发酵乳杆菌CQPC06及其在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌，还涉及该乳酸菌在制备食品或药品中的应用。

背景技术：

四川泡菜的生产过程是将新鲜的泡菜洗净，密封于坛内，在盐水中厌氧发酵浸泡的泡菜。泡菜水中含有丰富的天然乳酸菌，对泡菜风味和品质的形成起着关键作用。其使用可溶性成分(主要是糖和含氮物质)进行增殖，产生酸性物质并代谢出风味成分，使泡菜产生独特的酸脆口味。泡菜水中含有的乳酸菌主要包括发酵乳杆菌、l.短杆菌、干酪乳杆菌、发酵酵母菌、嗜酸乳杆菌等。乳酸菌种类的差异可能是由于地域、气候和生产工艺习惯等因素造成的。某些乳酸菌也被用作益生菌，对人体健康有多种益处，包括维持肠道菌群的微生态平衡、加强机体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生、降低胆固醇、延缓机体衰老等。为了更好的利用这些微生物资源，应开展更广泛的分离和鉴定工作，积累丰富的菌种资源，开发出丰富的工业用益生菌种类。

溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病，主要表现为腹痛、腹泻和血便，其发病机制至今尚未完全阐明。研究发现，溃疡性结肠炎患者肠黏膜上皮细胞调亡增加、肠上皮细胞间紧密连接缺损、肠上皮黏液层变薄或缺失、肠道菌群失调或易位、固有层肠黏膜免疫系统异常激活，从而导致肠道上皮黏膜通透性增加、屏障功能受损。

技术实现要素：

本发明的目的在于对泡菜水中的乳酸菌进行分离鉴定，并考察其对溃疡性结肠炎的作用效果，以丰富乳酸菌菌种资源、开发功能保健制品。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)cqpc06，保藏编号为cgmccno.14955。

2.发酵乳杆菌cqpc06在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用。

优选的，所述食品为发酵食品。

优选的，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。

本发明对泡菜水中的乳酸菌进行了分离鉴定，将其中一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)命名为cqpc06，于2017年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.14955。

本发明的发酵乳杆菌cqpc06具有较强的抗胃酸能力，经ph3.0人工胃液处理3h后的存活率达到68.61％；在0.30％胆盐中该菌也能缓慢生长，生长效率达到无胆盐培养的23.49％。

葡聚糖硫酸钠(dss)诱导溃疡性结肠炎小鼠模型实验结果显示，发酵乳杆菌cqpc06能够抑制结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变大；能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤；能够降低结肠炎小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α的水平，降低结肠炎小鼠体内的mpo和no含量，上调结肠组织中nnos、enos、iκb-α的mrna表达，同时下调结肠组织中inos、nf-κb、cxcr1和cxcr2的mrna表达；随着发酵乳杆菌cqpc06的剂量增加，上述作用也加强，且同剂量下发酵乳杆菌cqpc06的作用强于保加利亚乳杆菌。由此可见，发酵乳杆菌cqpc06可以有效地改善溃疡性结肠炎。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种发酵乳杆菌cqpc06，消化道抗性较强，而且可以有效地改善溃疡性结肠炎，不仅丰富了乳酸菌菌种资源，而且扩大了发酵乳杆菌cqpc06的应用范围，有助于功能保健制品的开发，也给溃疡性结肠炎的改善带来了新的希望。

附图说明

图1为发酵乳杆菌cqpc06的菌落形态。

图2为发酵乳杆菌cqpc06的革兰氏染色结果。

图3为发酵乳杆菌cqpc06的16srdnapcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准，0为阴性对照，1为发酵乳杆菌cqpc06。

图4为小鼠结肠组织形态学观察。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、发酵乳杆菌cqpc06的分离与鉴定

1、实验材料

采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40ml泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。

2、乳酸菌的分离纯化

分别取1ml泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，然后分别取10^-4、10^-5、10^-63个梯度的稀释液100μl进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

编号为cqpc06的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。

3、乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5mlmrs液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1ml于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。

编号为cqpc06的菌株革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。

4、乳酸菌dna提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于mrs肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组dna提取试剂盒进行dna提取。提取的dna放于-20℃冰柜保藏备用。

5、基因组dnapcr扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的dna，pcr扩增16srdna，其中上游引物27f(5'－agagtttgatcctggctcag－3'，seqidno.1)1μl、下游引物1495r(5'－ctacggctaccttgttacga－3'，seqidno.2)1μl，2×taqplusbuffer12.5μl、模板dna1μl，用无菌ddh2o将体系补足至25μl。以无菌超纯水替代模板dna作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃延伸5min。然后取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110v，45min。

编号为cqpc06的菌株16srdna扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，阴性对照组的泳道无条带，表明pcr扩增过程中未受到污染；编号为cqpc06的菌株的泳道有一条长度约为1500bp的条带，符合预期扩增片段的长度。

将编号为cqpc06的菌株的16srdna扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，测得序列如seqidno.3所示。使用ncbi中的blast(basiclocalalignmentsearchtool)程序对测得序列进行同源性比对分析，结果显示，编号为cqpc06的菌株为乳酸菌中的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)，其与genebank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％。

6、乳酸菌体外抗性筛选

(1)耐受0.3％胆盐的能力

在mrs-thio培养基(含0.2％巯基乙酸钠的mrs肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min；将活化好的5ml菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的mrs-thio培养基和含0.3％胆盐的mrs-thio培养基中，以空白培养基(未接菌的mrs-thio培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的od600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力：

结果显示，编号为cqpc06的菌株在0.3％胆盐中能够缓慢生长，生长效率达到无胆盐培养的23.49±2.43％。

(2)人工胃液耐受性试验

人工胃液的配制：由0.2％nacl和0.35％胃蛋白酶组成，用1mol/lhcl调节ph为3.0，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。

在超净工作台中吸取5ml培养好的含菌培养基于10ml无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入5ml无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1ml菌悬液与9mlph3.0的人工胃液混匀，取1ml混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9ml混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在mrs固体培养基上37℃培养48h，按公式(2)计算存活率(％)。

结果显示，编号为cqpc06的菌株具有较好的抗胃酸能力，经ph3.0人工胃液处理3h后的存活率达到68.61±2.20％。

二、发酵乳杆菌cqpc06对溃疡性结肠炎的改善作用

1、实验动物

spf级6周龄雄性昆明小鼠50只，购于重庆医科大学实验动物中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。

2、实验方法

50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、cqpc06高剂量组、cqpc06低剂量组和保加利亚乳杆菌组。整个实验周期为5周，正常组和模型组每天灌胃生理盐水；cqpc06高、低剂量组每天灌胃发酵乳杆菌cqpc06菌悬液，高剂量组浓度为1.0×10⁹cfu/ml，低剂量组浓度为1.0×10⁸cfu/ml；保加利亚乳杆菌组每天灌胃保加利亚乳杆菌，菌浓度为1.0×10⁹cfu/ml；每组小鼠灌胃体积均为0.1ml/10g.bw；第3周对实验小鼠进行结肠炎造模，造模方法如下：各组小鼠除正常灌胃外，正常组小鼠每天自由饮用无菌蒸馏水，模型组、cqpc06高、低剂量组和保加利亚乳杆菌组小鼠每天自由饮用5％dss溶液，造模期间每隔2天换用新鲜的无菌水和5％dss溶液，总共造模7天。整个实验结束后，所有小鼠禁食不禁水24h，通过摘眼球取血收集全血，4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清，分装后于-80℃超低温冰箱保藏备用；然后脱颈处死小鼠，解剖取出结肠，称量重量，测量长度；取0.5cm左右的结肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行he染色；其余结肠经液氮冷冻后置-80℃超低温冰箱中保藏备用。

3、小鼠结肠长度测量和结肠重量/结肠长度比值计算

dss诱导小鼠结肠炎会导致结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变小，所以结肠长度和结肠重量/结肠长度比值是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标之一。

各组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度比值见表1，正常组小鼠的结肠长度最长、结肠重量/结肠长度比值最小；模型组小鼠的结肠长度最小、结肠重量/结肠长度比值最大，和正常组存在显著差异(p<0.05)，说明结肠炎造模成功；与模型组相比，cqpc06低剂量组、高剂量组和保加利亚乳杆菌组小鼠的结肠长度均显著增加(p<0.05)、结肠重量/结肠长度比值均减小，且高剂量cqpc06效果更优，同剂量下发酵乳杆菌cqpc06的效果优于保加利亚乳杆菌。以上结果说明，发酵乳杆菌cqpc06能够抑制结肠缩短和结肠重量/结肠长度比值变大。

表1各组小鼠结肠长度和结肠重量/结肠长度比值

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

4、小鼠结肠组织切片观察

取he染色的小鼠结肠组织切片，在光学显微镜下观察组织形态变化。结果如图4所示，正常组小鼠结肠粘膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐有序，且无溃疡存在；与正常组相比，模型组小鼠结肠粘膜糜烂严重，隐窝几乎全部被破坏，杯状细胞急剧减少，固有层细胞浸润严重，腺体排列紊乱，而且可见严重溃疡灶；cqpc06低剂量组小鼠结肠粘膜存在糜烂现象，杯状细胞有所减少，可见少量溃疡灶，但损伤程度明显轻于模型组；cqpc06高剂量组和保加利亚乳杆菌组小鼠结肠粘膜未出现明显糜烂，而且隐窝完整，腺体排列整齐，杯状细胞完整，与正常组结肠组织形态接近。以上实验结果表明，发酵乳杆菌cqpc06能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤。

5、小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α水平测定

作为最强的中性粒细胞趋化因子，il-8参与溃疡性结肠炎的发生和活动，在溃疡性结肠炎的发生中起重要作用。mip-1α是一种炎症介质，主要在单核细胞和巨噬细胞中发挥趋化功能，在炎症区域发挥局部作用。细胞因子在免疫和局部炎症反应中起重要作用，促炎因子il-1和tnf-α可介导溃疡性结肠炎的发生。il-1和tnf-α诱导的肠炎性炎症反应主要是由il-8等趋化因子引起，il-8可导致溃疡性结肠炎患者结肠黏膜和外周血中的炎症程度显著升高。

按照常规生化试剂盒说明书测定小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α的水平。结果见表2，正常组小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α的水平与其它组相比最低；模型组则呈现出相反的趋势，小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α的水平与其它组相比最高；发酵乳杆菌cqpc06和保加利亚乳杆菌均能够降低结肠炎小鼠血清中il-8、il-1、tnf-α和mip-1α的水平，且高剂量cqpc06的效果更优，同剂量下cqpc06的作用也强于保加利亚乳杆菌。

表2小鼠血清中的il-8、il-1、tnf-α和mip-1α水平

注：标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

6、小鼠结肠组织中mpo和no含量的测定

已有研究表明氧自由基在结肠炎发病过程中具有重要作用。机体正常情况下，氧自由基的生成和清除处于平衡状态，当炎症发生时，机体局部缺氧导致氧自由基大量生成，从而导致细胞凋亡或者损伤。结肠炎发生后，中性粒细胞聚集在炎症组织中开始下降，更多中性粒细胞流入组织，mpo活性急剧增加。结肠炎导致结肠中产生大量自由基，包括ros和rns。这些自由基是有毒的，损害结肠组织。随着自由基的增加，结肠炎的炎症也增加。no在结肠炎过程中是关键性因素。no的合成增加了结肠炎的肠粘膜损伤，这影响了引起免疫反应和细胞毒性功能的物质的合成和分泌。no参与结肠炎的炎症和组织损伤过程。随着炎症的发展，大量的no会通过产生自由基而损伤组织，但是它也会激活机体的免疫防御系统。

按照常规生化试剂盒说明书测定小鼠结肠组织中mpo和no的含量。结果见表3，模型组小鼠结肠组织中的mpo含量和no含量与其它组相比均最高，正常组则与其完全相反；与模型组相比，cqpc06高、低剂量组和保加利亚乳杆菌组小鼠结肠组织中的mpo含量和no含量均显著降低(p<0.05)，且高剂量cqpc06的效果更优，同剂量下cqpc06的作用强于保加利亚乳杆菌。以上结果说明，发酵乳杆菌cqpc06能够降低结肠炎小鼠体内mpo和no的含量，从而减少氧自由基对结肠炎小鼠造成的氧化损伤。

表3小鼠结肠组织中mpo和no的含量

注：标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

7、小鼠结肠组织中nnos、enos、inos、nf-κb、iκb-α、cxcr1和cxcr2的mrna表达水平检测

按照trizol(invitrogen公司)说明书提取结肠总rna，用超微量分光光度计测定总rna的纯度和浓度，将每个样本的rna浓度调整到同一水平(1μg/μl)。然后取1μg/μl的rna样品1μl，加入(oligo)primerdt1μl和无菌超纯水10μl，混合，65℃反应5min，再加入ribolockrnaseinhibitor1μl、100mmdntpmix2μl、5×reactionbuffer4μl和revertaidm-mu/vrt1μl，混匀，在42℃、60min和70℃、5min条件下合成cdna。接着对目标基因进行反转录和扩增(所用引物序列见表4)。反应条件为：95℃变性15min，60℃退火1h，95℃延伸15min，总共40个循环。以gapdh作为持家基因，通过2^-δδct计算目标基因的相对表达量。

表4引物序列

控制nos可以调控no的产生，从而维持结肠组织的正常状态。enos对结肠炎引起的结肠损伤有重要的控制作用；inos可转化大量的no，过量的no对结肠组织的损伤有提升作用；nnos可以控制组织中的no浓度并保护组织免受过量no的影响，也可以控制inos过表达和抑制炎症。

小鼠结肠组织中nnos、enos和inos的mrna表达水平见表5，模型组小鼠结肠组织中的nnos、enos表达与其它组相比最弱，inos的表达最强；灌胃发酵乳杆菌cqpc06可加强结肠组织中nnos、enos的表达，同时减轻inos的表达，且随着cqpc06的剂量增加，作用加强。

表5小鼠结肠组织中nnos、enos和inos的mrna表达水平

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

nf-κb是一种多功能转录因子，通过调节多种转录因子在炎症反应中发挥作用。许多炎症介导基因的启动因子和增强因子具有一个或多个κb序列，如tnf-α、il-1和il-8。活化的nf-κb参与了它们基因的表达，导致许多细胞因子的表达增加，参与免疫反应和炎症的调节。iκb-α是nf-κb信号通路的重要成员，主要调控nf-κb的激活和转录，当脂质多糖、病毒蛋白、氧自由基和细胞因子等多种刺激因子刺激细胞时，级联信号迅速激活iκb激酶。然后，磷酸化的iκb-α从nf-κb中降解并分离，抑制nf-κb的活化。

小鼠结肠组织中nf-κb和iκb-α的mrna表达水平见表6，与其它组相比，模型组小鼠结肠组织中nf-κb表达最强，而iκb-α表达最弱，灌胃发酵乳杆菌cqpc06可下调结肠组织中nf-κb的表达同时上调iκb-α的表达，且随着cqpc06的剂量增加，这些作用加强。

表6小鼠结肠组织中nf-κb和iκb-α的mrna表达水平

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

创面愈合是一个复杂而微妙的细胞和相应的炎症介质之间的互动反应过程。趋化因子与其受体结合可加剧炎症、血管生成、聚集和活化白细胞。趋化因子及其受体的表达水平与肠道炎症程度有关。cxcr1和cxcr2有共同的趋化因子，随着结肠炎程度加强，cxcr1和cxcr2的表达加强。

小鼠结肠组织中cxcr1和cxcr2的mrna表达水平见表7，与其它组相比，模型组小鼠结肠组织中的cxcr1和cxcr2表达最强，灌胃发酵乳杆菌cqpc06可减弱结肠组织中cxcr1和cxcr2的表达，且随着cqpc06的剂量增加，使cxcr1和cxcr2表达减弱的作用也加强。

表7小鼠结肠组织中cxcr1和cxcr2的mrna表达水平

注：标有相同英文字母(a-e)的组之间不存在显著差异，标有不同英文字母(a-e)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

实施例3、利用发酵乳杆菌cqpc06制备发酵食品

发酵乳杆菌cqpc06原始菌种的保存：在温度-75℃下以30wt％甘油悬液形式保存，或在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存。

发酵乳杆菌cqpc06工作发酵剂的制备，采用下述两种方法中的任意一种：

第一种方法：将发酵乳杆菌cqpc06的原始菌种接种于经110℃灭菌10min的12wt％脱脂乳中，37℃培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；然后将母发酵剂按3-5vol％接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，凝乳中的活菌数约10⁹cfu/ml，用作工作发酵剂。

第二种方法：将发酵乳杆菌cqpc06的原始菌种接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4vol％接种于mrs培养基中，培养16-18h，4℃、4000r/min离心15min，去除上清夜，细胞沉淀用无菌脱脂乳制成悬浮液，用作工作发酵剂。

1、制备乳酸菌奶饮料

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入发酵乳杆菌cqpc06工作发酵剂使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，即得到含发酵乳杆菌cqpc06的乳酸菌奶饮料，4℃冷藏保存。

2、制备发酵乳

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌cqpc06工作发酵剂，37℃发酵16h，即得到发酵乳杆菌cqpc06发酵乳，4℃冷藏保存。

或者，将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌cqpc06工作发酵剂，再按照原料乳体积的4％加入其它可共生的制备发酵乳的商业发酵剂(如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，混匀，37℃混菌发酵至滴定酸度以乳酸计为0.6-0.7％，即得到混菌发酵乳，4℃冷藏保存。

3、制备乳粉

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照体积比3：1加入发酵乳杆菌cqpc06发酵乳，均质，真空浓缩，喷雾干燥，即得到含发酵乳杆菌cqpc06的乳粉。

4、制备乳粉胶囊

将含发酵乳杆菌cqpc06的乳粉装入胶囊壳中，即得到乳粉胶囊。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆第二师范学院

<120>发酵乳杆菌cqpc06及其在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>发酵乳杆菌cqpc06(lactobacillusfermentumcqpc06)

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<210>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcacaatccaggcccaatc19

<210>8

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<212>dna

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<400>8

ggagtgacggcaaacatgact21

<210>9

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<212>dna

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<400>9

tcgatgcacaactgggtgaac21

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<212>dna

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ggggcctgcaaaggttatc19

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tgctgttacggtgcataccc20

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ggggtcgttgatggcaaca19