本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物及其制备方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌。研究表明，幽门螺杆菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指肠溃疡的主要致病原因，并可能与胃癌和胃粘膜相关性淋巴样组织(malt)恶性淋巴瘤发病有关。世界卫生组织将hp归为i类致癌物，它在胃癌发展中起主导作用。目前流行的治疗hp感染的方案是同时服用质子泵抑制剂(ppi)加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)的三联疗法。影响三联疗法的最主要因素被认为是hp对抗菌剂的耐药性；另一严重问题是质子泵抑制剂会诱发消化不良，大量抗菌剂则导致消化道内菌群的严重毁灭。
综上所述，药物治疗幽门螺旋杆菌存在着耐药性以及损害肠道内的其他菌群的缺陷，亟待研发一种新型的抗幽门螺旋杆菌的产品。
技术实现要素：
本发明实施例的目的在于提供一种一种抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物及其制备方法，用以解决现有抗幽门螺旋杆菌产品容易产生抗药性以及具有毒副作用的缺陷。
为实现上述目的，本发明实施例提供一种抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物，所述组合物包括植物乳杆菌菌粉体以及所述植物乳杆菌代谢物粉体为活性成分。
优选的，所述植物乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：cctccno：m2018268。
优选的，所述组合物还包括菌粉载体，所述菌粉载体包括微晶纤维素、药用玉米淀粉、菊粉、硬脂酸镁；
其中，组合物包括以下质量份数的原料：植物乳杆菌菌粉体9-11份、植物乳杆菌代谢物粉体4-6份、微晶纤维素18-22份、药用玉米淀粉80-120份、菊粉8-12份、硬脂酸镁8-12份。
优选的，所述组合物包括以下质量份数的原料：植物乳杆菌菌粉体9.5-10.5份、植物乳杆菌代谢物粉体4.5-5.5份、微晶纤维素19-21份、药用玉米淀粉90-110份、菊粉9-11份、硬脂酸镁9-11份。
本发明实施例还提供一种制备上述所述的组合物的方法，将所述植物乳杆菌通过扩大菌种培养、一级种子培养、种子罐培养以及发酵培养获得植物乳杆菌发酵菌液；
将所述植物乳杆菌发酵菌液离心分别收集植物乳杆菌菌泥及离心后的发酵液，并将所述植物乳杆菌菌泥和离心后的发酵液冷冻干燥粉碎，获得植物乳杆菌菌粉体以及植物乳杆菌代谢物粉体；
将所述植物乳杆菌菌粉体以及植物乳杆菌代谢物粉体与菌粉载体混合，得到所述组合物。
优选的，所述植物乳杆菌菌粉体的制备方法具体为：
将所述植物乳杆菌菌泥、无菌水、脱脂奶粉、低聚果糖、甘油、麦芽糊精以及低聚异麦芽糖混合得到植物乳杆菌悬菌液，将所述悬菌液冷冻干燥粉碎获得植物乳杆菌菌粉体。
优选的，所述植物乳杆菌菌悬液的冷冻干燥条件为在-35℃--30℃的条件下预冻2-5小时，-50℃--40℃真空冷冻干燥，粉碎成100目的植物乳杆菌菌粉。
优选的，所述离心后的发酵液先经过低温浓缩至水分含量最多为20％的发酵液浓缩膏，将所述发酵液浓缩膏与药用玉米淀粉以5：1-4：1混合，得到混合物，然后在温度55℃-60℃，干燥时间40-50小时，粉碎得到含水量至多为3％的植物乳杆菌菌粉体。
本发明实施例的上述方法制备的组合物，在制备抗幽门螺旋杆菌的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明实施例具有如下优点：
本发明的实施例提供抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物，其可有效抑制幽门螺旋杆菌，直至清除人体内幽门螺杆菌，减少胃癌的发生，而且对人体无伤害。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实施例提供抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物，其可有效抑制幽门螺旋杆菌，直至清除人体内幽门螺杆菌，减少胃癌的发生。首先获得了一株新的菌株，该菌株分离自新鲜的苹果表皮中，经16sdna鉴定为植物乳杆菌，并对其进行了专利程序生物保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：cctccno：m2018268。该菌种的核苷酸序列如seqid1所示。
实施例1
一、扩大菌种培养
本发明实施例的菌种采用植物乳杆菌，生产中所使用的设备为：菌种培养箱、超净工作台、恒温培养箱、各种试管、三角瓶、种子罐、发酵罐、真空冷冻干燥机、三维搅拌机、低温粉碎机、真空包装机。
菌种培养：-80℃保存菌种的扩大培养，扩大菌种培养基的配制：葡萄糖20克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、乙酸钠3克、吐温801ml、尿素0.5克、自来水1000毫升、ph值自然。将以上配方中的葡萄糖等原料加入到配方中的1000毫升水中，搅拌30min使之溶化，然后分装于18*180的试管中，每只试管装10毫升，胶塞牛皮纸封口，放医用消毒器中0.1-0.12兆帕灭菌25min，培养基灭菌完毕。
在无菌条件下，在超净工作台中打开-80℃保存的冷冻管，室温融化后，然后再取以上灭好菌的试管培养基1支，将溶化好的-80℃保存菌液取1毫升加入试管中，用胶塞、牛皮纸封好管口，用手轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养15小时即可，获得扩大菌种培养菌液。
二、一级种子培养
一级种子培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨10克、牛肉浸粉10克、玉米浆2克、乙酸钠3克、吐温801ml、自来水1000毫升、ph值自然。
将上述原料加入到配方中的自来水中，开动搅拌机，搅拌20min，使全部溶化，此称为一级种子培养液。将搅拌溶化好的一级种子培养液按用量加入到三角瓶中，然后用6层纱布外加一层牛皮纸扎好瓶口，放入医用消毒器中灭菌，灭菌前，首先打开消毒器上的排气阀门，等有少量蒸汽排出时关闭，当消毒器上的压力达到0.05兆帕时，打开消毒器上的排气阀门排气6-8min，然后关闭排气阀门，继续加温，当消毒器中的蒸汽压力达到0.1-0.12兆帕时开始计时，灭菌时间为25min，完毕后离开热源，让其自然降温，当消毒器上的压力表归零时，打开消毒器，取出灭好菌的一级种子培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种培养菌液移接到三角瓶灭好菌的一级种子培养液中，接种量分别是1％，即一级种子培养液100毫升，接入扩大菌液为1毫升，完毕后用原有纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养15小时即可，获得一级种子培养菌液。
三、种子罐培养
对发酵设备、管道及无菌过滤系统的灭菌，首先，打开各进出管道及无菌空气管道的阀门，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有少量蒸汽排出，通气40min，让管道内的蒸汽压力保持0.12-0.14兆帕，保持40min，然后关闭各进出管道阀门，备用。
种子罐及发酵罐的空罐灭菌，关闭各个阀门，打开罐底部的排污阀及罐夹层的排污阀，打开直接蒸汽阀门向罐内通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，当罐内达到121℃时开始计时，灭菌时间为40min，然后关闭罐底部排污阀及夹层排污阀，罐中温度自然降至37℃备用。
种子罐培养基配方(培养基各组分的重量百分比)葡萄糖7％、蛋白胨2％、尿素0.5％、磷酸氢二钾0.5％、玉米浆1.5％、乙酸钠0.5％、吐温800.4％、聚葡萄糖2％、聚醚消泡剂0.1％、自来水85.5％、ph值自然。
首先，将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料，然后在不停的搅拌中通入蒸汽加温，首先利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持30min即可达到灭菌的效果；然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度达到37℃时备用，此称为种子罐培养基。然后，将以上培养好的一级种子培养液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量分别是罐内培养基的1％，即可100㎏种子罐培养基分别接入一级菌种液1㎏即可。然后盖好罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，ph值自然，搅拌转速80转/min，罐压0.05兆帕，培养时间24小时即可达到要求，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，此称为种子罐培养菌种。
四、发酵培养
发酵培养基基各组分的重量百分比：葡萄糖12％，蛋白胨1％、聚葡萄糖3％、低聚异麦芽糖12％、乙酸钠2％、吐温800.2％、马铃薯淀粉5％、共轭亚油酸0.5％、无水氯化钙0.3％、硫酸镁0.5％，玉米浆3％，聚醚消泡剂0.1％，自来水60.4％，共100㎏。
首先，将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料，然后通入蒸汽加热，首先，利用夹层蒸汽加热到95℃，然后再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时开始计时，保持30min即可达到灭菌效果，然后通过夹层的自来水冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前首先提高种子罐的罐压力达到0.1兆帕，发酵罐的罐压保持0.05兆帕，然后打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门。
接种量是每100㎏发酵罐中的培养基接入发酵罐培养的菌种3㎏，培养条件为发酵温度37℃，搅拌转速120转/min，发酵时间20小时即可，罐压保持0.05兆帕，ph值自然，如果罐压降低可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的排气阀调整，获得发酵菌液。
五、植物乳杆菌的冷冻干燥
发酵液离心，收集湿菌泥，发酵完毕后将发酵液抽入到贮罐中，为了保证发酵液中菌体的完整性，选择离心转速非常重要。开动管式离心机，调整转速12000转/min，以每分钟进料15㎏的进料速度进行离心，离心完毕后收集湿菌泥，将离心收集的湿菌泥进行冷冻干燥，离心后的发酵液可进行低温真空浓缩加入载体，真空干燥后复配成品用。
1、悬菌液的制备：取湿菌泥1000克，加入无菌蒸馏水3000毫升，脱脂奶粉300克，低聚果糖200克，98％的甘油100ml，麦芽糊精50克，低聚异麦芽糖300克。具体操作时，首先取配方中的水1500毫升加热至50℃-55℃，在搅拌下加入麦芽糊精，溶化后再加入配方中余下的水，然后再加入配方中其它的原料。充分搅拌30min(25℃-35℃的条件下搅拌)。即成为悬菌液，然后将该悬菌液放入30℃的恒温室或箱中恒温30min进行预冻。冷冻干燥前的预冻，将恒温30min的悬菌液分装于冻干盘中，然后放入冷冻干燥机的预冻室内在零下30℃-35℃的条件下预冻3小时，冻结后进行抽真空干燥。
真空干燥，将预冻好的料盘放入真空干燥室开始抽真空干燥，干燥条件为:真空度为2-5帕，温度-45℃，干燥室温度28℃，干燥时间45小时。冻干完毕后收集冻干料用无菌粉碎机粉碎成细度为100目的菌粉密封包装备用，获得植物乳杆菌菌粉体。
2、离心发酵液的低温浓缩：浓缩条件，真空度0.06兆帕，温度55℃-65℃，浓缩至膏状，固形物含量80％，水分含量20％为止，然后加入药用玉米淀粉为载体，混匀后进行真空干燥。取发酵液浓缩膏1000克，加入药用玉米淀粉200克混匀放真空干燥箱中干燥，干燥条件为：真空度0.06兆帕，温度55℃-60℃，干燥时间45小时，水分含量3％为合格，然后将其粉碎至100目的粉，密封包装备用，获得植物乳杆菌菌粉体。其中，发酵液浓缩膏与药用玉米淀粉混合的质量分数比5：1-4：1。
本发明实施例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体5克、植物乳杆菌代谢物粉体3克、微晶纤维素10克、药用玉米淀粉20克，菊粉5克、硬脂酸镁5克，其中，微晶纤维素、药用玉米淀粉，菊粉、硬脂酸镁为菌粉载体。
将以上各物料放入固体搅拌混合机中混合均匀，然后在无菌条件下分装入胶囊中，装瓶或压片即为成品。
实施例2
本发明实施例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体9克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素22克、药用玉米淀粉120克，菊粉12克、硬脂酸镁12克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例3
本发明实施例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体9克、植物乳杆菌代谢物粉体4克、微晶纤维素22克、药用玉米淀粉120克，菊粉8克、硬脂酸镁8克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例4
本发明实施例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体11克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素18克、药用玉米淀粉80克，菊粉8克、硬脂酸镁8克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例5
本发明实施例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体11克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素18克、药用玉米淀粉80克，菊粉12克、硬脂酸镁12克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
对比例1
本对比例抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物与实施例3的区别在于，不含有干酪乳杆菌菌粉体、干酪乳杆菌发酵代谢物粉体。
试验例本发明的植物乳杆菌菌粉体对幽门螺杆菌菌株的拮抗能力
哥伦比亚培养基(oxiod，uk)倾注平板，每平板15ml，平板为标准平板9mm，把h.pylori43504、h.pylori11637和h.pylori26695涂布到平板上(浓度为1×108cfu/平板)，立即放入9个牛津杯中，并向牛津杯中分别加入加入100μl，本发明实施例2、3、4的植物乳杆菌菌粉体的悬液，在微需氧条件下固定1.5h后，放入三气培养箱培养48-72h，测量抑菌环大小。以mrs，无植物乳杆菌的培养基作为阴性对照，实验重复3次，本发明实施例的植物乳杆菌菌粉体抑制幽门螺杆菌的试验结果列于表1中。
表1
zoi是抑菌圈直径大小；sem是标准偏差；
表1的试验结果表明本发明实施例的植物乳杆菌对这几株幽门螺杆菌菌均有抑制作用，但由于菌株的特异性，本发明实施例的植物乳杆菌的抑菌能力还有有所差别。
测试例
1临床试验
1.1一般资料
选择2016年7月-2018年8月接受本试验药物组合物且具有睡眠障碍、抑郁、焦虑症状的病例共有900人，其中，治疗1组：中老年男性200人，年龄30-80岁，平均年龄56岁；治疗2组：中老年女性200人，年龄28-78岁，平均年龄52岁；治疗3组：青少年男性150人，年龄15-19岁，平均年龄17岁；治疗4组：青少年女性150人，年龄14-18岁，平均年龄16；对照组200人，平均年龄30岁，作为研究对象。每组患者在性别、年龄、病情类型等基本资料比较，差异均无统计学意义(p＞0.05)，具有可比性。
1.2评价标准
治愈：临床症状在治疗后基本改善或者全部消失；
有效：临床症状在治疗后得到改善；
无效：症状未明显减轻或加重。
5.3治疗方法
治疗1-4组：分别将实施例2至5的抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物供患者服用，每天1次，每次服用1剂/10g，每克植物乳杆菌含活植物乳杆菌50亿/cfu。
对照组：将对比例1的组合物供患者服用，每天1次，每次服用1剂/10g。
5.4结果
经过20天治疗，四组的临床治疗效果对比结果见表1
表1
说明：男性200人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的82人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有172人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有183人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有188人经检测幽门螺杆菌减少78％，4人完全清除幽门螺杆菌，共有8人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
女性：200人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的102人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有169人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有182人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有189人经检测幽门螺杆菌减少76％以上，2人完全清除幽门螺杆菌，共有9人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
青少年男性：150人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的62人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有116人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有136人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有140人经检测幽门螺杆菌减少80％以上，4完全清除幽门螺杆菌，人共有6人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
青少年女性：150人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的68人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有108人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有136人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有143人经检测幽门螺杆菌减少75％以上，3人完全清除幽门螺杆菌，共有4人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
对照组：200人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的2人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有2人经检测幽门螺杆菌减少30％。服用15天有3人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有3人经检测幽门螺杆菌减少75％以上，共有197人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>山东环亿生物科技有限公司
<120>一种抗幽门螺旋杆菌的益生菌组合物及其制备方法
<130>gg18158550a
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1439
<212>dna
<213>lactobacillusplantarum
<400>1
aggcggctggttcctaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgt60
gacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgatta120
ctagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctt180
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