)，浓度校正至20ng/μl后，用于常规pcr扩增。

2、用于pcr和测序中的引物设计

根据genbank中psmb1的基因组序列，设计和合成以下引物：

有义引物p1：tgcatctgcttttcaatgct(seqidno:3)；

反义引物p2：gcctgtgtatgagtggctga(seqidno:4)。

3、psmb1基因的pcr扩增

以提取的dna为模板，用taq酶在geneamp9700pcr仪上以touchdown程序进行pcr扩增。

pcr反应条件为：

(1)94℃预变性2分钟；

(2)94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；

(3)94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，上述共进行30个循环；

(4)72℃延伸7分钟。

pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得psmb1基因的扩增产物。

4、snp的发现和检测

pcr产物经resin树脂纯化后，用abi-3730dna测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(abi))进行测序，用polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/polyphred.html)进行序列的判读、基因分型和snp确认。

包含所述snp位点的序列的示意图见图1，该序列中，第321位w即为本发明所述的多态性位点；第67～86位片段以及第616～635位片段位置为引物结合位置，扩增产物大小为569bp。

野生型的psmb1基因启动子区的相应多核苷酸序列如下：

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突变型的psmb1基因启动子区的相应多核苷酸序列如下：

atttcagttaccttaaaaagtcccttcttcccctttatagtcactctgctggccccaggtaactactgcatctgcttttcaatgctgaagattagttttgtctattctagaatttcatatagatggaatcagagtgtatgcttttttgtgtatgtctgacttcttagcccagtgtactgtttgtatatcagtagttaatccattgtatagctaagtatcactccattgtttggatgttccacagttcatccattctccagttgctcacatttggggtctttccagtttggagctattgcgaataaaagcactgtaaacatatgtgtagactttgaatgcactgtttttacttctcatgggtaaatacttaggagtaggattgctaggtcctatattggtatatgtataactttataagaaactgccaaactgttttttgaagtggctgtattgttttgcagcataagagatttaagttgctccacatcctcaccaacactttctgctgtcagtctttttactttcactctagtgattgcttagtagtatcttattgtggttttgatttttatttgcctgattactaatgtttctgagcaccttggcaagtgcttgtcagccactcatacacaggcccacctcactttactgcacttcactttactgcatgtttgacaaattgaaggttgtggtaaacctgtacccagcaagtctgttggcattatttttccaaaagtgtgt(seqidno:2)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海产业技术研究院;上海人类基因组研究中心

<120>检测泛素蛋白酶基因psmb1启动子多态性的方法和试剂盒

<130>186322

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>741

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

atttcagttaccttaaaaagtcccttcttcccctttatagtcactctgctggccccaggt60

aactactgcatctgcttttcaatgctgaagattagttttgtctattctagaatttcatat120

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<210>2

<211>741

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>2

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ttactgcatgtttgacaaattgaaggttgtggtaaacctgtacccagcaagtctgttggc720

attatttttccaaaagtgtgt741

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>3

tgcatctgcttttcaatgct20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>4

gcctgtgtatgagtggctga20