一种甲烷菌及其应用的制作方法

本发明涉及甲烷菌，具体涉及一种甲烷菌及其应用。

背景技术：

食物中含有丰富的胆碱、肉碱、甜菜碱以及卵磷脂，这些物质在动物或人体的消化道内被微生物快速地降解生成三甲胺，三甲胺通过血液循环到达肝脏。正常人和动物会在肝脏中将三甲胺转化成氧化三甲胺，但近年来的研究发现，氧化三甲胺会提高患心血管疾病的风险。不能代谢三甲胺的人会患有三甲胺尿症，并散发一种鱼腥味，目前还没有特效的治疗方法。胆碱是一种重要的饲料添加剂，通常应用在猪、奶牛、羊等动物的饲料中，以提高动物的生产性能，提高动物的饲料能量利用率，降低脂肪肝的患病风险，缓解热应激等症状。但补充胆碱会提高血液、尿液、骨骼肌以及乳中氧化三甲胺的含量，对肉奶品质和人的健康造成了危害。

技术实现要素：

发明目的：本发明第一方面提供了一种甲烷菌，第二方面提供了所述甲烷菌在发酵生产甲烷、或制备益生菌剂或饲料添加剂的应用。

技术方案：本发明第一方面提供一种甲烷菌，其分类命名为甲烷菌(methanomassiliicoccussp.)，菌株号为lgm-rcc1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年10月24日，保藏编号为cgmccno.16819，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。菌株lgm-rcc1由发明人在南京于2016年11月从山羊新鲜瘤胃液中筛选得到。

菌株lgm-rcc1属于甲烷菌新建立的第七个目methanomassiliicoccales，由于这个目是新建立的目，系统分类命名系统尚未建立完全，目前仅设立了一个科methanomassiliicoccaceae和一个属methanomassiliicoccus。这个甲烷菌目里已经发表的纯菌株只有一株methanomassiliicoccusluminyensis(nr118098)，菌株lgm-rcc1的16srrna基因序列见seqidno:1所示，在ncbi比对结果显示与m.luminyensis相似性仅为87％，推测菌株lgm-rcc1属于一个新的甲烷菌属或者科。

本发明第二方面提供所述甲烷菌在发酵生产甲烷中的应用；优选地，所述甲烷菌还原甲醇、一甲胺、二甲胺、三甲胺或3-甲硫基丙酸甲脂生产甲烷。优选甲烷菌的发酵温度为30-45℃，发酵ph为6.5-8.0。

本发明第三方面提供所述甲烷菌在制备益生菌剂或饲料添加剂中的应用。

有益效果：(1)lgm-rcc1可以利用氢气还原甲醇、一甲胺、二甲胺、三甲胺和3-甲硫基丙酸甲脂生成甲烷，可作为提高沼气池中甲烷产量的添加剂；(2)lgm-rcc1来源于动物消化道，能够高效地将三甲胺转化成甲烷，缓解吸收进入血液中三甲胺的量，降低其对人体或动物的毒性，lgm-rcc1是一种潜在的治疗这种疾病和预防由氧化三甲胺导致的心血管疾病的益生菌。

附图说明

图1为lgm-rcc1利用不同甲基化合物产甲烷时间曲线图；

图2为不同ph下lgm-rcc1生长曲线；

图3为不同温度条件下lgm-rcc1生长曲线；

图4为不同蛋白胨浓度条件下lgm-rcc1甲烷生成曲线；

图5为不同蛋白胨浓度条件下lgm-rcc1氢气利用曲线；

图6为不同酵母膏浓度条件下lgm-rcc1甲烷生成曲线；

图7为不同酵母膏浓度条件下lgm-rcc1氢气利用曲线；

图8为不同瘤胃液浓度条件下lgm-rcc1甲烷生成曲线；

图9为不同瘤胃液浓度条件下lgm-rcc1氢气利用曲线。

具体实施方式

实施例1筛选菌株lgm-rcc1

1、材料与方法

1.1接种物

山羊新鲜瘤胃液。

1.2培养基成分及其配制

1.2.1培养基成分

甲烷菌brn培养基，成分如表1。本发明的试验均采用brn培养基进行。

表1甲烷菌brn培养基成分(1l配方)

注：上述溶液溶剂均为水。

1.2.2无细胞瘤胃液

新鲜山羊瘤胃液通过瘤胃瘘管，采用负压装置采集，然后经两层纱布过滤后，液体于12000rpm，4℃离心20min后取上清，-20℃保存备用。

1.2.3挥发性脂肪酸溶液

准确量取乙酸，6.85ml；丙酸，3.0ml；丁酸，1.84ml；2-甲基丁酸，0.55ml；异丁酸，0.47ml；戊酸，0.55ml；异戊酸，0.55ml溶于700ml0.2mol/l的naoh水溶液中，用1mol/l的naoh水溶液调ph至7.5，最后定容至1000ml。

1.2.4微量元素溶液(1l)

氮川三醋酸，1.5g；coso4.7h2o，0.18g；cacl2.2h2o，0.1g；znso4.7h2o，0.18g；nacl，1.0g；feso4.7h2o，0.1g；mgso4.7h2o，3.0g；mnso4.h2o，0.45g；namoo4.2h2o，0.01g；niso4.6h2o，0.1g；naseo4，0.19g；nawo2.2h2o，0.1g；cuso4.5h2o，0.01g；alk(so4)2.12h2o，0.018g；h3bo3，0.01g；溶剂为水。

1.2.5维生素溶液

准确量取1,4-naphthoquinone(1,4-萘醌)0.25g溶于20ml无水乙醇，温和加热2-3h；准确量取d-ca-pantothenate(泛酸)0.2g；nicotinamide(烟酰胺)0.2g；p-aminobenzoniacid(对氨基苯甲酸)0.025g；riboflavin(核黄素)0.2g；thiamine-hcl(盐酸硫胺素)0.2g；pyridoxine-hcl(盐酸吡哆醇)0.2g；biotin(生物素)0.025g；folicacid(叶酸)0.25g；cyanocobalamin(氰钴胺)0.025g溶于900ml5mmol/lhepes缓冲液，温和加热2-3h；将两种溶液混匀，定容至1000ml，过滤除菌，4℃保存备用。

1.2.6底物

三甲胺的终浓度为20mmol/l。所有培养基在使用前需添加维生素溶液(每10ml培养基加入100μl)，青霉素(终浓度为1600单位/ml)，硫酸链霉素(终浓度为2000单位/ml)。

1.2.7培养基的制备

按照上述培养基成分表准确量取各成分装入宽底细颈瓶中，用煮沸后的热水定容。加入指示剂刃天青，于微波炉中加热沸腾，直至液体由蓝色变为红色。迅速取出，立即通入co2，用锡箔纸密封瓶口。当培养基基本澄清后，加入l-半胱氨酸盐酸盐，于30min后分装。使用分装仪分装时，发酵瓶或发酵管应先提前通入co2排除空气。分装结束后，将瓶口密封，并放入高压灭菌锅灭菌，冷却后备用。

1.3分离纯化方法

通过瘤胃瘘管，采用负压装置，吸取新鲜山羊瘤胃液，取0.5ml接入已预热至39℃，并含有青、链霉素，维生素溶液，三甲胺溶液的10mlbrn培养基的发酵管中。发酵管再通入100kpa的氢气，39℃培养7天后，测定甲烷，选取生长较好的三个重复进行传代。每7天传一代，传至20代。pcr检测目的甲烷菌，对检测阳性的培养物进一步进行纯化步骤。

将培养液用稀释液梯度稀释到10^-7。取0.5ml稀释后的培养液接入已于水浴保温的装有已融化的固体培养基(brn培养基添加2％琼脂)的滚管中，每个梯度3个重复。迅速摇匀后，于冰上快速滚管，立即通入氢气，39℃培养。这一过程中添加甲烷短杆菌抑制剂：二羟基蝶呤，0.5％(5g/l)溶液，每10ml培养基添0.5ml；抗生素：青霉素(240mg/ml)，硫酸链霉素(400mg/ml)，林可霉素(100mg/ml)，黏菌素(100mg/ml)，万古霉素(50mg/ml)。抗生素在传代过程中，交替使用，每10ml培养基添加0.1ml。

最后采用高倍梯度稀释法进一步纯化。取1ml富集培养物于装有9mlbrn培养基的厌氧发酵管中，再从中取出1ml菌液于另一装有9mlbrn培养基的厌氧发酵管中，依次进行10倍梯度稀释至10^-10,每个梯度5个重复。39℃培养30天，轻柔震荡(40rpm)，测定甲烷产量，选取生长较好、稀释倍数最高者进行传代，得到菌株lgm-rcc1。

实施例2lgm-rcc1利用不同底物生产甲烷

brn培养基的组分和配制方法同实施例1，不同的是发酵培养基的底物分别为甲醇(meoh，0.06mol/l)，一甲胺(mma，0.06mol/l)，二甲胺(dma，0.03mol/l)，三甲胺(tma，0.02mol/l)或3-甲硫基丙酸甲脂(m3pt，0.06mol/l)。菌株lgm-rcc1接种物制备培养基采用brn培养基，底物为五种甲基化合物的混合物(每种底物均为0.01mol/l)，39℃培养20天接种。之后菌种接入已预热至39℃，并含有青链霉素、维生素溶液、底物溶液的10mlbrn培养基的发酵管中，发酵管再通入100kpa的氢气，39℃培养并测定甲烷产量，结果见图1。

如图1所示，lgm-rcc1可以利用氢气还原甲醇、一甲胺、二甲胺、三甲胺和3-甲硫基丙酸甲脂生成甲烷。

实施例3ph对lgm-rcc1产甲烷的影响

brn培养基的组分和配制方法、接种物制备方法(培养基ph6.9-7.0)，发酵同实施例2，不同的是底物仅为三甲胺，浓度为0.02mol/l。发酵阶段培养基的ph分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，底物为三甲胺，将菌种接入已预热至39℃，并含有青链霉素、维生素溶液、三甲胺(0.02mol/l)溶液的10mlbrn培养基的发酵管中，发酵管再通入100kpa的氢气，39℃培养并测定甲烷产量，结果见图2，lgm-rcc1可在ph6.5-8.0之间生长。

实施例4温度对lgm-rcc1产甲烷的影响

brn培养基的组分和配制方法，接种物制备(培养温度39℃)，发酵同实施例2，不同的是发酵阶段培养温度分别设定为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，底物为三甲胺，浓度为0.02mol/l，甲烷产量见图3，lgm-rcc1可在30-45℃条件下生长。

实施例5蛋白胨浓度对lgm-rcc1产甲烷的影响

brn培养基的组分和配制方法，接种物制备(蛋白胨浓度2g/l)，发酵同实施例2，不同的是发酵阶段培养基中蛋白胨浓度分别为0g/l、1g/l、2g/l、3g/l，底物为三甲胺，浓度为0.02mol/l，甲烷产量和氢气利用情况见图4和图5，lgm-rcc1的生长对蛋白胨没有依赖。

实施例6酵母膏浓度对lgm-rcc1产甲烷的影响

brn培养基的组分和配制方法，接种物制备(酵母膏浓度2g/l)，发酵同实施例2，不同的是发酵阶段培养基中酵母膏浓度分别为0g/l、1g/l、2g/l、3g/l，底物为三甲胺，浓度为0.02mol/l，甲烷产量和氢气利用情况见图6和图7，llgm-rcc1的生长对酵母膏的浓度有依赖性。高浓度的酵母膏条件下，菌株生长速度快，并能将氢气完全消耗。

实施例7瘤胃液浓度对lgm-rcc1产甲烷的影响

brn培养基的组分和配制方法，接种物制备(瘤胃液浓度20％)，发酵同实施例2，不同的是发酵阶段培养基中瘤胃液的体积浓度分别为10％、15％、20％和25％，底物为三甲胺，浓度为0.02mol/l，甲烷产量和氢气利用情况见图8和图9，可知瘤胃液能够提高lgm-rcc1的生长速率。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种甲烷菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1256

<212>dna

<213>methanomassiliicoccussp.

<400>1

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