一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法与流程

本发明涉及一种从肝素钠样品中提取基因组dna的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

肝素(heparin)是一种由葡萄糖胺、l-艾杜糖醛酸、n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸以及他们的硫酸化衍生物组成的酸性粘多糖，具有强酸性，并高度带负电荷，因其首先从肝脏发现而得名肝素。肝素天然存在于哺乳动物的肥大细胞和中性粒细胞中，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。肝素于1935年正式应用于临床治疗，传统应用价值为抗凝血和抗血栓，至今已有70余年历史。目前，它仍是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由粗品肝素作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。而且，肝素是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，到目前为止，仍然没有完全代替的药品。

在过去几十年，欧美国家所使用的肝素原料主要从牛肺、牛肠或猪小肠黏膜中提取。然而由于“疯牛病”的传播以及其巨大影响，美国和西方欧洲国家加强了对动物来源的药品，食品和饲料等的质量控制，防止动物饲料和人类食品、药品被疯牛病病毒或其他病毒污染。2012年2月，美国fda公布了《肝素钠粗品质量监控的工业指南，heparinfordrugandmedicaldeviceuse:monitoringcrudeheparinforquality》，要求肝素药品生产企业更严格地控制肝素原料可能含有的多硫酸软骨素(oscs)或反刍动物污染的非猪源性原材料，还要求生产企业审核肝素粗品和原料药供应商的生产过程，以确保符合cgmp规定。因此，粗品肝素中反刍动物基因的含量是出口肝素检测的重要指标之一。

目前，反刍动物基因含量的检测主要为实时定量pcr方法，又称实时荧光pcr，是在pcr指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出pcr产物进行分离，该方法融合了pcr的灵敏性，dna杂交的特异性和光谱技术的定量准确性，具有封闭反应污染少，灵敏度高特异性强，定量准确范围宽，自动化效率高，操作安全迅速等优点。但由于肝素对pcr反应具有较强的抑制作用(肝素本身是pcr的强烈抑制剂，50μlpcr反应体系中，低于0.002u的肝素就可以强烈抑制pcr的进行)，若要使得这一便捷的测定方法得到广泛推广使用，需要在从肝素制品中提取残留的基因组dna时有效清除肝素的残留对pcr的影响。现有的清除肝素的主要方法一般是使用肝素酶消化处理样本，但该过程处理时间较长，一般为18小时左右，且肝素酶价格昂贵，再者，肝素酶的稳定性较差，肝素酶i以液体形式存放在4℃环境下，在很短的时间内活性即降低为原来的50％，而经过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来的45％和25％，这样对实验操作提出了非常苛刻的要求，稍有不当就会导致检测结果不准，甚至检测失败。基于这些原因，在一定程度上限制了pcr测定法的使用。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种从肝素钠样品中提取基因组dna的方法，可以快速简单地从肝素钠样品中提取残存的基因组dna，提取的dna纯度高，极大地消除了肝素对pcr的抑制，所得产物可方便的用于后续pcr检测。

技术方案

一种从肝素钠样品中提取基因组dna的方法，包括以下步骤：

(1)往10ml无菌水中加入300mg待检测的肝素钠样品，溶解完全后得到肝素钠溶液；

(2)取100μl肝素钠溶液于离心管中，加入500μl的bufferl，混匀后加入60μlbuffers，继续混合均匀，然后将离心管置于60℃水浴中保持15min，后冷却至室温；

(3)12000rpm离心10min后，将得到的上清液转移至套有收集管的硅胶膜dna吸附柱中，静置后，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(4)往步骤(3)的硅胶膜dna吸附柱中加入600μlbufferw1，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(5)往步骤(4)的硅胶膜dna吸附柱中加入600μlbufferw2，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(6)取出硅胶膜dna吸附柱，将其装入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100μlbuffere或者灭菌水，室温放置后，10000rpm离心3min，离心管中收集得到的洗脱液，即为基因组dna溶液。可用于下游的real-timepcr检测；长期存放，保存于-20℃，以防dna降解。

进一步，步骤(2)中，所述bufferl的组成为：10mmtris-cl,1mmedta，4mlicl。

进一步，步骤(2)中，所述buffers为3mnaac,ph为5.3。

进一步，步骤(2)中，60℃水浴过程中，每隔5min振荡一次，有助于样品充分溶解。

进一步，步骤(4)中，所述bufferw1的组成为10mmtris-ac,4mlicl,2mmedta,30μg/mlbsa,3mnaac,ph5.3。

进一步，步骤(4)的操作结束以后，再重复一次。

进一步，步骤(5)中，所述bufferw2的组成为200mmnacl，10mmedta，50mmtris-cl，ph7.5。

进一步，步骤(5)的操作结束以后，再重复一次，其中，离心时间为3min，便于除去残留的溶液。

进一步，步骤(6)中，buffere的组成为：10mmtris-cl,1mmedta,ph7.5。

进一步，步骤(6)中，buffere或者灭菌水的温度为55℃，可以增加dna回收率。

进一步，步骤(6)中，室温静置的时间为10min以上，可以增加dna回收率。

本发明的有益效果：本发明利用高特异性硅胶膜dna吸附柱，配合专项开发的缓冲液系统，使dna与肝素等杂质有效的分离，获得高纯度的基因组dna片段，本发明方法的操作步骤简单，只需实验室常规仪器，影响因素少，实验重复性和重现性高，并且简单快速，2h内即可获得超纯的基因组dna片段，提取的dna纯度高，可直接用于pcr等其它分子生物学下游实验，提取过程中无任何有毒的试剂，环保安全，还可配合自动化核酸提取仪，高通量提取dna。

附图说明

图1为实施例1提取的基因组dna的凝胶电泳图；

图2为实施例1提取的基因组dna的猪引物的实时定量pcr溶解曲线；

图3为实施例1提取的基因组dna的猪引物的实时定量pcr扩增曲线；

图4为实施例1提取的基因组dna的猪引物的实时定量pcr标准曲线；

图5为实施例1提取的基因组dna的牛引物的实时定量pcr溶解曲线；

图6为实施例1提取的基因组dna的牛引物的实时定量pcr扩增曲线；

图7为实施例1提取的基因组dna的牛引物的实时定量pcr标准曲线；

图8为实施例1提取的基因组dna的羊引物的实时定量pcr溶解曲线；

图9为实施例1提取的基因组dna的羊引物的实时定量pcr扩增曲线；

图10为实施例1提取的基因组dna的羊引物的实时定量pcr标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

一种从肝素钠样品中提取基因组dna的方法，包括以下步骤：

(1)往10ml无菌水中加入300mg待检测的肝素钠样品，溶解完全后得到肝素钠溶液；

(2)取100μl肝素钠溶液于离心管中，加入500μl的bufferl，混匀后加入60μlbuffers，继续混合均匀，然后将离心管置于60℃水浴中保持15min(每隔5min振荡一次)，后冷却至室温；

(3)12000rpm离心10min后，将得到的上清液转移至套有收集管的dna吸附柱中，静置后，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(4)往步骤(3)的dna吸附柱中加入600μlbufferw1，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(5)重复一次步骤(4)

(6)往步骤(5)的dna吸附柱中加入600μlbufferw2，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；

(7)重复一次步骤(6)，离心时间改为3min；

(8)取出dna吸附柱，将其装入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100μl温度为55℃的buffere，室温放置15min，10000rpm离心3min，离心管中收集得到的洗脱液，即为基因组dna溶液。

上述方法中，所述bufferl的组成为：10mmtris-cl,1mmedta，4mlicl。所述buffers的组成为：3mnaac,ph5.3。所述bufferw1的组成为10mmtris-ac,4mlicl,2mmedta,30μg/mlbsa,3mnaac,ph5.3。所述bufferw2的组成为200mmnacl，10mmedta，50mmtris-clph7.5。所述buffere的组成为10mmtris-cl,1mmedta,ph7.5。

取实施例1提取的基因组dna溶液2.0μl，跑1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1，图1中，m：marker，天根1kbplusdnaladder，泳道1-6均为基因组dna，因为在肝素制备时，基因组dna已经被打散，因而片段小于100bp，由图1可以看出，本发明的提取方法能获得质量良好的动物基因组dna。

将实施例1提取的基因组dna溶液用于下游的real-timepcr检测，real-timepcr检测所用引物见表1，反应体系见表2：

表1real-timepcr检测所用引物序列

表2pcr检测的反应体系

反应程序见表3：

表3

real-timepcr扩增的结果见图2-10，其中，图2-4为分别是猪引物的实时定量pcr溶解曲线、扩增曲线、标准曲线图，图4的标准曲线中，直线上的黑色圆点为实施例1中猪基因的含量，可见，利用本发明方法从粗品肝素中提取基因组dna，并以之为扩增模板，可以准确定量粗品肝素样品中所含猪基因组dna的含量；图5-7为分别是牛引物的实时定量pcr溶解曲线、扩增曲线、标准曲线图，图7标准曲线中，直线上的黑色圆点为实施例1中牛基因的含量，可见，利用本发明方法从粗品肝素中提取基因组dna，并以之为扩增模板，可以准确定量粗品肝素样品中所含牛基因组dna的含量；图8-10为分别是羊引物的实时定量pcr溶解曲线、扩增曲线、标准曲线图，图10标准曲线中，直线上的黑色圆点为实施例1中羊基因的含量，可见，利用本发明方法从粗品肝素中提取基因组dna，并以之为扩增模板，可以准确定量粗品肝素样品中所含羊基因组dna的含量。

现阶段，从肝素钠中提取dna用于后续pcr检测时，最常用的方法是采用肝素酶消化法。然而，肝素酶消化法有几个明显的缺点。第一，肝素酶价格昂贵。工业化的肝素酶的主要生产方式为肝素黄杆菌发酵，需要用到昂贵的肝素做为碳源，而且产量低，纯化困难，造成酶的成本非常昂贵。而目前依靠基因工程手段直接在细菌中表达出的重组肝素酶，水溶性差，阻碍了蛋白复性，活性较差。第二，肝素酶的稳定性较差，肝素酶i以液体形式存放在4℃环境下，在很短的时间内活性即降低为原来的50％，而经过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来的45％和25％，这样对实验操作提出了非常苛刻的要求，稍有不当就会导致检测结果不准，甚至检测失败。最后，经过酶反应消化后的粗品肝素样品中，还残留有大量的蛋白，多糖等杂质，对pcr检测常常会起到不小的干扰。因而，粗品肝素检测方法中对肝素样品的处理成本昂贵、效果差，难以大规模地应用于实际生产。