检测丙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，更具体地，涉及用于rna
技术领域：
，特别是指一种高灵敏检测丙型肝炎病毒(hcv)核酸的引物、探针及相应试剂盒，以及利用该试剂盒检测丙型肝炎病毒核酸的方法。
背景技术：
：丙型肝炎病毒(hepatitisvirusc，hcv)属于黄病毒科，是一小的带有囊膜结构的单股正链rna病毒。hcv呈世界性分布，人类普遍易感，可以通过血液、性以及母婴等途径传播。hcv感染起病隐匿，较hbv更易发展为慢性感染。这是由于hcv急性感染的临床表现大多很轻，少有重型肝炎发生，待确诊时已多为慢性期。慢性hcv感染的表现轻重不等，约20～30％可逐渐发展至肝硬化，肝硬化患者中每年约1～4％可发展至肝癌。hcv-rna检测，可以尽早发现hcv感染，并且对于其临床治疗方案的选择与疗效监控有重要意义。目前，hcv的常用检测方法包括病毒蛋白抗体检测、抗原检测、核酸检测等方法。病毒抗原抗体检测法常选用酶联免疫吸附试验(elisa)，即将特异性抗原或抗体吸附于固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。但刚进入机体的病毒含量很低，病毒自身抗原含量往往低于elisa法的检测下限，并且机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3-6周后才能被检测出来。近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术已经在各实验室普及，尤其的荧光定量pcr技术，不仅有良好的特异性，还可以通过将病毒核酸扩增提高检测的灵敏度，缩短病毒检测的窗口期。目前国内外已有多种基于荧光定量pcr技术的病毒检测试剂盒，但是国内的检测试剂盒定量检测下限较高，灵敏度较差。而国外进口的高灵敏诊断试剂盒价格过于昂贵，提高了医疗卫生成本。因此，目前迫切需要开发一种检测下限低，灵敏度高的检测丙型肝炎病毒的试剂盒及检测方法，以满足临床用药和检测诊断的要求。技术实现要素：本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种检测丙型肝炎病毒核酸的引物、探针，以克服现有技术中的不足。本发明的另一主要目的在于提供一种检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒。本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒在检测丙型肝炎病毒核酸中的用途。本发明的另一目的还在于提供一种检测丙型肝炎病毒核酸的新方法。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的引物对，其包括：第一引物，其序列如seqidno.1所示；第二引物，其序列如seqidno.2所示。本发明实施例还提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的探针，所述探针的序列如seqidno.3所示。本发明实施例还提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其包括至少一组引物对和至少一条探针，其中一组引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如seqidno.1所示，所述第二引物的序列如seqidno.2所示，其中一条探针为前述的探针。本发明实施例还提供了前述的试剂盒于制备检测丙型肝炎病毒核酸的产品中的用途。进一步地，应用所述产品检测丙型肝炎病毒核酸的方法包括：提供待检测的人丙型肝炎病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与pcr反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测。本发明实施例还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于丙型肝炎病毒核酸的检测方法，所述检测方法包括：提供待检测的人丙型肝炎病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与pcr反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测。与现有技术相比，本发明的优点包括：1)本发明提供的高灵敏检测丙型肝炎病毒核酸的方法，检测结果的灵敏度及特异度更高，并可有效降低检测成本；2)本发明利用离心力使得核酸溶液与pcr反应液在流道中被包裹于液滴生成液中，形成单分子pcr反应体系，增加了检测的灵敏度，降低了检测下限，有利于尽早发现病毒感染；3)在本发明中，由于经过处理后的液滴中仅包含单分子核酸模板，在扩增时受到的干扰减少，可以避免产生不确定的结果，提高反应特异性；4)与其他仅能检测部分常见丙型肝炎病毒亚型核酸的试剂盒不同，本发明提供的试剂盒通过优化引物设计，保证对于丙型肝炎病毒核酸的检测可以覆盖所有已知亚型，同时，本发明通过优化引物设计，使得扩增产物的片段长度在100-150bp之间，且退火温度在56-62℃之间，并通过赛默飞引物分析在线工具对所设计引物之间的相互作用进行分析，确保引物之间的相互作用不会对体系产生影响；5)本发明通过优化引物探针，使得针对每种病毒的引物探针仅可检测该种病毒，不会与人基因组或者人乙型肝炎病毒(hbv)核酸、人疱疹病毒(ebv)核酸、巨细胞病毒(cmv)核酸等常见的病毒核酸发生交叉反应，保证了阳性结果的精确性。附图说明图1是本发明一典型实施方案中采用的样品处理装置的结构示意图。图2是本发明实施例1中阴性对照的液滴荧光检测结果。图3是本发明实施例1中1号阳性样品的滴荧光检测结果。图4是本发明实施例1中2号阳性样品滴的荧光检测结果。图5是本发明实施例2中参考品a的液滴荧光强度检测结果。图6是本发明实施例2中参考品b的液滴荧光强度检测结果。图7是本发明实施例2中参考品c的液滴荧光强度检测结果。图8是本发明实施例2中参考品d的液滴荧光强度检测结果。图9是本发明实施例3中hbv、cmv、ebv与hcv阳性样品的液滴荧光强度检测结果。具体实施方式下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。本发明实施例的一个方面提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的引物对，其包括：第一引物，即正向引物，其序列如seqidno.1所示；第二引物，即反向引物，其序列如seqidno.2所示。进一步地，所述引物对所含引物序列如下表：hcv-f(正向引物)5'-attgcagcagtcagagccct-3'hcv-r(反向引物)5'-gctcctttctaagccttcttcact-3'与其他仅能检测部分常见丙型肝炎病毒亚型核酸的试剂盒不同，本发明提供的试剂盒通过优化引物设计，使丙型肝炎病毒核酸的检测可以覆盖所有已知亚型，同时，本发明通过优化引物设计，使得扩增产物的片段长度在100-150bp之间，且退火温度在56-62℃之间，并通过赛默飞引物分析在线工具对所设计引物之间的相互作用进行分析，确保引物之间的相互作用不会对体系产生影响。本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的探针，所述探针的序列如seqidno.3所示。进一步地，所述探针的序列如下表：hcv-probe5'-hex-catcctgctgctatgcctcatcttctt-bhq-3'本发明通过优化引物探针，使得针对每种病毒的引物探针仅可检测该种病毒，不会与人基因组或者人乙型肝炎病毒(hbv)核酸、人疱疹病毒(ebv)核酸、巨细胞病毒(cmv)核酸等常见的病毒核酸发生交叉反应，保证了阳性结果的精确性。本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其包括至少一组引物对和至少条一探针，其中一组引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如seqidno.1所示，所述第二引物的序列如seqidno.2所示，其中所述探针的序列如seqidno.3所示。在一些实施例中，所述试剂盒还包括病毒内标引物对、内标探针，其中所述病毒内标引物对包括第一内标引物(即内标正向引物)和第二内标引物(即内标反向引物)，所述第一内标引物的序列如seqidno.4所示，所述第二内标引物的序列如seqidno.5所示，其中内标探针的序列如seqidno.6所示。进一步地，本发明试剂盒中内标引物混合液中包含的内标正向引物及反向引物的序列如下表：内标-f(内标正向引物)5'-attaaccttatgtgtgacat-3'内标-r(内标反向引物)5'-catattcgtccacaaaatgattctg-3'进一步地，内标探针溶液中内标探针的序列为：5'-cy5-5-ctgtatcgtcaaggcact-bhq-3'。在一些实施例中，所述试剂盒还包括pcr扩增检测的常规组件。进一步地，所述pcr扩增检测的常规组件包括pcr反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(2.5mmdntps)、dna聚合酶、rna逆转录酶、尿嘧啶dna糖基化酶、水以及液滴生成液。更进一步地，所述pcr反应用缓冲液包含20mm氯化钾、50mm的ph8.0tris-hcl、1.5mm镁离子。更进一步地，dntps中包含dntp与dutp。在一些更为具体的实施例中，所述试剂盒具体包括：pcr反应用缓冲液、2.5mmdntps、靶核苷酸引物混合液、靶核苷酸探针溶液、内标引物混合液、内标探针溶液、5u/μl耐热dna聚合酶、5u/μlrna逆转录酶、5u/μl尿嘧啶dna糖基化酶、水以及液滴生成液。其中，所述靶核苷酸引物混合液包含前述的第一引物和第二引物。其中，所述靶核苷酸探针溶液包含hcv特异性探针。其中，所述内标引物混合液中包含内标正向引物及内标反向引物。本发明实施例的另一个方面还提供了前述试剂盒于制备检测丙型肝炎病毒核酸的产品中的用途。进一步地，应用所述产品检测丙型肝炎病毒的方法包括：提供待检测的人丙型肝炎病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与pcr反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测。在一些实施例中，所述方法具体包括：利用所述的试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行液滴pcr扩增；对pcr扩增后的液滴的荧光强度进行检测，根据该荧光强度判断核酸样本是否包含丙型肝炎病毒核酸。进一步地，所述样品处理装置包括定位孔、进样孔、试剂孔、反应孔以及连接流道。本处理装置为pc材料制成，长40mm，宽20mm，厚度2mm，其中进样孔容积为50μl，试剂孔容积为50μl，反应孔容积为100μl。在一些更为具体的实施例中，所述检测方法具体包括：将液滴生成液加入所述试剂孔，将待检测的核酸样本与pcr反应液加入所述进样孔，在离心力的作用下使进样孔与试剂孔中液体通过连接流道混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴，并进入反应孔。进一步地，所述检测方法可以包括：将样品处理装置通过定位孔安装在离心机上，将液滴生成液加入试剂孔，将提取好的核酸溶液与pcr反应液按比例混匀加入进样孔。以3000rpm顺时针离心，在离心力的作用下进样孔与试剂孔中液体通过流道混合，让核酸样品被包裹进pcr反应液中形成液滴，最终收集到反应孔中。进一步地，所述液滴生成液包括矿物油等油相物质。在一些较为具体的实施方案中，所述方法具体可以包括以下步骤：将pcr反应液预先从冰箱中取出解冻，完全融化后涡旋混匀并瞬时离心。取10-19μl反应液置于pcr管中，向其中加入1-10μl新提取的核酸样品，用枪头混匀，保证总液体量为20μl。吸取20μl混合液体加入进样孔中，吸取20μl液滴生成液加入试剂孔中。通过定位孔，将处理装置固定于离心机适配器上，需注意在安装时保持中心对称。以3000rpm离心3分钟，使得核酸样品与pcr反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的液滴。将反应孔中生成的液滴转移到pcr管中，放入聚合酶链式反应扩增仪(pcr扩增仪)中，按下列表1的条件进行扩增：表1：pcr扩增条件将扩增产物使用8通道液滴阅读系统进行分析，首先根据未加入模板的空白对照确定背景荧光强度，设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。通过计数阳性液滴个数与确定加入核酸样品体积，则可以计算核酸样品中丙型肝炎病毒核酸数量。本发明利用离心力使得核酸溶液与pcr反应液在流道中被包裹于液滴生成液中，形成单分子pcr反应体系，增加了检测的灵敏度，降低了检测下限，有利于尽早发现病毒感染。本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于丙型肝炎病毒核酸的检测方法，所述检测方法包括：提供待检测的人丙型肝炎病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与pcr反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测。进一步地，所述产品包括：利用所述的试剂盒所包含的引物对与探针对所述液滴进行液滴pcr扩增；对pcr扩增后的液滴的荧光强度进行检测，根据该荧光强度判断核酸样本是否包含丙型肝炎病毒核酸。以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例11.本实施例所用样品包括hcv阳性核酸溶液2例，以及阴性核酸溶液1例。2.pcr反应体系制备(1)将pcr反应液预先从冰箱中取出解冻，完全融化后涡旋混匀并瞬时离心；(2)取19μlpcr反应液置于pcr管中，向其中加入1μl核酸样品，用枪头混匀；(3)吸取20μl混合液体加入进样孔中，吸取20μl液滴生成液加入试剂孔中；(4)通过定位孔，将样品处理装置固定于离心机适配器上，需注意在安装处理装置时保持中心对称；(5)以3000rpm离心3分钟，使得核酸样品与pcr反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；(6)将反应孔中生成的液滴转移到pcr管中。3.pcr扩增扩增在聚合酶链式反应扩增仪(pcr扩增仪)中进行，反应程序如下表所示：4.结果分析将扩增产物使用8通道液滴阅读系统(苏州昊通生物科技有限公司)进行分析，首先分析阴性对照中各个液滴的荧光强度，以此确定背景荧光强度。再通过设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。每个样品的检测结果以每个液滴检测时的次序为横坐标，以该液滴的荧光强度为纵坐标，绘制每个液滴荧光强度的散点图。通过阴性对照确定的背景荧光值确定荧光强度阈值线，荧光强度超过阈值线的液滴即为阳性液滴。由于本次实验中均加入1μl核酸样品，所以每个样品检测的阳性液滴个数，就代表了每1μl核酸样品中包含的hcv病毒核酸拷贝数。如图2为阴性对照液滴荧光强度检测结果。如图3为1号阳性样品液滴荧光强度检测结果，可以得出该核酸样品中hcv病毒核酸载量为668copies/μl。如图4为2号阳性样品液滴荧光强度检测结果，可以得出该核酸样品中hcv病毒核酸载量为421copies/μl。实施例21.本实施例所用样品包括，4种浓度的含有hcv特异性序列的质粒定量参考品，其中质粒浓度分别为a(10copies/μl)、b(5copies/μl)、c(2copies/μl)和d(1copies/μl)。2.pcr反应体系制备(1)将pcr反应液预先从冰箱中取出解冻，完全融化后涡旋混匀并瞬时离心；(2)取10μlpcr反应液置于pcr管中，向其中加入10μl核酸样品，用枪头混匀；(3)吸取20μl混合液体加入进样孔中，吸取20μl液滴生成液加入试剂孔中；(4)通过定位孔，将样品处理装置固定于离心机适配器上，需注意在安装处理装置时保持中心对称；(5)以3000rpm离心3分钟，使得核酸样品与pcr反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；(6)将反应孔中生成的液滴转移到pcr管中。3.pcr扩增扩增在聚合酶链式反应扩增仪(pcr扩增仪)中进行，反应程序如下表所示：4.结果分析将扩增产物使用8通道液滴阅读系统(苏州昊通生物科技有限公司)进行分析，首先分析阴性对照中各个液滴的荧光强度，以此确定背景荧光强度。再通过设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。每个样品的检测结果以每个液滴检测时的次序为横坐标，以该液滴的荧光强度为纵坐标，绘制每个液滴荧光强度的散点图。通过阴性对照确定的背景荧光值确定荧光强度阈值线，荧光强度超过阈值线的液滴即为阳性液滴。由于本次实验中均加入10μl核酸样品，所以每个样品检测的阳性液滴个数，就代表了每10μl核酸样品中包含的hcv病毒核酸拷贝数。如图5为参考品a的液滴荧光强度检测结果，可以得出该参考品中hcv病毒核酸载量为10copies/μl。如图6为参考品b的液滴荧光强度检测结果，可以得出该参考品中hcv病毒核酸载量为5copies/μl。如图7为参考品c的液滴荧光强度检测结果，可以得出该参考品中hcv病毒核酸载量为2copies/μl。如图8为参考品d的液滴荧光强度检测结果，可以得出该参考品中hcv病毒核酸载量为1copies/μl。实施例31.本实施例所用样品包含人乙型肝炎病毒(hbv)核酸阳性、人疱疹病毒(ebv)核酸阳性、巨细胞病毒(cmv)核酸阳性以及hcv核酸阳性样品各1例。2.pcr反应体系制备(1)将pcr反应液预先从冰箱中取出解冻，完全融化后涡旋混匀并瞬时离心；(2)取10μlpcr反应液置于pcr管中，向其中加入10μl核酸样品，用枪头混匀；(3)吸取20μl混合液体加入进样孔中，吸取20μl液滴生成液加入试剂孔中；(4)通过定位孔，将样品处理装置固定于离心机适配器上，需注意在安装处理装置时保持中心对称；(5)以3000rpm离心3分钟，使得核酸样品与pcr反应液在离心力的作用下流入流道中，并在流道中被液滴生成液包裹，形成仅包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；(6)将反应孔中生成的液滴转移到pcr管中。3.pcr扩增扩增在聚合酶链式反应扩增仪(pcr扩增仪)中进行，反应程序如下表所示：4.结果分析将扩增产物使用8通道液滴阅读系统(苏州昊通生物科技有限公司)进行分析，首先分析阴性对照中各个液滴的荧光强度，以此确定背景荧光强度。再通过设定超过背景荧光强度的液滴为阳性液滴，测量每个反应液滴的荧光强度，并计数阳性液滴个数。每个样品的检测结果以每个液滴检测时的次序为横坐标，以该液滴的荧光强度为纵坐标，绘制每个液滴荧光强度的散点图。通过阴性对照确定的背景荧光值确定荧光强度阈值线，荧光强度超过阈值线的液滴即为阳性液滴。由于本次实验中均加入10μl核酸样品，所以每个样品检测的阳性液滴个数，就代表了每10μl核酸样品中包含的hcv病毒核酸拷贝数。如图9从左到右依次为hbv、cmv、ebv与hcv阳性样品的液滴荧光强度检测结果，可以得出与hbv、cmv、ebv病毒核酸未发生交叉反应，hcv阳性样品中病毒核酸载量为32.3copies/μl。综上所述，藉由上述技术方案，本发明的试剂盒检测下限低，灵敏度高，特异性好，本发明的检测方法简单快速，检测结果的灵敏度及特异度更高，并可有效降低检测成本。应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>苏州德思普生物科技有限公司<120>检测丙型肝炎病毒的引物、探针、试剂盒及检测方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>1attgcagcagtcagagccct20<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>2gctcctttctaagccttcttcact24<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>3catcctgctgctatgcctcatcttctt27<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>4attaaccttatgtgtgacat20<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>5catattcgtccacaaaatgattctg25<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>6ctgtatcgtcaaggcact18当前第1页12