专利名称：包含α淀粉酶和蛋白酶的清洁系统的制作方法
技术领域：
本发明描述了涉及芽孢杆菌属(Bacillus)的α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。所述组合物和方法对冷水清洁的应用特别有效。背景淀粉是直链淀粉(15-30 % w/w)和支链淀粉(70-85 % w/w)的混合物。直链淀粉由 α -1，4-连接的葡萄糖单位的线性链组成，具有从约60，000至约800，000的分子量(MW)。 支链淀粉是每24-30个葡萄糖单位就含有α _1，6分支点的分支聚合物。它的MW可高达一亿。形式为浓缩葡萄糖浆的糖类来自淀粉，目前由酶催化过程来生产，所述过程包括 (1)用α淀粉酶液化(或稀化)固体淀粉至具有约7-10的平均聚合度的糊精；和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)将所获得的液化淀粉(即，淀粉水解物)糖化。所获得的糖浆具有高葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖浆之后都被酶促异构为葡萄糖/ 果糖混合物，称为异糖浆(isosyrup)。α淀粉酶(α -1，4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)是一类通过随机切割内部的α-1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖的酶。该类酶在以下领域具有许多重要的商业应用，例如淀粉加工的初始阶段(液化)、纺织品脱浆、再生纸脱墨、造纸和纸浆工业的淀粉修饰、湿酿酒糟(wet corn milling)、醇生产、甜味剂(例如，糖)生产、饮料工业、酿造业、油田、动物饲料以及去垢剂基质中的清洁剂。例如，此类酶可用于在餐具洗涤和衣物洗涤中去除淀粉性污渍。α淀粉酶是从多种细菌、真菌、植物和动物来源中分离的。工业上，许多重要的α 淀粉酶分离自芽孢杆菌。一种表征过的α淀粉酶是嗜碱性芽孢杆菌菌株TS-23的酶，所述菌株生产至少五种表现出淀粉水解活性的酶(Lin等人，Biotechnol Appl Biochem, 28 61-68，1998)。芽孢杆菌TS-23的α淀粉酶具有最优为9的ρΗ，虽然它在宽泛的ρΗ范围内都是稳定的(即，ΡΗ4. 7至10. 8)。它的温度最优为45°C，虽然该酶在较低温度下也具有活性，例如15-200C ο对具有改变的生物化学特征并提供改善的工业应用性能的变体淀粉酶(例如，α 淀粉酶)仍存在需要。概述本发明描述了涉及清洁组合物的组合物、系统和方法，所述清洁组合物包括芽孢杆菌属α淀粉酶和淀粉酶，或由芽孢杆菌属α淀粉酶和淀粉酶组成，或基本由芽孢杆菌属 α淀粉酶和淀粉酶组成。在一个方面，提供了这样的清洁组合物，所述清洁组合物包括(a)具有与SEQ IDNO :2所述氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列的α淀粉酶；和(b)蛋白酶；其中，所述组合物提供的清洁水平大于对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的水平。在一些实施方案中，所述系统是冷水清洁系统。在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶ΒΡΝ’或其变体。在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶ΒΡΝ’的Y217L变体。在一些实施方案中，清洁组合物还包括至少一种表面活性剂。在一些实施方案中， 清洁组合物还包括选自脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、 半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶(perhydrolase)、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的至少一种其他的酶。在一些实施方案中，α淀粉酶源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在一些实施方案中，α淀粉酶是具有淀粉酶活性的变体α淀粉酶的成熟形式，并且在选自下述的一个或多个位置上包含取代1,2,3,4,5,7,15，16，17，18，19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，50，51，52，53， 54，55，56，59，60，70，71，72，73，75，78，83，87，90，91，93，94，95，104，105，107，108，110， 112，113，116，118，125，126，128，129，130，131，134，136，138，142，144，147，149，150，152， 154，156，158，160，161，162，165，166，168，169，170，172，174，177，178，182，183，185，189， 192，195，197，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，236，237，246，250，254，255， 257，264，267，269，270，272，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318， 319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393， 394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，447，448，451，453，459，465，470，475，476， 483 和 484 ；其中所述位置对应于SEQ ID NO 2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代在一个或多个位置的天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数> 1.0，活性测量的性能指数> 1.0的α淀粉酶变体。在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、 128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、 210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401 和 438 的一个或多个位置包含取代，并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数> 1.5和稳定性测量的性能指数> 1.0的α淀粉酶变体。在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、 91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、 374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数> 1. 5和活性测量的性能指数> 1. 0的α淀粉酶变体。在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自83、125、128、131、160、178、182、183、 185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476 和 483 的一个或多个位置上包含取代。
在一些实施方案中，α淀粉酶是成熟形式的变体α淀粉酶，在选自83、125、128、 131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476 和 483 的一
个或多个位置上包含取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO :2所述氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去垢剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一个有益的效果。在一些实施方案中，α淀粉酶是成熟形式的变体α淀粉酶，在选自5、32、83、95、 154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483 和 484 的一个或多个位置上包含取代；其中所述位置对应于SEQ ID NO :2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了这样的α淀粉酶变体，所述变体在ρΗ8下的活性、pHIO下的活性、16°C下的活性、32°C下的活性的性能指数值为0. 5或更高，在去垢剂中的稳定性或热稳定性的性能指数值为0. 5或更高。在一些实施方案中，α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO 2所述氨基酸序列的243位上的取代。在一些实施方案中，α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO :2所述氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。在一些实施方案中，α淀粉酶变体源自具有与选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO 12,SEQ ID Ν0:13禾口 SEQ ID NO 14的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列的亲本α淀粉酶。在一些实施方案中，α淀粉酶变体与SEQ ID NO :2所述氨基酸序列具有至少75%的序列同一性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体具有与SEQ ID Ν0:2所述氨基酸序列至少80%的序列同一性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体具有与SEQ ID NO 2 所述氨基酸序列至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体在选自对应于SEQ ID NO 2所述氨基酸序列的 128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去垢剂稳定性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括(a)在125位的丙氨酸，在128位的半胱氨酸，在131位的异亮氨酸，在165位的异亮氨酸，在178位的亮氨酸，在182位的甘氨酸，在202位的酪氨酸，在305位的精氨酸，在319位的苏氨酸，或在475位的精氨酸；(b)取代 m28C+Kl78L+Tl82G+Y305R+G475K，和选自S125A、T131I、T165I、F202Y和D319T的至少一种其它的取代；或(c)取代N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K,
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K,或S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K ；其中所述变体任选的还包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失； 并且其中所述位置对应于SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括475位的取代。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。在一些实施方案中，α 淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。在一些实施方案中，在低于约25°C的温度下测量时，清洁组合物提供了大于对缺少α淀粉酶或缺失蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平。在一些实施方案中，在低于约20°C的温度下测量时，清洁组合物提供了大于对缺少α淀粉酶或缺失蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平。在一些实施方案中，α淀粉酶和蛋白酶是共同配制的。在另一个方面，提供了清洁织品或硬表面的方法，包括将织品或硬表面与任意所述的清洁组合物接触。在一些实施方案中，所述方法是在低于约25°C的温度下实施的。在一些实施方案中，所述方法是在低于约20°C的温度下实施的。在相关的实施方案中，α淀粉酶变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、50、51、52、53、54、 55、56、57、59、60、70、71、72、73、75、78、82、83、87、90、91、93、94、95、103、104、105、107、108、 110、112、113、114、115、116、118、121、123、125、126、127、128、129、130、131、132、134、135、 136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、164、165、166、 167、168、169、170、171、172、174、175、176、177、178、179、182、183、185、186、188、189、190、 191、192、193、195、197、199、200、201、202、203、207、210、214、217、221、228、234、237、238、 239、240、243、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、272、273、275、279、283、 284、298、301、303、305、306、310、311、314、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、 344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、 444、447、448、451、453、459、465、479、475、483 和 484 的一个或多个(优选 1、2、3、4、5、6、7、 8,9,10个或更多个)位置上包含取代，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO 2所述的参照 α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、 ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本 α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14 组成的组的成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% )相同。在优选的实施方案中，所述位置选自1、2、3、4、5、7、16、17、18、19、22、25、26、沘、29、30、32、35、36、37、57、60、70、71、72、 73、75、78、82、83、87、90、91、93、94、95、103、104、105、108、112、114、115、116、118、121、123、 125、126、128、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、 156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、171、172、174、175、176、177、178、 179、182、183、185、186、189、190、191、192、193、195、197、199、202、207、214、217、221、228、234、237、238、243、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、272、273、275、279、 283、284、298、301、303、305、306、310、311、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、 344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、 447、451、453、459、465、479、475和483，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO 2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，所述位置选自1、2、3、4、5、7、16、 17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、57、60、70、71、72、73、75、78、82、83、90、91、 93、94、95、103、104、105、108、112、114、115、116、118、121、123、125、126、128、129、130、131、 132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、 164、165、166、167、168、169、171、172、174、175、176、177、178、179、185、186、189、190、191、 192、193、195、197、199、202、207、214、217、221、228、234、237、238、246、250、254、255、257、 264、266、267、268、269、270、273、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、318、 319、322、323、336、337、338、339、340、344、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、 401、407、408、419、433、436、438、447、451、453、459、465、479、475 和 483，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在优选的实施方案中， α淀粉酶变体包括58位的酪氨酸和236位的丙氨酸，且其中所述位置是对应SEQ ID NO 2 所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体包括对3 位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸，且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自182、183、 305、320、379、407、419和475的一个至8个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE_Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。 在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由 SEQ ID NO 2,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14 组成的组的任一成员至少 75% (优选80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98(%或99(%)相同。在优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X182N、X183N、 X305Q、X320F、X379A、X407D、X419S和X475T。在这些实施方案的子集中，取代包括1至8 个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)的 T182N、G183N、Y305Q、Q320F、P379A、Q407D、T419S 和 G475T。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自160、182、 183、189、305、379和475的一个至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99% )相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至7个的X160E、X182G、X183N、X189P、X305G、X379E和X475T。在这些实施方案的子集中，取代包括1至7个(例如，1、2、3、4、5、6 或 7 个)的 Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E 和 G475T。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、 214、279、305、319、320和475的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE_Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。 在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%)相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X125A、 X182A、X214Q、X279N、X305R、X319T、X320N和X475R。在这些实施方案的子集中，取代包括 1 至 8 个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)的 S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、 Q320N 和 G475R。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自7、182、298、 376、379、407、419和453的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE_Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13 禾口 SEQ ID N0:14 组成的组的任一成员至少 75% ( 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98% 或99%)相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X7H、X182W、X298Q、 X376R、X379K、X407W、X419S和X453W。在这些实施方案的子集中，取代包括1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)的 E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S 和 L453W。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自128、178、182 和185的一个至四个(例如1、2、3或4个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和 ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO :11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14组成的组的任一成员至少75% (优选80%、85%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% )相同。在另一个实施方案中，所述取代包括 1 至4个(例如 1、2、3 或4 个)的 N128C、K178L、T182G 和 A185D。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、 183、189、279、305、319、379 和 475 的一个至九个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99% )相同。在另一个实施方案中，所述α淀粉酶变体包括在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在 189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、128、 178、182、183、189、279、305、319、379 和 475 的一个至4^一个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或11个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，和 320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、 ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本 α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO :13和 SEQ ID NO :14组成的组的任一成员至少 75% (优选80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)相同。在另一个实施方案中，所述α 淀粉酶变体包括在125位的丝氨酸或丙氨酸；在1 位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、 谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸； 和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO :2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个优选的实施方案中，取代选自m^C、T131I、 T134P、Q138E、Y160I、T165I、T165V、K178L、T182A、T182C、T182D、T182M、T182F、T182N、 T182G、T182P、T182Q、A185D、A185E、E189P、S243D、S243E 和 S243Q。使用示例性α淀粉酶作为起点，即“骨架”，制备和测试刚刚描述过的氨基酸突变，然而，可以理解可以在相关的α淀粉酶中制造等价的氨基酸突变，在所述相关的α淀粉酶中突变预期制造相似的效应和产生相似的优点。其他用作骨架的示例性的α淀粉酶包括但不限于本文中鉴别的那些。本公开内容进一步提供了编码任一前述篇幅中的α淀粉酶变体的分离的核酸。 在一个实施方案中，包括了这样的表达载体，所述载体包含与启动子有效组合的分离的核酸。在另一个实施方案中，包括了包含所述表达载体的宿主细胞。另一个实施方案提供了生产α淀粉酶变体的方法，包括用包含编码α淀粉酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合生产所述α淀粉酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。另一个实施方案还包括收获所生产的α淀粉酶变体的步骤。另一个实施方案包括芽孢杆菌属物种作为宿主细胞，且在另一个实施方案中，所述芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，清洁组合物包括α淀粉酶、蛋白酶、至少一种可以是其他淀粉酶或其他蛋白酶的其他酶。在一个实施方案中，其他的酶是中性金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和/或过氧化物酶。在另一个实施方案中，清洁组合物是洗衣去垢剂，在另一个实施方案中，清洁组合物是餐具洗涤去垢剂。在另一个实施方案中，清洁组合物是含漂白剂的洗衣和/或餐具洗涤去垢剂。在另一个实施方案中，清洁组合物是用于织品的预处理，例如在洗涤之前应用。在另一个实施方案中，清洁组合物是洗衣去垢剂或餐具洗涤去垢剂的添加物。本公开内容还提供了清洁的方法，包括将包含织品的表面和/或物体与包含所述α淀粉酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个实施方案中， 方法是餐具洗涤方法，包括步骤提供i)餐具洗涤组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下将餐具与餐具洗涤组合物接触。在另一个实施方案中，方法是织品清洁方法，包括步骤提供i)织品清洁组合物，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下将衣物与织品清洁组合物接触。在另一个实施方案中，方法涉及将材料从机织织物(woven fabrics)中的纱线上去除，如在纺织品脱浆(textile desizing)的情况下。根据本说明书，组合物和方法的上述各个方面和实施方案是显而易见的。附图的简要说明
图1提供了 SEQ ID NO :2和5_14分别所述的各种参照淀粉酶的成熟形式的比对。 使用 MUSCLE 3. 7 多重序列比对算法(Edgar，Nucleic Acids Research, 32 1792-1797, 2004)比对序列。图2提供了含有地衣芽孢杆菌(B. lichenif0rmis)LAT启动子(Plat)和来自 pUB 110 (McKenzie等人，Plasmid, 15 =93-103,1986)的其他元件的pHPLT载体的图，所述其他元件包括复制酶基因(r印pUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标志物(bleo)。图3提供了 pHPLT-BASE质粒的图。图4 提供了 pHPLT-ACE-S243Q 质粒的图。图5提供了显示多个α淀粉酶在洗衣去垢剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下W9 (BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-T279N-D319T-Q320N-G475R) ；WlO ( BASE-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-D319T-G475R) ；Wll (BASE-S125A-N128C-K178L-T1 82G-S243Q-Y305R-G475R ；和 ACE-S243Q-G475K)。图6提供了显示多个α淀粉酶在洗衣去垢剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下BASE-X8C、BASE-W10EK、ACE-QK和对照(基准的商业酶)。图7A提供了显示在ACE α淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图7Β提供了显示在ACE-S243Q-G475K(ACE-QK) α淀粉酶和BPN' Y217L 枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图 8 提供了显示在 BASE-X8C(W11-T131I-T165I) α 淀粉酶和 BPN' Y217L 枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图 9 提供了显示在 BASE WlOEK(BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K) α淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图10提供了显示在ACE-SM3Q_G47^((ACE-QK) α淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。详细说明描述了涉及芽孢杆菌属α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。组合物和方法对于冷水型清洁应用特别有效，例如餐具洗涤(包括自动餐具洗涤)和洗衣。在一些情况下，组合物和方法涉及变体α淀粉酶。所述清洁组合物和方法，以及变体的各个特征将详细的描述如下。1、α淀粉酶变体的定义和系统命名本文中除非另外定义，则本文中使用的所有的技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员常规理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 2 版，John Wiley 和 Sons，New York(1994)和 Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)为本领域技术人员提供了本文使用的许多术语的通用字典。所述组合物和方法的一些方面取决于基因工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。下列资源包括了可用于本组合物和方法中的通用方法学的描述=Sambrook等人，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL (第 2 版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人编辑，CURRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY(1994)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，本组合物和方法并非意在限于所描述的任何特定的技术、规程和试剂，这是可以改变的。虽然任何与本文所述的相似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本组合物和方法，但优选的方法和材料描述如下。当描述蛋白质及其编码基因时，基因的名称一般是斜体且非大写的，而蛋白质的名称一般是非斜体且首字母大写。除非文中明确地另外指出，单数形式“一个”和“这个”包含了复数含义。因此，例如，指代“酶”包括了复数的此种酶，指代“制剂”包括了指代本领域技术人员已知的一个或多个制剂及其等价物，如此类推。本文中提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用清楚地并入到本文中。1.1 定义出于清楚的目的，定义下列术语。本文所用的术语“淀粉”指包含植物复合多糖糖类的任意物质，其包含具有化合式 (C6HltlO5)x(其中X可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。具体而言，该术语指任意基于植物的物质，其包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更具体而言是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、 高粱、麸、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)。如本文所使用，“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。通常，α -淀粉酶(EC3. 2. 1. 1 ； α-D-(1 — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割淀粉分子内a-D-α —4)0-糖苷键的内切酶。与此相反，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶(EC3. 2. 1.2;a-D-(l —4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖a -淀粉酶(EC3. 2. 1. 133)从底物的非还原端切割淀粉分子。β -淀粉酶、α -葡糖苷酶(EC3. 2. 1. 20 ； α -D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3. 2. 1.3 ;a-D-(1 — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖(malto-oligosaccharides)。如本文所使用，淀粉酶包含任意/所有淀粉酶，其包含葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶，如芽孢杆菌属物种，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的那些，而α -淀粉酶包含这些酶的前述子集。 如本文中使用的，“芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α -淀粉酶”和类似的词组，指源自芽孢杆菌属物种菌株TS-23的α-淀粉酶。编码所述α-淀粉酶的基因可以是编码所述 α -淀粉酶的野生型基因或密码子优化的多核苷酸。芽孢杆菌属物种菌株TS-23的成熟的 α -淀粉酶(按从氨基至羧基的方向)是(SEQ ID NO 1)NTAPINETMMQYFEffDLPNDGTLffTKVKNEAANLSSLGITALffLPPAYKG50
TSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVY100
AD WFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAffTKFDFPGRGN150
TYSSFKffRffYHFDGTDffDESRKLNRIYKFRSTGKAffDffEVDTENGNYDYL200
MFADLDMDHPEVVTELKNWGTffYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDffLT250
YVRNQTGKNLFAVGEFffSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTAS300
KSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSffVEPffFKPL350
AYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQ400
RDYIDHQDIIGffTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVF450
YDLTGNRSDTVTINADGffGEFKVNGGSVSIWVAKTSNVTFTVNNATTTSG500
QNVYVVANIPELGNWNTANAIKMNPSSYPTWKATIALPQGKAIEFKFIKK550
DQAGNVIffESTSNRTYTVPFSSTGSYTASffNVP583如本文所使用，“ α _淀粉酶变体”及类似的短语指参照α -淀粉酶的变体/突变体，就该参照α-淀粉酶的亲本(野生型；参考)氨基酸序列而言，其包含氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“变体”与术语“突变体”可互换使用。就亲本信号序列而言，变体α-淀粉酶可在信号序列中包含突变。此外，变体α-淀粉酶可以是含有异源α-淀粉酶信号序列(如来自地衣芽孢杆菌(LAT))的融合蛋白质的形式。如本文中使用的，词组“亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α-淀粉酶”、“野生型芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α -淀粉酶”、“参照芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α -淀粉酶”和类似的词组，指芽孢杆菌属物种菌株TS-23的多肽。出于便利，术语可以是缩写的“亲本酶”、“野生型酶”、“亲本多肽”、“参照多肽”等。亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α -淀粉酶可在亲本多肽的信号序列中包含突变。此外，亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23 α-淀粉酶可以是包含异源性α-淀粉酶信号序列的融合蛋白的形式，例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列(LAT)。如本文中使用的，“亲本核酸/多核苷酸”、“野生型核酸/多核苷酸”或“参照核酸 /多核苷酸”指编码亲本多肽的核酸序列及与其互补的核酸。如本文所使用的，“变体核酸/多核苷酸”指编码变体多肽的核酸序列或与其互补的核酸，或就亲本多核苷酸序列或与其互补的核酸而言具有至少一个碱基取代、插入或缺失的多核苷酸序列。指定时，此类核酸可以包含与参考序列具有指定程度的同一性的序列， 或能够例如在严格条件[例如，50°C禾口 0. 2X SSC(1X SSC = 0. 15M NaCl, 0. 015M柠檬酸三钠，pH7. 0)]或高度严格条件[例如，65°C 和 0. IX SSC (IX SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M 柠檬酸三钠，pH7. 0)]下与参考序列杂交的序列。可以优化变体核酸以反映用于指定的宿主生物，如甲基营养酵母(例如毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)等)或丝状真菌(例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))等)或其他表达宿主(例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Sti^ptomyces)等)的优选的密码子选择。如本文中所使用的，当用于提到主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组体” 指已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变修饰该主题，或指该细胞衍生自经这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于该细胞的天然(非重组体)形式内的基因或表达否则将异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。如本文中所使用的，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从至少一种其天然与之结合和见于自然界中的成分移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。本文所用的术语“纯化的”指处于相对纯的状态的，例如至少约90%纯的，至少约 95%纯的，至少约98%纯的，或甚至至少约99%纯的物质(例如分离的多肽或多核苷酸)。本文所用的术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶暴露于升高的温度后保持活性的能力。通过其以分钟、小时或天给出的半衰期(t1/2)测量酶，如α-淀粉酶的热稳定性，在限定的条件下，酶活性在半衰期内丧失一半。可以通过在暴露于(即通过其攻击)升高的温度后测量残留的α-淀粉酶活性来计算半衰期。本文所用的“ρΗ范围”指酶显示催化活性的ρΗ值的范围。本文所用的术语“ρΗ稳定的”和“ρΗ稳定性”指酶在大范围的ρΗ值保持活性预定的时期(例如15分钟、30分钟、1小时等)的能力。本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，可互换使用。这种氨基酸序列显示活性时，可将它们称为“酶”。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。本文所用的术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体和合成分子。 核酸可以是单链的或双链的，且可以是化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可用一个以上密码子编码特定的氨基酸，本组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，分别以5'至3'的方向从左至右书写核酸；以氨基至羧基的方向从左至右书写氨基酸序列。本文所用的术语“同源物”指与参考氨基酸或核苷酸序列具有某种程度的同一性， 或具有另一指定的共同结构或功能特征的氨基酸或核苷酸序列。同源序列用来包含这样的氨基酸序列，使用常规序列比对工具(例如Clustal、BLAST等)，其与主题序列具有至少 75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性。通常，除非另作指定，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。如本文所使用，“杂交”指一条核酸链通过其与互补链形成碱基配对的方法，如印迹杂交技术和PCR技术过程中所发生。如本文所使用，通过体外化学或酶促合成产生而非通过生物产生“合成”分子。如本文所使用，用来谈论细胞时，术语“转化的”、“稳定转化的，，和“转基因的，，指该细胞具有整合入其基因组或作为保持多代的附加型质粒携带的非天然(例如异源的)核酸序列。在将核酸序列插入细胞的背景中，术语“引入”指本领域已知的“转染”、“转化”或
“转导”。本文所用的术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指已将包含编码目的多肽(例如变体α-淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体引入其中的生物。 示例性宿主菌株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包含从细胞，如芽孢杆菌属物种的细胞产生的原生质体。提到多核苷酸或蛋白质时，本文所用的术语“异源的”指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。提到多核苷酸或蛋白质时，本文所用的术语“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。如本文所使用，术语“表达”指通过其来根据基因的核酸序列产生多肽的方法。该方法包括转录和翻译二者。本文所用的“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主中表达以便于选择携带该基因的宿主细胞的基因。选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或新霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。本文所用的“培养”指在适宜的条件下在液体或固体培养基中培养微生物细胞群体。培养包括发酵性生物转化含有颗粒淀粉的淀粉底物为终产物(通常在容器或反应器中)。本文所用的“发酵”是通过微生物酶促降解有机物来产生更简单的有机化合物。虽然发酵通常发生于厌氧条件下，但此术语并非旨在仅限于严格的厌氧条件，因为在氧气存在下也发生发酵。本文所用的“基因”指涉及产生多肽的DNA片段，并包含编码区、编码区之前和之后的区域和单个编码片段(外显子)间的间插序列(内含子)。本文所用的“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。 载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。本文所用的“表达载体”指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，该DNA序列与能够影响该DNA在适宜的宿主中表达的适宜的控制序列有效连接。此类控制序列可以包含影响转录的启动子、控制转录的可选的操纵基因序列、编码mRNA上适宜的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。本文所用的“启动子”是涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。示例性启动子是地衣芽孢杆菌α -淀粉酶(AmyL) 启动子。本文所用的术语“有效连接”指指定的成分处于允许它们以预期的方式发挥功能的关系(包括但不限于毗连)中。例如，与编码序列有效连接的调控序列将如此连接，使得该编码序列的表达处于该调控序列的控制下。本文所用的术语“处于转录控制下”指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与促成转录起始或促进转录的元件有效连接。本文所用的术语“处于翻译控制下”指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻译为多肽依赖于其与促成翻译起始或促进翻译的元件有效连接。如本文中使用的，“信号序列”是附着在蛋白质的N端部分的氨基酸序列，其有利于蛋白质分泌到细胞外。胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。如本文中使用的，“生物学活性的”指序列具有特定的生物学活性，例如酶活性。在本发明的淀粉酶的情况下，所述活性是α -淀粉酶活性。如本文中使用的，“水硬度”是对水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。如本文中使用的，术语“冷水”指温度低于约25°C的水。具体而言，冷水指温度低于约20°C的水。示例性的冷水范围是从约15°C至约25°C，从约15°C至约20°C。如本文中使用的，术语“性能指数(PI) ”指变体性能与亲本或参照淀粉酶的比值。 性能(即，特性)的测量包括热稳定性、清洁性能、表达水平等，根据上下文是显而易见的。如本文中使用的，改善性能的突变被称为“上升突变(up mutation) ”，对于特定的特性具有PI > 1。“中性突变”对于特定的特性具有PI >0.5。“无害突变”对于特定的特性具有PI >0.05。“有害突变”对于特定的特性具有PI <0.05。“组合突变”对于至少一种特性具有PI ^ 0. 5，且对于所有特性具有PI > 0. 05。组合突变可以在同一个变体中共存，产生具有至少一种有益特性的酶。如本文中使用的，术语“活性测量”指测量本文所述的酶活性。此类活性测量包括在PH8下的清洁性能、pHIO下的清洁性能、16°C下的清洁性能、32°C下的清洁性能和使用合成底物的活性。如本文中使用的，术语“稳定性测量”指测量本文所述的酶稳定性。此类稳定性测量包括在去垢剂中的稳定性和热稳定性。如本文中使用的，术语“共同配制”意指对象成分(例如酶)共存于同一液体、半固体或干燥的组合物中。如本文中使用的，“糖化作用”是指淀粉向葡萄糖的酶促转化。如本文中使用的，“胶凝作用”指通过蒸煮溶解淀粉分子形成粘稠的悬浮液。如本文中使用的，“液化”指淀粉转化中的阶段，其中胶凝作用的淀粉水解产生低分子量的可溶性糊精。如本文中使用的，术语“初级液化”指浆液的温度升高或接近其胶凝作用温度时的液化步骤。在温度升高后，将浆液通过热交换器或喷射至200-300° F的温度，例如 220-235° F。在用于热交换器或喷射温度后，将浆液在所述温度下保持3-10分钟的时间段。保持浆液在200-300° F的这一步骤就是初级液化。如本文中使用的，术语“次级液化”指在初级液化(加热至200-300° F)之后的液化步骤，此时允许浆液冷却至大气温度。该冷却步骤可以是30分钟至180分钟(3小时)， 例如90分钟至120分钟(2小时)。如本文中使用的，术语“次级液化的分钟数”指从开始次级液化时至测量DE时已流逝的时间。如本文中使用的，术语“聚合度(DP) ”指给定糖类中的无水呋喃葡萄糖单位的数目。DPl的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP > 3表示具有聚合度大于3的聚合物。如本文中涉及淀粉转化时使用的，术语“终产物”或“理想的终产物”指从淀粉底物酶促转化成的具体的碳源来源的分子。如本文中使用的，术语“干燥固体含量(ds)”指浆液中的总固体，以％干重表达。如本文中使用的，术语“浆液”指含有不可溶的固体的含水混合物。如本文中使用的，术语“剩余的淀粉”指在发酵或酶促水解含淀粉的底物后，组合物中剩余的淀粉(可溶的或不可溶的)。如本文所使用，“回收步骤”指醪液成分的回收，其可含有剩余的淀粉、酶和/或发酵含淀粉底物的微生物。如本文中使用的，术语“醪液”指含有可发酵碳源(例如糖类)的水性混合物，其可以用来产生发酵产物，如乙醇。术语“啤酒”和“醪液”可互换使用。如本文中使用的，术语“釜馏物”指未发酵的固体和水的混合物，其表示从发酵醪液去除醇后的残留物。如本文中使用的，术语“干酒糟(DDG) ”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS) ”指谷粒发酵的有用副产物。如本文所使用，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。 产乙醇微生物由于它们表达单独或一起将糖转化为乙醇的一种或多种酶的能力而是产乙醇的。如本文所使用，术语“乙醇产生者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任意生物或细胞。通常，产乙醇细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包含真菌微生物，如酵母。优选的酵母包含酵母属(Saccharomyces)菌株，尤其是酿酒酵母(S. cerevisiae)。如本文中使用的，就淀粉酶和它们的底物而言，术语“接触”指将酶置于足够接近底物，以使酶能够将底物转化为终产物。接触可包括混合。如本文中使用的，术语“源自”意指“起源自”、“基于”、“获得自”、“可获得自”或“分离自”，取决于上下文。如本文中使用的，术语“酶促转化”一般指通过酶作用(例如，淀粉酶)对底物(例如，淀粉)的修饰。如本文所使用，术语“分解”指与生物膜中的单个微生物细胞连接和结合在一起的生物膜基质中的多糖的水解，从而可从生物膜释放和去除微生物细胞。如本文中使用的，“样片(swatch) ”是可以在其上应用污渍用于评估组合物清洁效率的一片材料，如织物。如本文中使用的，术语“比活”指在特定条件下每单位时间通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活表示为单位(U)/mg蛋白质。如本文中使用的，术语“产量”指方法生产的终产物的量，例如以浓度、体积、量或起始材料的百分比来表示。如本文中使用的，“ATCC”指位于Manassas，Va. 20108 (ATCC)的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。如本文中使用的，“NRRL，，指 Agricultural Research Service Culture Collection,National Center for Agricultural Utilization Research(之前禾尔为USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria, IL0
数值范围包括定义范围的数。一般而言，小标题是描述性的，并非意在限制。1. 2 侖名在本说明书和权利要求中，氨基酸残基使用常规的单字母和三字母代码。为了便于参照，通过使用下列命名描述本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体原始氨基酸位置取代的氨基酸。根据这一命名，例如用丙氨酸取代242位的丝氨酸显示为Ser242Ala或S242A。删除30位的丙氨酸显示为Ala30 *或A30 *或ΔΑ30。插入额外的氨基酸残基，如赖氨酸， 显示为Ala30AlaLys 或 A30AK。删除连续一段的氨基酸残基，例如氨基酸残基30-33，标示为(30-33) *或 Δ (Α30-Ν33)或Δ30-33。删除2个连续的氨基酸，如氨基酸残基R180-S181，标示为ARS 或 Δ 180-181。当相比其他α-淀粉酶，特定的α-淀粉酶含有“删除”，且在该位置产生插入时， 标示为对于36位插入天冬氨酸则标示为36Asp或* 36D。通过加号或减号分隔多个突变Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S， Ala30ASp-Glu34Ser或A30N-E34S，表示30和34位的突变分别是用天冬酰胺和丝氨酸取代
丙氨酸和谷氨酸。当一个或多个可选的氨基酸残基可以取代给定位置的残基时，标示为A30N、E或 A30N 或 A30E。此外，当本文鉴别的适合进行修饰的位置没有提示任何特定的修饰时，理解为可以用任何氨基酸残基取代所述位置存在的氨基酸残基。因此，例如当提到30位的丙氨酸的修饰但未说明时，理解为所述丙氨酸可以被删除或被任何其他的氨基酸取代，即，R、N、D、A、 C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V 中的任一种。此外，“Α30Χ”意指任一种下列取代:A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或简写为A30R、 N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。使用下列命名来表示非特定的亲本淀粉酶的位置上的氨基酸残基，其中，所述位置根据SEQ ID NO :2所述的参照α -淀粉酶的氨基酸序列编号例如“Χ30Ν”或“Χ30Ν、V” 的情况下，变体淀粉酶的30位存在N或V之一，而亲本淀粉酶(例如，野生型或变体酶)中存在20种标准氨基酸之一。1. 3氨基酸残基的特征带电的氨基酸包括ASp、GlU、Arg、LyS和His。带负电荷氨基酸(首先是具有最多负电的残基)是Asp和Glu。带正电荷氨基酸(首先是具有最多正电的残基)是Arg、Lys 和 His。中性氨基酸包括Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gin、Ser, Thr 禾口 Pro。疏水性氨基酸残基(具有最大疏水性的残基列举在最后)包括Gly、Ala、Val、 Pro、Met、Leu、lie、Tyr> Phe 禾口 Trp0亲水性氨基酸残基(具有最大亲水性的残基列举在最后)包括Thr、Ser、CyS、Gln禾口 Asn01. 4同源件(同一件)与另一种序列具有特定百分比(例如，75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或甚至 99% ) 的序列同一性的多核苷酸或多肽意指比对时，在比较两条序列中碱基或氨基酸残基的百分比是相同的。可以使用本领域已知的任何合适的软件程序来确定这一比对和百分比同源性或同一'性，例如 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. Μ. Ausubel 等人， (编辑)1987，Supplement 30，7. 7. 18节)中描述的那些。优选的程序包括Vector NTI AdvanceTM 9. 0 (InVitrogen Corp. Carlsbad，CA)、GCG Pileup 程序、FASTA (Pearson 等人， (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA85 2444-2448)和 BLAST (BLAST Manual, Altschul 等人， Natl Cent. Biotechnol. Inf. ,Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.，和 Altschul 等人，(1997)NAR25 :3389-3402)。另一个优选的比对程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，优选使用默认参数。另一种可使用的序列软件程序是在 Sequence Software Package Version 6. 0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) ΦTFASTA Data Searching Program。同源性可以确定为两条序列之间相同的程度，表示第一序列源自第二序列。可以通过本领域已知的计算机程序适当的确定同源性，例如GCG程序包(如上所述)中提供的 GAP。因此，GAP GCG v8可使用同一性的默认评分矩阵和下列默认参数对于核酸序列比较分别是空位产生罚分为5. 0，空位延伸罚分为0. 3，对于蛋白质序列比较分别是空位产生罚分为 3. 0，空位延伸罚分为 0. 1。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch, (1970)，J. Mol. Biol. 48 443-453的方法，产生比对和计算同一性。可使用BASE(SEQ ID NO 2)或BASE变体与例如另一种α -淀粉酶之间的结构性比对，来鉴别具有高度同源性的其他α -淀粉酶中的等价/相应的位置，例如与AmyTS23 约 75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%,95%,96%,97%,98%或者甚至99%。一种获得此类结构性比对的方法是使用GCG包中的Pile Up程序，使用空位罚分的默认值，即空位产生罚分为3. 0，空位延伸罚分为0. 1。 其他的结构性比对方法包括疏水聚类分析(Gaboriaud等人，(1987)，FEBS LETTERS 224， 第 149-155 页)和逆向联系(reverse threading) (Huber 和 Torda，PROTEIN SCIENCE，第 7 卷，第 1 期，第 142-149 页(1998))。图1提供了各种参照淀粉酶的成熟形式的示例性比对。参照淀粉酶包括本文中称为AmyTS23t或BASE的截短的芽孢杆菌属物种TS-23 α -淀粉酶，SEQ ID NO 2 (GENBANK 登录号:ΑΑΑ63900)；本文中称为AmyL或LAT的地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis) α -淀粉酶，SEQ ID NO :5 (GENBANK登录号ΑΑΑ22240)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前的嗜热月旨肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)) α -淀粉酶AmyS，SEQ ID NO 6 (GENBANK登录号AAA22241)；解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) α -淀粉酶 BACAM，SEQ ID NO 7 (GENBANK 登录号ΑΑΑ22191)；本文中称为AmyG6或Amy#707的芽孢杆菌属物种#707 α -淀粉酶，SEQ ID NO 8 (GENBANK 登录号AAA22231)；巨大芽孢杆菌(B. megaterium) α -淀粉酶 AmyG5 或 AmyBm，SEQ ID NO 9 (GENBANK 登录号AAK00598)；芽孢杆菌属物种 α -淀粉酶 ALBA，SEQ ID NO 10 (GENBANK 登录号CAL48155 和 WO 2006/037484) ；B. halmapalus 淀粉酶 AmyBh，SEQ ID NO 11 (GENBANK登录号AAE00432和美国专利号5，856，164)；芽孢杆菌属物种淀粉酶 AA560，SEQ ID NO :12 (GENBANK 登录号CAC16486 和 W02000/060060)；芽孢杆菌属物种 KSM-AP1378 α -淀粉酶 AmyKSMl378, SEQ ID NO 13 (GENBANK 登录号CAD35985 和 EP No. 1199356A)；芽孢杆菌属物种 pHSP_K38 淀粉酶 AmyK38，SEQ ID NO 14 (GENBANK 登录号 CAJ00040 和 W02005/045045)。使用 MUSCLE 3. 7 多重序列比对算法(Edgar, Nucleic Acids Research, 32 1792-1797, 2004)比对序列。表1提供了显示图1的α-淀粉酶序列比对的百分比同一性的矩阵。
权利要求
1.清洁组合物，其包含(a)α淀粉酶，其具有与SEQ ID NO :2所述氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列；和(b)蛋白酶；其中，组合物提供的清洁水平大于对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的水平。
2.权利要求1的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶。
3.权利要求2的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶ΒΡΝ’或其变体。
4.权利要求3的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶ΒΡΝ’的Y217L变体。
5.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其还包括至少一种表面活性剂。
6.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其还包括选自脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的至少一种其他的酶。
7.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶源自选自BASE、ACE、ACE-Q和 ACE-QK的亲本α淀粉酶。
8.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是具有淀粉酶活性的变体α 淀粉酶的成熟形式，并且在选自 1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、沘、29、30、32、 35、36、37、50、51、52、53、54、55、56、59、60、70、71、72、73、75、78、83、87、90、91、93、94、95、 104、105、107、108、110、112、113、116、118、125、126、128、129、130、131、134、136、138、142、 144、147、149、150、152、154、156、158、160、161、162、165、166、168、169、170、172、174、177、 178、182、183、185、189、192、195、197、201、202、203、207、210、214、217、221、228、234、236、 237、246、250、254、255、257、264、267、269、270、272、275、279、283、284、298、301、303、305、 306、310、311、314、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、344、359、374、375、376、 377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、 459、465、470、475、476、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中所述位置对应于SEQ ID NO :2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代在一个或多个位置的天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数> 1.0，和活性测量的性能指数> 1.0的α淀粉酶变体。
9.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自7、四、35、53、60、72、87、108、 116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、 197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401 和 438 的一个或多个位置包含取代，并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数> 1. 5和稳定性测量的性能指数> 1. 0的α淀粉酶变体。
10.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自2、7、22、25、观、30、37、70、 75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、 310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数> 1. 5和活性测量的性能指数> 1.0的α淀粉酶变体。
11.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自83、125、128、131、160、178、 182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476 和 483 的一个或多个位置上包含取代。
12.权利要求1-7的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是变体α淀粉酶的成熟形式，其在选自 83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、 433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO 2所述氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去垢剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一个有益的效果。
13.权利要求1-7的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是变体α淀粉酶的成熟形式，其在选自 5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483 和 484的一个或多个位置上包含取代；其中所述位置对应于SEQ ID NO :2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了这样的α淀粉酶变体，所述变体在ΡΗ8下的活性、pHIO下的活性、16°C下的活性、和32°C下的活性的性能指数值为0. 5或更高，在去垢剂中的稳定性和热稳定性的性能指数值为0. 5或更高。
14.权利要求8-13的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体还包含在对应于SEQID NO 2所述氨基酸序列的243位上的取代。
15.权利要求8-13的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体还包含在对应于SEQID NO 2所述氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。
16.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体源自具有与选自SEQID N0:2、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13 禾口 SEQ ID NO : 14 的氨基酸序列至少 75% 相同的氨基酸序列的亲本α淀粉酶。
17.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQID Ν0:2所述氨基酸序列具有至少75%的序列同一性。
18.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQID Ν0:2所述氨基酸序列具有至少80%的序列同一性。
19.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQID Ν0:2所述氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
20.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述变体在选自对应于SEQID NO 2 所述氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去垢剂稳定性。
21.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括(a)在125位的丙氨酸，在128位的半胱氨酸，在131位的异亮氨酸，在165位的异亮氨酸，在178位的亮氨酸，在182位的甘氨酸， 在202位的酪氨酸， 在305位的精氨酸， 在319位的苏氨酸，或在475位的精氨酸；(b)取代m^C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和选自 S125A、T131I、T165I、F202Y 和 D319T的至少一种其它的取代；或(c)取代N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K, S125A+N128C+K178L+T182G+TO05R+G475K，或 S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K ；其中所述变体任选的还包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失；并且其中所述位置对应于SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列。
22.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括475位的取代。
23.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。
24.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。
25.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中在低于约25°C的温度下测量时，组合物提供了比对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平更大的清洁水平。
26.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中在低于约20°C的温度下测量时，组合物提供了比对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平更大的清洁水平。
27.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶和蛋白酶是共同配制的。
28.清洁织品或硬表面的方法，其包括将织品或硬表面与前述权利要求的任一项的清洁组合物接触。
29.权利要求观的方法，其中所述方法在低于约25°C的温度下实施。
30.权利要求四的方法，其中所述方法在低于约20°C的温度下实施。
全文摘要
本发明描述了涉及芽孢杆菌属的α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。所述组合物和方法对冷水清洁的应用特别有效。
文档编号C12N9/54GK102388132SQ201080015140
公开日2012年3月21日 申请日期2010年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者B·E·琼斯, C·D·亚当斯, D·A·伊斯泰尔, E·M·孔卡, M·科尔克曼 申请人:丹尼斯科美国公司