一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法。

背景技术：

中华绒螯蟹(eriocheirsinensis)俗称“河蟹”，在我国分布十分广泛，是我国重要的养殖蟹类，具有较高的经济价值和很深的文化底蕴。近年来，随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大，养殖面积和养殖密度的不断增大，产量的年年上升，造成了相关病害的不断发生，严重影响着中华绒螯蟹养殖业的健康稳定发展。血细胞在宿主免疫应答中起着重要作用，包括识别、吞噬、黑化、细胞毒性以及细胞间信息传递等。离体培养的血细胞，可进一步探究其造血和免疫机理。血细胞培养模型可以排除在体实验多种干扰因素的影响，在特定环境下研究目的因子对血细胞的作用。利用体外培养的血细胞建立多种病理生理模型，有利于从细胞和分子生物学水平研究蟹类疾病的发病机制和预防手段。在另一方面，随着基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等技术的不断发展，基因编辑技术的不断提高，蟹类的基因功能与分子育种研究极需其细胞系，然而目前蟹类的细胞培养技术不成熟，中华绒螯蟹的原代细胞培养还存在细胞形态差、存活率低、存活时间短，也极少分裂，不易传代等诸多问题，严重影响了中华绒螯蟹的基因功能研究和分子育种技术的发展，因此需要找到一种可以提高血细胞存活率，保护细胞形态的血细胞培养基制备的方法是具有重要的科研意义和现实价值的。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法，用于提高中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过如下技术方案实现的。本发明的一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自tc-100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液选自1×pbs和/或hepes缓冲溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述碱金属氯化物选自氯化钠和/或氯化钾。

在本发明的一些实施方式中，所述抗生素选自双抗、青霉素和链霉素中的一种或多种的组合。

在本发明的一些实施方式中，所述培养基的渗透压为900-1100mosm/kg。

本发明的另一方面提供所述培养基的制备方法，包括：提供tc-100基础培养基，向所述tc-100基础培养基中加入氯化钙、碱金属氯化物、葡萄糖和缓冲溶液，调节渗透压后加入抗生素溶液。

本发明的另一方面提供所述的培养基在中华绒螯蟹血细胞培养方面的用途。

本发明的另一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养方法，提供灭菌的中华绒螯蟹，抽取所述中华绒螯蟹足基膜处血淋巴，向所述血淋巴中加入抗凝剂混合均匀，冷冻离心，收集血细胞，弃上清并用缓冲溶液使细胞重悬，在细胞培养皿中接种细胞，并添加本发明所述的培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述足基膜是中华绒螯蟹第五步足足基膜。

在本发明的一些实施方式中，所述中华绒螯蟹血细胞的培养方法还包括以下条件的任一项或多项：

a1)所述血淋巴和抗凝剂的体积相等；

a2)所述冷冻离心是于冷冻离心机0-4℃、2500-3000r/min冷冻离心3-5分钟；

a3)所述培养基中的培养液24h更换1/2培养液。

附图说明

图1为本发明以tc-100为基础培养基培养的中华绒螯蟹血细胞形态显微图。

图2为本发明选择不同培养基条件下血细胞存活率图。

图3为本发明以tc-100为基础培养基在不同血清浓度条件下血细胞存活率图。

图4为本发明实施例1长期培养的中华绒螯蟹血细胞存活率图。

具体实施方式

本发明发明人经过大量探索实验，提供了一种中华绒螯蟹血细胞培养基及其培养方法，显著地提高了中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率，延长了血细胞体外培养的时长，体外培养的血细胞可以保持良好的细胞形态，在此基础上完成了本发明。

下面详细说明根据本发明中华绒螯蟹血细胞的培养基、培养基的制备方法及中华绒螯蟹血细胞的培养方法。

本发明第一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自tc-100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述tc-100基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、d(+)葡萄糖和胰蛋白胨汤等。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述tc-100基础培养基是由胰蛋白胨肉汤提供必需的生长因子。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述无机盐包括氯化钙二水合物、无水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠等中的一种或多种的组合。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述氨基酸包括甘氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、l-组氨酸盐酸盐、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠盐、l-缬氨酸等中的一种或多种的组合。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述缓冲溶液选自1×pbs和/或hepes缓冲溶液。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述碱金属氯化物选自氯化钠和/或氯化钾。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述抗生素选自双抗、青霉素和链霉素中的一种或多种的组合。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述培养基的渗透压为900-1100mosm/kg。

本发明的第二方面提供前述培养基的制备方法，包括：提供tc-100基础培养基，向所述tc-100基础培养基中加入氯化钙、碱金属氯化物、葡萄糖和缓冲溶液，调节渗透压后加入抗生素溶液。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，tc-100基础培养基为0.9-1l。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，氯化钙的质量为1-2g。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，碱金属氯化物的质量为1-2g。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，葡萄糖的质量为1.5-2.5g。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，所述渗透压是利用渗透压仪将渗透压调节至900-1100mosm/kg。

在本发明所提供的培养基的制备方法中，调节渗透压后可以先用0.22微米的细菌过滤器过滤，再添加抗生素溶液。

本发明第三方面提供前述的培养基在中华绒螯蟹血细胞培养方法方面的用途。

本发明第四方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养方法，包括提供灭菌的中华绒螯蟹，抽取所述中华绒螯蟹足基膜处血淋巴，向所述血淋巴中加入抗凝剂混合均匀，冷冻离心，收集血细胞，弃上清并用缓冲溶液使细胞重悬，在细胞培养皿中接种细胞，并添加本发明第一方面所述的培养基。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，灭菌是选用75％的酒精擦拭体表进行灭菌。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述抽取足基膜处血淋巴中，足基膜是中华绒螯蟹第五步足足基膜。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述血淋巴和抗凝剂的体积相等，可以是用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500-600ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀，防止血液凝结。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述抗凝剂是由30mmol/l柠檬酸三钠、338mmol/l氢化钠、115mmol/l葡萄糖、10mmol/ledta配置得到。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述冷冻离心是于冷冻离心机0-4℃、2500-3000r/min冷冻离心3-5分钟。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述细胞培养皿为96孔细胞培养皿、12孔培养皿、6孔培养皿中的一种。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述培养基的添加量为100-200ul。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25-28℃恒温培养。

本发明所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述培养基中的培养液24h更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

本发明的有益效果是：

本发明的培养基显著地提高了中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率，延长了血细胞体外培养的时长，体外培养的血细胞可以保持良好的细胞形态，该发明方法设计简单合理，操作方便，工艺简单，安全稳定，培养效果好，提高了中华绒螯蟹血细胞培养的效果，适用范围广，有利于推广和普及。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。

一、中华绒螯蟹血细胞培养基的制备方法及体外培养方法

实施例1

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例2

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液和5％的胎牛血清。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例3

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液和10％的胎牛血清。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例4

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液和15％的胎牛血清。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例5

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液和20％的胎牛血清。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例6

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙2g、氯化钠2g、葡萄糖2.5g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加8％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至900mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

实施例7

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1g、氯化钠1g、葡萄糖1.5g。量取1ltc-100基础培养基，将上述称取的物质放入tc-100培养基中，添加10％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1100mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1.5％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

对比例1

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1l1×l-15基础培养基，将上述称取的物质放入1×l-15培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

对比例2

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1l2×l-15基础培养基，将上述称取的物质放入2×l-15培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

对比例3

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1l3×l-15基础培养基，将上述称取的物质放入3×l-15培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

对比例4

1)培养基的制备方法

分别称取氯化钙1.5g、氯化钠1.5g、葡萄糖2g。量取1lsf-900基础培养基，将上述称取的物质放入sf-900培养基中，添加5％1×pbs并充分混合均匀，利用渗透压仪将渗透压调节至1000+100mosm/kg，然后用0.22微米的细菌过滤器过滤。添加1％青霉素-链霉素双抗溶液。

2)中华绒螯蟹血细胞的体外培养

取实验所用中华绒螯蟹，用75％的酒精擦拭体表进行灭菌，用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀。于冷冻离心机4℃，2500r/min冷冻离心5分钟，收集血细胞。于超净工作台弃上清用1×pbs使细胞重悬，接种细胞于96孔细胞培养皿，添加100ul相应培养基，每组不同培养条件设置三个重复，于细胞培养箱设置温度为25℃恒温培养。24小时更换1/2培养液，以后每隔两天更换培养液。

二、中华绒螯蟹血细胞形态与存活率

自0h起每隔12h于换夜前在荧光倒置显微镜下观察血细胞的形态，比较其贴壁情况，生长状态，形态变化，细胞皱缩、涨破及溶解情况并拍照。用台盼蓝染色试剂盒对血细胞进行染色，观察变色情况，并对死细胞与活细胞进行计数，计算其存活率。

1、不同培养基对血细胞存活率的影响

观察采用实施例1、对比例1-4的培养方法培养得到的中华绒螯蟹血淋巴细胞，其中采用实施例1(采用tc-100基础培养基)培养的中华绒螯蟹血淋巴细胞形态最完整(如图1所示)，细胞溶解及破裂的情况较少，24h存活率(如图2所示)也显著高于对比例1(采用1×l-15基础培养基)、对比例2(采用2×l-15基础培养基)、对比例3(采用3×l-15基础培养基)、和对比例4(采用sf-900基础培养基)。

2、不同血清浓度对中华绒螯蟹血细胞存活率的影响

实施例1-5是向tc-100基础培养基分别添加0％、5％、10％、15％以及20％的胎牛血清对中华绒螯蟹血淋巴细胞进行体外培养，培养至72h细胞存活率分别为胎牛血清0％(50.3％)＞5％(42.0％)＞10％(31.5％)＞15％(18.9％)＞20％(19.3％)。结果显示，细胞培养至72h时不添加胎牛血清的tc-100培养基条件下的细胞存活率最高(图3)。

3、不同培养时间对中华绒螯蟹血细胞存活率的影响

利用实施例1的培养基对中华绒螯蟹的血细胞进行长期培养，并统计细胞存活率，结果见图4。血细胞在培养至第十天，存活率仍高于50％，说明本发明可提高中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率，并延长血细胞体外培养的时长。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。