本发明涉及生物转化技术领域，具体涉及一种生物转化合成天麻素的方法及应用。
背景技术：
天麻素(gastrodin)是中药天麻中的主要活性成分，其化学名称为：4-羟基甲基苯β-d吡喃葡萄糖苷。具有镇静、抗惊厥、抗炎、镇痛、扩张血管、抗氧化、增强机体免疫功能和抗老年痴呆等作用。在临床上广泛应用于眩晕(美尼尔氏病、病毒性眩晕、前庭神经元炎、椎基底动脉供血不足等)、神经痛(三叉神经痛、枕大神经痛等)、头痛(神经衰弱及神经衰弱综合症)、血管性头痛、紧张性头痛、脑外伤综合征、偏头痛等及癫痫的辅助治疗。在日本，天麻素还被用来改善学习记忆功能和治疗老年痴呆。
天麻素可从天麻中提取，但天麻是一种名贵药材，且天麻素含量较低(约为0.1％)，因此该法获得天麻素成本很高。此外天麻的生产依赖原始木材资源，会给环境的保护和天麻药材资源的保护带来困难，难以大量生产。目前我国天麻素的生产主要采用化学合成法，但存在安全性和环境污染等潜在风险，以及化学反应副反应多，反应专一性差、收率较低，生产成本较高等问题。
天麻素的生物合成已有报道，如蔡洁等利用人参毛状根细胞生物合成天麻素转化体系将外源对羟基苯甲醇转化为天麻素。龚加顺等利用紫花曼陀罗细胞和白花曼陀罗细胞悬浮培养转化外源对羟基苯甲醛合成天麻素，在得到天麻素的同时分离得到对羟基苯甲醇，并阐述紫花曼陀罗细胞悬浮培养细胞转化外源对羟基苯甲醛合成天麻素的可能途径。除此之外，戴均贵等也利用长春花及桔梗悬浮培养细胞转化生成天麻素。但是此类生物转化也存在些问题，不尽完美，例如所需转化时间长、产量低，同时人参等中药材细胞比较难以培养，导致这些方法只能够存在实验室阶段。
天麻素还可用化学法合成，但由于化学合成过程需要经过多步的保护和去保护措施，过程复杂且成本高，副产物较多且难于分离，对环境危害较大。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种简便、高效的生物转化合成天麻素的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种生物转化合成天麻素的方法，向含益母草悬浮细胞的培养液中添加对羟基苯甲醇，经过一定的转化时间，使所述益母草悬浮细胞中含有天麻素，使其所述培养液中也含有天麻素。
所述对羟基苯甲醇的初始浓度为0.1～30mmol/l；所述对羟基苯甲醇的初始浓度优选为0.5～10mmol/l；所述对羟基苯甲醇的初始浓度进一步优选为1～8mmol/l。
所述转化时间为1～720h；所述转化时间优选为5～160h；所述转化时间进一步优选为36～50h。
所述对羟基苯甲醇的添加次数为1～15次；所述对羟基苯甲醇的添加次数优选为1～8次；所述对羟基苯甲醇的添加次数进一步优选为1～4次。
当所述对羟基苯甲醇的添加次数大于1次时，相邻两次之间的时间间隔为24～240h；相邻两次之间的时间间隔优选为24～120h；相邻两次之间的时间间隔进一步优选为48～72h。
所述对羟基苯甲醇由对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸中的任意一种或其两种组合在所述益母草悬浮细胞内转化而成。所述对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸添加至益母草悬浮细胞培养液中后，被益母草悬浮细胞吸收后，在相关酶的作用下，可转化为对羟基苯甲醇参与后续反应。
本发明还提供了一种含有天麻素的益母草悬浮细胞或培养液的用途，采用上述方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞或培养液作为天麻素的提取原料，以及一种含有天麻素的益母草悬浮细胞的用途，采用上述方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞制备食品、保健食品、食品添加剂或药物。
本发明将对羟基苯甲醇直接添加到含益母草悬浮细胞的培养液中，将对羟基苯甲醇转化合成为天麻素，大大减少了对羟基苯甲醇的损耗，转化率高，且益母草悬浮细胞培养所需时间较短，易于获得，操作非常简便、安全。采用本发明的方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞或培养液可以作为天麻素的提取原料，采用本发明的方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞还可以制成食品、保健食品、食品添加剂或药物。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种生物转化合成天麻素的方法，向含益母草悬浮细胞的培养液中添加对羟基苯甲醇，经过一定的转化时间，使所述益母草悬浮细胞中含有天麻素，使其所述培养液中也含有天麻素。
其中，最初的培养液中不含天麻素，但随着细胞死亡，溶胞破裂，细胞内的天麻素可释放到培养液中，因此，培养液中也含有天麻素。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1、益母草悬浮细胞培养：取5g纯化后生长旺盛的益母草疏松愈伤组织，接入含有100ml培养液(ms培养基+0.5mg/l2，4-二氯苯氧乙酸+2.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤)的250ml摇瓶中。按照新液:旧液＝3:1，每隔5天换液。培养前期，换液时每次剔除大的细胞团。培养一段时间，有充分的较小细胞团后，换液时将悬浮细胞液过50目筛网，收获滤液，静置片刻待细胞下沉，以新旧液比3:1弃去上液，补足新液，继续摇床培养。反复过50目筛培养一段时间后，建立起益母草悬浮细胞系。此后间歇性地过50目筛网以维持悬浮细胞的分散性。
以5g/100ml接入益母草悬浮细胞种子液，于转速110r/min，光照12h/天，25℃培养，即得益母草悬浮细胞转化体系。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加7mmol/l对羟基苯甲醇水溶液，分别于添加后6h、48h收获，共收获2次，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：分别取含本实施例及空白组益母草悬浮细胞培养液，抽滤，滤液置-80℃保存，细胞残渣用水清洗3遍加入10倍量70％甲醇，于80℃下热回流1h。冷却后补足减失的重量，过0.45μm滤膜；培养液即滤液直接解冻后过0.45μm滤膜，即得11组供试品溶液。另取天麻素标准品，加50％甲醇制成每1ml中含0.05mg的溶液，作为标准品溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.05％磷酸水(3:97)为流动相；检测波长为220nm。理论板数按天麻素峰计算应不低于3000。分别精密吸取11组供试品溶液及标准品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中6h天麻素总转化率(细胞内2.47％+培养液1.09％)为3.56％；48h天麻素总转化率(细胞内15.67％+培养液7.89％)为23.56％，而空白组所得益母草悬浮细胞转化体系中未检测出天麻素。
实施例2
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为5mmol/l，分别于添加后24h、48h收获，共收获2次，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中24h天麻素总转化率(细胞内14.88％+培养液2.31％)为17.19％；48h天麻素总转化率(细胞内16.69％+培养液3.65％)为20.34％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例3
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加4mmol/l对羟基苯甲醇水溶液，添加后每隔12h收获，共收获10次，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中84h最高，天麻素总转化率(细胞内18.34％+培养液1.97％)为20.31％；60h最低，天麻素总转化率(细胞内9.62％+培养液0.86％)为10.48％，而空白组所得益母草悬浮细胞转化体系中未检测出天麻素。
实施例4
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为1mmol/l，分别于添加后36h、120h收获，共收获2次，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中36h天麻素总转化率(细胞内16.50％+培养液0.28％)为16.78％；120h天麻素总转化率(细胞内13.50％+培养液2.67％)为16.17％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例5
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为6mmol/l，共添加4次，相邻两次之间的时间间隔为120h，于第一次添加后420h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内17.7％+培养液3.7％)为21.4％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例6
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为2mmol/l，共添加2次，相邻两次之间的时间间隔为240h，于第一次添加后300h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内15.9％+培养液4.2％)为20.1％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例7
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为8mmol/l，共添加3次，相邻两次之间的时间间隔为24h，于第一次添加后100h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内15.8％+培养液3.7％)为19.5％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例8
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为10mmol/l，共添加2次，相邻两次之间的时间间隔为24h，于第一次添加后80h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内11.8％+培养液3.4％)为15.2％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例9
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为20mmol/l，于添加后5h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内1.6％+培养液0.3％)为1.9％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例10
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醇水溶液使其浓度为30mmol/l，于添加后1h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内1.6％+培养液0.0％)为1.6％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例11
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醛水溶液使其浓度为0.5mmol/l，共添加8次，相邻两次之间的时间间隔为72h，于第一次添加后580h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内3.7％+培养液0.5％)为4.2％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
实施例12
1、益母草悬浮细胞培养：培养方法同实施例1。
转化方法：向益母草悬浮细胞转化体系中添加对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸混合水溶液，使对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸的初始浓度均为0.1mmol/l，共添加15次，相邻两次之间的时间间隔为48h，于第一次添加后720h收获，即得。
同时设置空白组，空白组与本实施例的区别仅在于，空白组不添加对羟基苯甲醇水溶液。
2、天麻素的检测：检测方法同实施例1。
由检测结果可知，本实施例所得益母草悬浮细胞转化体系中天麻素总转化率(细胞内4.8％+培养液1.4％)为6.2％，而空白组所得益母草悬浮细胞中未检测出天麻素。
上述实施例的具体参数如下表所示：
通过表格内的数据可以看出，采用本发明的生物转化合成天麻素的方法，操作非常简便、安全，将对羟基苯甲醇直接添加到益母草悬浮细胞中，大大减少了对羟基苯甲醇的损耗，从而有效提高天麻素的转化率。
本发明还提供了一种含有天麻素的益母草悬浮细胞或培养液的用途，采用上述方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞或培养液作为天麻素的提取原料，以及一种含有天麻素的益母草悬浮细胞的用途，采用上述方法得到的含有天麻素的益母草悬浮细胞制备食品、保健食品、食品添加剂或药物。
实施例13：提取天麻素
将实施例1所获得益母草悬浮细胞作为天麻素的提取原料。
提取步骤为：取益母草悬浮细胞培养液，抽滤，弃滤液，滤渣即益母草悬浮细胞，取10kg，加水4倍量，煎煮1h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25，放冷，用等体积正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩至无醇味，加3倍量水稀释后，以1bv(床体积)/h通过ab-8大孔吸附树脂柱，先用3倍床体积的水洗涤，弃去，再2倍床体积的10％乙醇洗涤，弃去，再用5倍床体积20％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，得粗提取物，加甲醇适量溶解后，加3倍粗提取物重量的硅胶，混匀，加入20倍粗提取物重量的硅胶柱上部，用10倍床体积甲醇－氯仿(2:8)溶液，进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，用10倍体积的无水乙醇在10℃以下结晶，晶浆离心分离，无水乙醇洗涤后，真空干燥，得天麻素；得纯度为99.1％的天麻素，收率为21％。
实施例14：制备含有天麻素的保健食品
将实施例1获得的益母草悬浮细胞，作为制备保健饮料的原料。
取益母草悬浮细胞培养液，抽滤，弃滤液，滤渣即益母草悬浮细胞，取10kg，加水4倍量，煎煮1h，煎液滤过，滤液加入2％明胶，混匀，放置过夜，滤过，滤液加水稀释5倍，再加入白砂糖12％，抗坏血酸0.02％，柠檬酸0.12％，焦糖色0.15％，香精0.15％，灭菌，分装，制成饮料。
所得饮料对神经衰弱、失眠、头痛等症状有缓解作用，具有良好的保健功能。
实施例15：制备含有天麻素的食品添加剂
将实施例1获得的益母草悬浮细胞，作为制备食品添加剂的原料
取益母草悬浮细胞培养液，抽滤，弃滤液，滤渣即益母草悬浮细胞，取10kg，加水4倍量，煎煮1h，煎液滤过，滤液加入2％明胶，混匀，放置过夜，滤过，滤液浓缩成稠膏后，于60℃真空干燥得干膏，粉碎后即可作为食品添加剂使用。
在制作面包时，在小麦粉中添加上述添加剂2％，对面包的感官质量无不良影响，面包中含天麻素功能因子，具有预防神经衰弱、失眠、缓解头痛等保健功能。
实施例16：制备含有天麻素的药物
将实施例1所得益母草悬浮细胞，作为制备药物的原料。
取益母草悬浮细胞培养液，抽滤，弃滤液，滤渣即益母草悬浮细胞，取10kg，加水4倍量，加水煎煮1h，滤液浓缩成稠膏后，于60℃真空干燥得干膏，粉碎后，取干膏粉300g，加入药用淀粉50g，按常规制药工艺制成片剂。
所得片剂用于治疗和预防神经衰弱、神经衰弱综合症及血管神经性头痛等症等疾病。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。