1.一种灵芝酸产量控制基因cyp5150l8,其特征在于,其核苷酸序列如seqidno.25所示。
2.一种灵芝u6-3基因的启动子pu6-3,其特征在于,如seqidno.1所示。
3.一种在灵芝细胞内表达grna的crispr-cas9系统,其特征在于,包括能够显著中断灵芝cyp5150l8功能基因的pu6-3-t2-grna-hdv质粒。
4.根据权利要求3所述的系统,其特征是,所述的质粒通过以t2序列为靶序列、pu6-3-t1-grna-hdv质粒为pcr模板,经pcr扩增得到tl8-grna-hdv-glcas9序列和glcas9-tpdc-sdhb-pu6-3序列,将tl8-grna-hdv-glcas9序列和glcas9-tpdc-sdhb-pu6-3序列与线性化的pmd-glcas9质粒重组连接得到。
5.一种基于高等真菌灵芝功能基因编辑的调节灵芝酸产量的方法,其特征在于,通过构建pu6-3-t2-grna序列,并将其与hdv核酶协同构建pu6-3-t2-grna-hdv质粒,与pcrdonor结合scr7实现了灵芝功能基因cyp5150l8的精确编辑,实现对灵芝酸的产量控制。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征是,所述的hdv核酶用于割切grna尾部以保证grna长度一致性的核酶,具体如seqidno.2所示;
所述的pcrdonor以质粒pmd-l8d为模板,pcr扩增得到的l8d片段,其序列如seqidno.24所示;
所述的scr7,即5,6-二(苄基氨基)-2-巯基嘧啶-4-醇。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征是,所述的质粒pmd-l8d,通过pcr扩增与纯化得到的l8d序列重组连接至pmd-18t载体得到,其中:l8d序列为cas9在cyp5150l8基因的切割位点两侧各取1kb,并且切割位点附件的5’tccaacac3’序列被5’tga3’取代。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征是,所述的精确编辑是指:利用pcrdonor替换cyp5150l8基因序列上同源的序列。
9.根据权利要求5或8所述的方法,其特征是,所述的精确编辑具体步骤包括:原生质体转化时加入的dna是20μgpu6-3-t2-grna-hdv质粒和3μgpcrdonor-l8d;转化后,加入到1mlcym液体培养基,30℃静置培养12小时,转移到cym固体平板,30℃放置20天后可见转化子。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征是,所述的灵芝酸的产量,通过以下方式进行检测:将转化子经初步筛选与鉴定,得到2个杂合子;用突变体的菌丝制备原生质体,经cym液体培养基静置培养12小时后,移到cym固体平板筛选,对再生菌进行筛选与鉴定,当再生菌的cyp5150l8基因测序峰是单峰,将其序列连至pclone007载体,转化至dh5a,筛选单克隆,随机挑10个单克隆用m13-f引物测序,当单克隆测序序列都与l8d一致,则再生菌是纯合子,经筛选得到两个纯合子,对纯合子进行发酵实现灵芝酸的产量的检测。
11.根据权利要求10中所述的方法,其特征是,所述的灵芝酸,包括:ga-mk、ga-t、ga-s、ga-me。