用于生产法尼烯的大肠杆菌的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种高产β-法尼烯的基因工程生产菌。

背景技术：

蚜虫在受到惊吓时可从腹管中分泌出一种“报警信息素”，以使周围其他蚜虫感知并迅速逃逸，从而停止对作物的侵害。bowers等于1972年首次分离鉴定出蚜虫报警信息素反-β-法尼烯(e-β-farnesene，简称eβf或者ebf)，eβf是一种倍半萜类物质。francis等发现ebf是16种蚜虫报警信息素的主要或唯一成分(bowersetal.,1972；francisetal.,2005)。该类信息素施用于田间，可使一定范围内的蚜虫虫口密度控制在域值之内，此时虫、病害对作物的影响不大。eβf不仅存在于蚜虫报警激素中，也是许多植物次生代谢产物之一。许多植物中富含eβf成分，通过分类提纯可获得高浓度精油，如唇形科hemizygiapetiolata植物中eβf成分含量高达70％以上(bruceetal.,2005)；伞形科pimpinellakhorasanica植物的茎、花和种子中eβf成分也有较高的含量(askarietal.,2013)。除了报警活性之外，ebf还具有其它多重生物活性，例如对某些昆虫具有类似保幼激素iii的功能，具有调控蚜虫后代中有翅蚜与无翅蚜比例的功能，在高剂量使用时对蚜虫有明显毒杀作用等。因此，利用天然ebf的生物学特性进行蚜虫防治，具有用量少，专属性强，对非靶标生物和环境安全等优点，引起植物保护专家和农业生产者的青睐。同时，以天然ebf为基础进行结构与改造，制成ebf类似物来开发低毒性或无毒性的新农药是农业科学领域的研究热点之一。

另外，人们发现β-法尼烯除了可以应用于农药领域之外，还在化工领域和医药领域具有许多用途，比如用于合成维生素e等，具有广阔的市场价值，近年来受到了人们的广泛关注。

法尼烯在植物中的含量非常低，无法以提取天然产物的方式来制备；化学合成法的成本极高，且纯度较低；因而利用微生物生产法尼烯似乎成为人们利用这一天然化合物的最佳方式。微生物发酵法最大的瓶颈在于，微生物菌体中与其生物合成相关的酶的表达水平较低。因此，构建能够高水平合成β-法尼烯、并且适合于工业化应用的工程菌是走向工业化的关键。

技术实现要素：

为了克服现有β-法尼烯生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明利用基因工程技术来改造产异戊二烯的大肠杆菌，通过增强与β-法尼烯产生相关的基因、替换异戊二烯分支代谢途径，获得一株高产β-法尼烯的生产菌株。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种β-法尼烯生产菌。

本发明的第二个目的在于提供所述β-法尼烯生产菌用于生产β-法尼烯的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种生产β-法尼烯的方法。

为了达到上述目的，本发明对于大肠杆菌中与β-法尼烯代谢途径相关的基因进行了系统的研究和筛选，并且

设计出包括如下步骤的基因工程菌构建和筛选方案：

a.构建质粒phgfh，其包含peth、petf、ispg、isph、复制区p15a基因；

构建质粒pages，其包含mvae、mvas、flda、ispg、复制子repa基因；

构建质粒pakf，其包含大肠杆菌来源的ispa、马氏甲烷八叠球菌来源的mvak(该基因在文献chenyang,etal.,metabolicengineering.37(2016)79–91中已有描述。)、序列为seqidno:1的密码子优化bfs(β-farnesenesynthasegene，β-法尼烯合酶基因)、复制子cole1基因；

b.将对步骤a中所构建的质粒phgfh、pages和pakf共转入大肠杆菌、优选可产异戊二烯的大肠杆菌中，得到包含基因mvae、mvas、mk、pmk、pmd、idi、ispa和bfs的阳性克隆，其中产异戊二烯的大肠杆菌包含甲羟戊酸途径的基因mk、pmk、pmd和idi；

c.从步骤b中所构建的阳性克隆中，筛选出生产β-法尼烯的菌株。

优选地，步骤b中所述的产异戊二烯的大肠杆菌是文献(synergybetweenmethylerythritolphosphatepathwayandmevalonatepathwayforisopreneproductioninescherichiacoli.chenyang,etal.,metabolicengineering,37(2016)79–91)中描述的菌株cibts1758。

通过上述基因工程构建，筛选出一种高产β-法尼烯的菌株，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16709。

构建的基因工程菌cgmccno.16709包含甲羟戊酸途径的相关基因mvae、mvas、mk、pmk、pmd、idi以及法尼烯合成相关基因ispa和序列为seqidno:1的bfs(β-farnesenesynthasegene，β-法尼烯合酶基因)，其中基因ispa替换了产异戊二烯的大肠杆菌cibts1758中原有的isps基因。

根据本发明的第二个方面，提供了上述基因工程菌cgmccno.16709在β-法尼烯的生产中的应用。

在一种实施方式中，通过对上述β-法尼烯生产菌进行发酵来生产β-法尼烯。

其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于大肠杆菌生长发酵的培养基。

在一种优选的实施方式中，上述β-法尼烯生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段(生产发酵阶段)。这两个阶段分别使用种子培养基和生产发酵培养基，可以不相同。

优选地，种子培养基例如是lb培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素。种子扩大培养基例如是v7s培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素。生产发酵培养基例如是v7e培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素和0.1mmiptg。

所述v7s培养基组成如下：葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，mops0.1m/l，(nh4)2so45g/l，na2hpo41g/l，kh2po40.4g/l，mgso40.5g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，维生素b12mg/l，100倍微量元素溶液(一水柠檬酸10g/l,mnso4·7h2o2g/l,feso4·7h2o0.5g/l,znso4·7h2o0.2g/l,cuso4·5h2o0.05g/l,0.05gcocl2·6h2o,na2moo4·2h2o0.05g/l)。

所述v7e培养基组成如下：葡萄糖5g/l，酵母粉1g/l，mops0.1m/l，(nh4)2so45g/l，na2hpo41g/l，kh2po40.4g/l，mgso40.5g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，维生素b12mg/l，100倍微量元素溶液(一水柠檬酸10g/l,mnso4·7h2o2g/l,feso4·7h2o0.5g/l,znso4·7h2o0.2g/l,cuso4·5h2o0.05g/l,0.05gcocl2·6h2o,na2moo4·2h2o0.05g/l)。本发明所构建β-法尼烯生产菌cgmccno.16709通过发酵能够实现发酵液中β-法尼烯的有效积累，β-法尼烯产量高达10mg/l，具有工业化应用前景。

本发明构建的β-法尼烯高产基因工程菌的拉丁学名是escherichiacoli，中文名称是大肠埃希氏菌，即，大肠杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2018年11月05日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.16709。

附图说明

图1为质粒pakf的结构示意图。

图2是本发明构建的大肠杆菌cibts2509c的代谢途径变化示意图。原始菌株cibts1758是异戊二烯产生菌，包含过表达mep途径，相对于更原始的大肠杆菌e.colibl21而言，其引入了真核生物的mva途径。在异戊二烯产生菌cibts1758的基础上，经本发明的基因工程改造后，将法尼基焦磷酸合酶ispa替换异戊二烯合酶isps，并引入β-法尼烯合酶bfs(其编码基因是序列为seqidno:1的bfs)，增强了与β-法尼烯产生相关的基因、替换了异戊二烯分支代谢途径，从而构建出法尼烯合成菌株。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

与现有技术不同的是，为了提供一种高产β-法尼烯、有效降低β-法尼烯生产成本、适合于工业化发酵的工程菌，本发明基于代谢工程，以高产异戊二烯的大肠杆菌为出发菌，通过阻断异戊二烯的合成，并高效表达的法尼基焦磷酸合酶ispa和β-法尼烯合酶基因，获得的基因工程菌可在低成本发酵培养基中实现β-法尼烯的有效积累。具体而言，本发明以异戊二烯产生菌cibts1758为出发菌，引入了高效表达的来自真核生物的甲羟戊酸途径(mva途径)，同时增强了宿主细胞中磷酸甲基赤藓醇途径(mep途径)，用于增加β-法尼烯合成前体ipp(异戊酰焦磷酸)、dmapp(二甲烯丙基焦磷酸)和fpp(法尼基焦磷酸)的供应，并且经过对阳性克隆菌株的大量筛选，得到了符合要求的菌株cibts2509c。

在本文中，对于本发明，术语“β-法尼烯基因工程生产菌”、“β-法尼烯基因工程菌”、“法尼烯生产菌”、“大肠杆菌cibts2509c”、“cibts2509c菌株”表示相同的意义，都是指β-法尼烯生产菌cgmccno.16709。

在本文中，术语“大肠杆菌cibts1758”、“菌株cibts1758”、“cibts1758”表示相同的意义，都是指作为法尼烯生产菌cgmccno.16709构建基础的原始菌株cibts1758，由上海工业生物技术研发中心构建并保藏，其在文献synergybetweenmethylerythritolphosphatepathwayandmevalonatepathwayforisopreneproductioninescherichiacoli.chenyang,etal.,metabolicengineering37(2016)79–91.中有详细描述。菌株cibts1758是基于大肠杆菌e.colibl21构建而得，基因型为bl21,glms-psts::pl*mkmmpmkscpmdscidisc,δidi::pgi*idisc,pl**dxs,pgi*dxr。

本发明通过将质粒phgfh、pages和pakf共转入大肠杆菌cibts1758中，通过对获得的阳性克隆株cibts1758/phgfh/pages/pakf进行筛选，命名为cibts2509c，得到法尼烯生产菌cgmccno.16709。其包含基因mvae、mvas、mk、pmk、pmd、idi、ispa和bfs。其中基因mvae、mvas是通过质粒phgfh和pages转化入宿主cibts1758中而获得的，基因mk、pmk、pmd、idi是宿主cibts1758包含的甲羟戊酸途径相关基因，基因ispa和bfs是通过质粒pakf转化入宿主cibts1758中而获得的。

作为法尼烯生产能力对比的对照菌株是通过将质粒phgfh、pages和pak共转入大肠杆菌cibts1758中而获得的菌株cibts1758/phgfh/pages/pak。由于质粒pakf包含与法尼烯合成相关的基因ispa和序列为seqidno:1的bfs，而质粒pak包含一种与法尼基焦磷酸合成相关的基因ispa、但不包含bfs基因，这种基因差异使得大肠杆菌cibts2509c的具有β-法尼烯生产能力，而对照菌株不具有这种能力。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

质粒phgfh由上海工业生物技术研发中心提供，其包含peth、petf、ispg、isph、复制区p15a基因。

质粒pages由上海工业生物技术研发中心提供，其包含mvae、mvas、flda、ispg、复制子repa基因。

质粒psk由上海工业生物技术研发中心提供，其包含isps和mvak基因。

质粒puc57-150-1由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其包含序列为seqidno:1的bfs基因，该序列为优化的大肠杆菌偏好性密码子。

大肠杆菌cibts1758由上海工业生物技术研发中心构建并提供。

质粒phgfh、质粒pages和大肠杆菌cibts1758已经在文献synergybetweenmethylerythritolphosphatepathwayandmevalonatepathwayforisopreneproductioninescherichiacoli.chenyang,etal.,metabolicengineering37(2016)79–91.中公开。

主要培养基：

种子培养基例如是lb培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素。种子扩大培养基例如是v7s培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素。生产发酵培养基例如是v7e培养基，其可以包含100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素和0.1mmiptg。

所述v7s培养基组成如下：葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，mops0.1m/l，(nh4)2so45g/l，na2hpo41g/l，kh2po40.4g/l，mgso40.5g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，维生素b12mg/l，100倍微量元素溶液(一水柠檬酸10g/l,mnso4·7h2o2g/l,feso4·7h2o0.5g/l,znso4·7h2o0.2g/l,cuso4·5h2o0.05g/l,0.05gcocl2·6h2o,na2moo4·2h2o0.05g/l)。

所述v7e培养基组成如下：葡萄糖5g/l，酵母粉1g/l，mops0.1m/l，(nh4)2so45g/l，na2hpo41g/l，kh2po40.4g/l，mgso40.5g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，维生素b12mg/l，100倍微量元素溶液(一水柠檬酸10g/l,mnso4·7h2o2g/l,feso4·7h2o0.5g/l,znso4·7h2o0.2g/l,cuso4·5h2o0.05g/l,0.05gcocl2·6h2o,na2moo4·2h2o0.05g/l)。

实施例1：质粒pakf的构建

质粒pakf构建中使用的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

表1中，名称中的“-f”代表正向；“-r”代表反向。

1.1以大肠杆菌mg1655基因组为模板，以ispa-fg/ispal-r2为引物，pcr扩增ispal片段，约969bp(扩增同源臂+ispa+linker)。pcr条件：95℃变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s,68℃延伸1min，设置32个循环，68℃保温10min，最后16℃保温10min。

胶回收ispal片段，以ispal片段为模板，以ispa-fg/ispa-rg为引物，pcr扩增ispalg片段，约1004bp(扩增同源臂+ispa+linker+同源臂)。pcr条件：95℃变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s,68℃延伸1min，设置32个循环，68℃保温10min，最后16℃保温10min。

psk质粒利用ncoi/nrui酶切，胶回收约5.4kb片段。ispalg片段利用gibson克隆与上述的5.4kb回收片段连接。连接片段转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于氨苄抗生素平板，37℃培养。挑取阳性克隆，并将阳性克隆测序，获得质粒pak。完成ispa基因对于isps基因的替换。

1.2质粒puc57-150-1用bamhi/hindiii酶切，回收大小为1.7kb的条带，和经相同酶切回收的质粒pak片段连接，连接片段转入dh5α感受态细胞，涂布于氨苄抗生素平板，37℃培养。挑取阳性克隆，并将阳性克隆测序，获得质粒pakf，其结构如图1所示。

实施例2：β-法尼烯产生菌的构建

2.1利用电转化方法直接将质粒phgfh、pages、实施例1中pakf共转入大肠杆菌cibts1758中，获得菌株cibts1758/phgfh/pages/pakf，命名为cibts2509c。

2.2利用电转化方法将质粒phgfh、pages、实施例1中pak共转入大肠杆菌cibts1758中，获得菌株cibts1758/phgfh/pages/pak，作为对照菌株。

实施例3：菌株发酵生产β-法尼烯

3.1菌株cibts2509c培养发酵

挑cibts2509单菌落至含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素的lb培养基中，37℃、220rpm过夜培养；随后按8％v/v的接种量接种到含有上述三种抗生素的v7s培养基中，37℃、220rpm继续培养8-12h；然后按8％v/v的接种量接种到含有上述三种抗生素和0.1mmiptg的v7e培养基中，37℃、220rpm继续培养8-12h；加入1/5体积的癸烷继续培养4h。12000rpm离心10min，收集癸烷相，送gc-ms分析。

法尼烯的gc分析方法如下：aglient7890a气象色谱仪，配备5975ms；色谱柱agilenthp-1(30mx0.25mm,0.25μm)；进样量：0.5μl；进样口温度：280℃，分流比10:1；gassaver:20ml/min；柱流速：1ml/min；载气：高纯氮气，柱前压：11.724psi，平均速率：26.511cm/sec；柱温：(1)、60℃，保持0min；(2)、10℃/min，升温到150℃，保持0min；(3)、30℃/min，升温到280℃，保持2min。总运行时间15.33min。检测器(fid)：温度：300℃，氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min；尾吹25ml/min；目标峰出峰时间：11.07min。

经gc-ms确认，目标产物β-法尼烯的产量为250mg/l。

3.2对照菌株cibts1758/phgfh/pages/pak培养发酵

按照与上述步骤3.1相同的方法，对菌株cibts1758/phgfh/pages/pak进行培养发酵，并检测β-法尼烯的产量。经gc-ms确认，对照菌株不产β-法尼烯。

实验证明，菌株cibts2509c具有β-法尼烯生产能力，能够实现发酵液中β-法尼烯的高浓度积累，具有工业化应用前景。

序列表

<110>浙江医药股份有限公司

<120>用于生产法尼烯的大肠杆菌

<130>shpi1812281

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1725

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

atgagcaccctgccgatcagcagcgtgagcagcagcagcagcaccagcccgattgtggtt60

gacgataaagacagcaccaagccggatgttatccgtcacaccaccaacttcaacgcgagc120

atttggggcgaccagtttctgacctacgacgagccggaagatctggtgatgaagaaacaa180

ctggttgaggaactgaaagaggaagtgaagaaagagctgatcaccattaaaggtagcaac240

gaaccgatgcagcacgtgaagctgatcgagctgattgacgcggttcaacgtctgggcatc300

gcgtaccacttcgaggaagagatcgaagaggcgctgcagcacattcacgtgacctatggc360

gagcagtgggttgataaagaaaacctgcaaagcattagcctgtggttccgtctgctgcgt420

cagcaaggttttaacgtgagcagcggcgttttcaaggactttatggatgagaagggtaaa480

tttaaggaaagcctgtgcaacgacgcgcagggcatcctggcgctgtacgaagcggcgttc540

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ctgaagcaaccgctgcgtcgtcgtctggcgcgtatcgaagcgctgcactacatgccgatt720

tatcagcaagagaccagccacgacgaagtgctgctgaaactggcgaagctggatttcagc780

gttctgcagagcatgcacaagaaagagctgagccacatctgcaaatggtggaaggacctg840

gatctgcaaaacaaactgccgttcgtgcgtgaccgtgtggttgaaggctacttttggatt900

ctgagcatttactatgagccgcagcacgcgcgtacccgtatgtttctgatgaagagctgc960

atgtggctggttgtgctggacgataccttcgacaactacggtacctatgaagagctggag1020

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atgaagctgatctatcaggagctggtgaacctgcacgttgaaatggaagagagcctggag1140

aaagaaggcaaggcgtaccaaattcactatgttaaagagatggcgaaggaactggtgcgt1200

aactacctggttgaggcgcgttggctgaaagaaggttacatgccgaccctggaagagtat1260

atgagcgtgagcatggttaccggtacctacggcctgatgaccgcgcgtagctatgtgggt1320

cgtggcgacatcgttaacgaagataccttcaaatgggttagcagctatccgccgatcgtg1380

aaggcgagctgcgttatcattcgtctgatggacgatattgtgagccacaaagaagagcag1440

gagcgtggtcacgttgcgagcagcattgagtgctacagcaaggaaagcggcgcgagcgaa1500

gaggaagcgtgcgaatatatcagccgtaaagtggaagatgcgtggaaggttattaaccgt1560

gagagcctgcgtccgaccgcggtgccgttcccgctgctgatgccggcgatcaacctggcg1620

cgtatgtgcgaagtgctgtacagcgttaacgacggttttacccacgcggagggcgatatg1680

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

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<213>人工序列()

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aagcttgcggatccgccgccacccgagccaccgccacctttattacgctggatgatgta59

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<213>人工序列()

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acaggataccatgtttttttacctcctttatgcagaagcttgcggatccgccgccac57

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

cgatcaaatccgggtagctttcg23