与亚洲棉DPL972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与亚洲棉dpl972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记。

背景技术：

棉花是世界上主要的经济作物，是重要的天然纤维，棉油和矿物质的原材料(heetal.,2013)。棉籽中包含大约17-27％油和12-32％的蛋白。被人们通常用的四大栽培棉：陆地棉代表栽培棉的95％，而海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉仅代表世界栽培品种的5％(padmalathaetal.,2012)。

棉花种子根据所覆盖的短绒和可纺织的长纤维分为光籽和毛籽，长纤维具有重要的经济作用，在表皮细胞(-2-0dpa)开始发育，最终能达到2.5-3.5cm,短绒在表皮细胞3-5dpa开始发育，长度为5-10mm(stewart，1975)。通过遗传学分析发现，纤维的发育受2对显性基因控制，n2代表短绒，li3代表长纤维，2个光籽位点n1和n2可以抑制短绒纤维的发育产生“nakedseed”或者光籽表型(kearney&harrison,1927；kohel,1973)。与传统棉花品种相比，尽管光籽产生的纤维非常少，但光籽可以作为研究纤维起始、细胞生物学、遗传学和分子生物学的有利工具。

短绒可以附着在动物皮毛上，对传统种子成熟具有重要意义。短绒纤维由于太短不能通过轧花从种皮上收集，留在种皮上的短绒增加种子萌发的风险。因此光籽表型性状对于轧花来说属于有利性状。后来育种家发现光籽表型性状与种皮上产生的纤维有关，仅有20-30％的表皮细胞产生纤维，但原因未知。

二倍体亚洲棉光籽自然突变体dpl972与其野生型dpl971来源于美国，经过近十年的自交，光籽突变体没有产生性状分离，在表型上除了没有短绒，其他性状与dpl971相似。与四倍体aadd陆地棉相比，亚洲棉基因组为aa，减少了基因组的复杂性，是研究光籽遗传变异的良好材料。

本实验室前人通过构建f2分离群体，实现了短绒基因粗定位，但未找到与纯合光籽性状紧密连锁的分籽标记。因此利用新组装的亚洲棉基因组，非常有必要开发一种与光籽性状紧密连锁的分籽标记，以在苗期对光籽植株实现选择，从而加快育种进程。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种与亚洲棉dpl972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记。

本发明的技术方案为：与亚洲棉dpl972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记，分子标记有三个，位于8号染色体a08上，分别为命名为分子标记971sv6、分子标记sv6f12r和分子标记sv25luc，其中分子标记971sv6的核苷酸序列如seqidno.1所示，分子标记sv6f12r的核苷酸序列如seqidno.2所示，分子标记sv25luc的核苷酸序列如seqidno.3所示。

分子标记971sv6由第一特异引物对扩增得到，第一特异引物对正向引物序列为：5'-gagatgttgtgtcctaactcactgtat-3'(seqidno.4)，反向引物序列为：5'-agtctgtatgatgatgaaagtctgttg-3'(seqidno.5)。

分子标记sv6f12r由第二特异引物对扩增得到，第二特异引物对正向引物序列为：5'-gagatgttgtgtcctaactcactgtat-3'(seqidno.4)，反向引物序列为：5'-acacaagttttagttccgttcacattg-3'(seqidno.6)。

分子标记sv25luc由第三特异引物对扩增得到，第三特异引物对正向引物序列为：5'-cttaaatattgttgagtgatgagaatgg-3'(seqidno.7)，反向引物序列为：5'-gttagaagactcgtttactttgtatata-3'(seqidno.8)。

与亚洲棉dpl972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记在亚洲棉光籽性状鉴定上的应用。

亚洲棉光籽性状鉴定的方法，提取待鉴定亚洲棉基因组dna作为pcr扩增模板，若用第一特异引物对扩增结果无条带，而用第二特异引物对能扩增出1062bp的条带或/和用第三特异引物对能扩增出1600bp的条带，则待鉴定亚洲棉为纯合光籽；若用第一特异引物对能扩增出1291bp的条带，而用第二特异引物对或/和用第三特异引物对不能扩增出条带，则待鉴定亚洲棉为毛籽；若用第一特异引物对能扩增出1600bp的条带，用第二特异引物对能扩增出1062bp条带或/和用第三特异引物对能扩增出1600bp的条带，则待鉴定亚洲棉为杂合光籽。

pcr扩增体系和扩增参数如下：

扩增体系：

maxsuper-fidelitydnapolymerase高保真酶反应体系(25μl)：

扩增参数：

或

扩增体系：

kodfx高保真酶反应体系(25μl)

扩增参数：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明找到了鉴定亚洲棉纯合和杂合光籽材料的三对特异引物及分子标记。在亚洲棉自然群体中能解释80-90％的表型变异。可用于光籽性状的分子标记辅助选择以及光籽基因精细定位和图位克隆，为棉花纤维起始研究、纤维品质改良以及棉花遗传育种提供一定的理论依据。

附图说明

图1为用p505酶，引物在dpl971、dpl972，亚洲棉自然群体、dpl971/972f1、f2群体的扩增结果；

图2为三对引物在dpl971、dpl972的扩增结果；

图3为用p505酶，sv11941-6f/sv6-12r引物对在dpl971、dpl972、亚洲棉自然群体、dpl971/972f1、f2群体的扩增结果；

图4为用kod酶，sv11941-6f/sv11941-6r引物对在dpl971、dpl972、亚洲棉自然群体、dpl971/972f1、f2群体的扩增结果；

图5为用kod酶，sv6-25lucf/sv6-25lucr引物对在dpl971、dpl972、亚洲棉自然群体、dpl971/972f1、f2群体的扩增结果。

具体实施方式

实施例1

(1)将亚洲棉野生型毛籽971作为父本，亚洲棉光籽突变体972作为母本，对这两个材料进行杂交获得f1代，自交产生1218株f2代群体，同时采用215份亚洲棉自然群体，构建作图群体。

(2)用ctab法提取亲本，f1及f2群体及215份亚洲棉自然群体单株幼苗的dna。

(3)分别用p505和kod酶，用设计好的引物(表1所示)在两亲本毛籽971和光籽972、f1、f2以及亚洲棉自然群体进行扩增，延伸时间为1min30sec。

(4)实验过程中所用的dna聚合酶为maxsuper-fidelitydnapolymerase和kodfx。

(5)实验过程的反应体系：

vazyme高保真酶反应体系(25μl)：

(6)实验过程所用pcr反应程序：

kodfx高保真酶反应体系(25μl)

反应程序：

表1引物信息

当用p505酶时，sv11941-6f/sv6-12r引物对扩增出来的条带比较清晰。当用kod聚合酶时，sv6-25lucf/sv6-25lucr引物对扩增的结果较好，因此最终选择p505和kod酶进行pcr扩增。图3、4、5分别说明sv11941-6f/sv6-12r、sv11941-6f/sv11941-6r、sv6-25lucf/sv6-25lucr引物对在dpl971、dpl972、亚洲棉自然群体、dpl971/972f1、f2群体的扩增结果：

当待鉴定亚洲棉为纯合光籽时，用sv11941-6f/sv11941-6r扩增结果无条带，而用sv11941-6f/sv6-12r能扩增出1062bp的条带(核苷酸序列如seqidno.3所示)或/和用sv6-25lucf/sv6-25lucr能扩增出1600bp的条带(核苷酸序列如seqidno.2所示)。

当待鉴定亚洲棉为毛籽时，用sv11941-6f/sv11941-6r能扩增出1291bp的条带(核苷酸序列如seqidno.1所示)，而用sv11941-6f/sv6-12r或/和用sv6-25lucf/sv6-25lucr不能扩增出条带。

当待鉴定亚洲棉为杂合光籽时，用sv11941-6f/sv11941-6r能扩增出1600bp的条带(核苷酸序列如seqidno.2所示)，用sv11941-6f/sv6-12r能扩增出1062bp条带(核苷酸序列如seqidno.3所示)或/和用sv6-25lucf/sv6-25lucr能扩增出1600bp的条带(核苷酸序列如seqidno.2所示)。

这三对引物在亚洲棉自然群体中验证，能解释80-90％的表型变异。在f2群体中扩增，能验证出纯合的光籽。

上述结果说明本发明筛选的引物对：sv11941-6f/sv11941-6r、sv11941-6f/sv6-12r、sv6-25lucf/sv6-25lucr(见表1)可作为与光籽性状紧密连锁的分子标记的特异引物对，用于光籽性状的分子标记辅助选择以及棉花纤维改良的分子育种。

序列表

<110>申请人名称中国农业科学院棉花研究所

<120>与亚洲棉dpl972纯合光籽性状紧密连锁的分子标记及应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1291

<212>dna

<213>亚洲棉(asiaticcotton)

<400>1

gagatgttgtgtcctaactcactgtatataacattttgttgcttcgaaacgagaaggtct60

ttaacgttcgaatgttttttacaaaaagaaggattgtatttcaaagtctttcaagttttt120

tatttttcgacactaagacactaattaatcaactaggtatcaatttttgggcgtatcgag180

ggtgctaatccttcctcgtgcgtaatcgactcctgaactcattttctgattttcgtagac240

cagagattatcgttttagtaaatcttaacttttattaaaatgattaatttgaggtgaccc300

gatcacacctcatcaaaaaggattggtggcgacccccgtttttcgttttcattttcaaat360

ccaagtcgattcccgtttttccaaaaaatggttacgacaaccttattccggtgacgaata420

aaggttaggggtgttacataagcaagtgctaaaacttaaccattaaaccaacaaattcat480

tattattaattttttatcaaaaataaaatttaaagcattctaaattctcttaccctacgc540

ttaaaaaaaataaaaatatgaaatttatccctatttcttctagccctatttttgaggtgt600

gacaaccactaaaaatcataaaatgaaacataaaaacgcttaattacaagctctttaatg660

taaaaaaataacttattttgccatatcaaatttcccgacacttaagtctttacttttctt720

caagtaaacacacaaataaacaagaaacatacacaaagacgaccgttgagcaagaataat780

aaaagtaatcagccaagaggtatatacaaagtaaacgagtcttctaacatgcaacgtaag840

tatgatatgtagagaatttacaacttctaaaatagatcaccagagttcataaaattacaa900

aatgaacaagtataaagataatcatacaccatcaaaggtgtctaaatagatataatgttt960

atactaaaacttgtgtacaatatatgtatagtttggtggatgaattatttaatgcattga1020

taataactagtaatagtaataataattaataggaccctataaatcaatttcatataccta1080

cactattcaaaagtagttgtactatctactaataaatacaaaatatgggaagtcttttct1140

ttttttttatcctatatactatatataatatttataatataaaaagggtaaactacacaa1200

ataattattcaactactaaatatttttattttaggtacttaaaacgataaatttacaatt1260

tagccaacagactttcatcatcatacagact1291

<210>2

<211>1600

<212>dna

<213>亚洲棉(asiaticcotton)

<400>2

cttaaatattgttgagtgatgagaatggtgggggtgacacttgacagaaaagagataaaa60

ataaaaagctactaaattattgaaagaaatggaagaaggaaaatatagaaagattccttt120

tatgtccaaacaaggactggctttgcaaatattttgtcatattggtctctatttgatgat180

taaagaataatggaaatggataaattgtaaatatcaagtggtattagacttttactgttt240

gtttttttcaactgggttagattttttttatcccaaaaagagaactggggttagattttt300

attctttatatatataaaatatgtgtgtgtggtagagttttggttttcgtacagattgat360

tgacgatcctggagagagatggaacatgtcagttgtaccctcgtactgagtcttgtctcc420

aactccctcatcttgcatttactttattgtaatgggatgataaaagctgtaaaaataacc480

agtcaaattgataataacaaagttcaattttattacaaaaatatatgagatggaaattat540

tttttacttcaaagaaacaacggtcgtacttgtattattattattattattattattatt600

attattattattattattattagtatttgaggaatgcttccactacattgcgggataaat660

tttataattttattttatatattgtataatgtgtataattttatatattttacatgaatt720

aaataattatatttcattcaatgtaagatttatttttattgtaattttagaaaaaatttt780

aatgagataatatgtaacacttcaaatccgatctaaacgttatggttgaatcttgaaaat840

tacattaataaatcaatactttaatcattttctttcaaatcgtaacttattctgaaatcg900

aaatttgtgaattttattaatacttgctttaatccttcgataagagaatttgtcaataaa960

aaagcatgtgtggggattttgaaatgttatcttataaaagtcaatttattaaaaatgtct1020

tgctataaagtttatttacttgtttttgtaaaaatgcatattctcgattaaaattttaca1080

gtggaaagtttcttagacttgtttagacatgaaaatcgaatgctaaattttagttttaaa1140

aaaatttgccaaatcttaatatagctaattaaaatatttaacaatcctcaaaacgataat1200

ttcttatcgaaaataatttttaaaccaacaagctctcattattattaatttcttatcgaa1260

aataatttttaaagcattctaaattctcttaccctacacttaaaaaaatacaaatatgaa1320

atttatccctatttcttctagccctatttttggggtgtgacaaccactagaaatcataaa1380

ataaaacataaaaatgcttaattacaagctctttaatgtaaaaaagaacttattttgcaa1440

tatctaatttcccgacacctaagtctttgctttccctcaagtaaacacacaaatcaacaa1500

gaaacatgcacaaagactacgcttgaggaagaataataaaagtaatcaaccaagaagtaa1560

ccaaccaagagttatatacaaagtaaacgagtcttctaac1600

<210>3

<211>1062

<212>dna

<213>亚洲棉(asiaticcotton)

<400>3

gatgttgtgtcctaactcactgtatataacattttgttgcttcgaaacgagaaggtcttt60

aacgttcgaatgtttttttacaaaaagaaggattgtatttcaaagtctttcaagtttttt120

atttttcgacactaagacactaattaatcaactaggtatcaatttttgggcgtatcgagg180

gtgctaatccttcctcgtgcgtaatcgactcctgaactcattttctgattttcgtagacc240

agagattatcgttttagtaaatcttaacttttattaaaatgattaatttgaggtgacccg300

atcacacctcatcaaaaaggattggtggcgacccccgtttttcgttttcattttcaaatc360

caagtcgattcccgtttttccaaaaaatggttacgacaaccttattccggtgacgaataa420

aggttaggggtgttacataagcaagtgctaaaacttaaccattaaaccaacaaattcatt480

attattaattttttatcaaaaataaaatttaaagcattctaaattctcttaccctacgct540

taaaaaaaataaaaatatgaaatttatccctatttcttctagccctatttttgaggtgtg600

acaaccactaaaaatcataaaatgaaacataaaaacgcttaattacaagctctttaatgt660

aaaaaaataacttattttgccatatcaaatttcccgacacttaagtctttacttttcttc720

aagtaaacacacaaataaacaagaaacatacacaaagacgaccgttgagcaagaataata780

aaagtaatcagccaagaggtatatacaaagtaaacgagtcttctaacatgcaacgtaagt840

atgatatgtagagaatttacaacttctaaaatagatcaccagagttcataaaattacaaa900

atgagcaagtataaagataatcatacaccatcaaaggtgtctaaatagatataatgttta960

tactaaacacaattctaatcattccttttttttttcagtaacgttataagaaaggcactt1020

tccaagtactttcatcaatgtgaacggaactaaaacttgtgt1062

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagatgttgtgtcctaactcactgtat27

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agtctgtatgatgatgaaagtctgttg27

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acacaagttttagttccgttcacattg27

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cttaaatattgttgagtgatgagaatgg28

<210>8

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gttagaagactcgtttactttgtatata28