特基拉芽胞杆菌BacillustequilensisXG18和应用的制作方法

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18和应用。

背景技术：

黄单胞属(xanthomonas)细菌是一类革兰氏阴性植物病原菌，它们能感染400多种植物，其中包括重要粮食作物和经济作物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、柑橘、香蕉等，导致减产和重大经济损失，请见(leynsf,decleenem,swingsj,deleyj.thehostrangeofthegenusxanthomonas.thebotanicalreviews,1984,50(3):308-355)。野油菜黄单胞菌(x.campestrispv.campestris,xcc)能侵染所有十字花科植物，引起黑腐病。水稻白叶枯菌(x.oryzaepv.oryzae,xoo)能引起水稻白叶枯病，而全世界有27亿人以水稻为主食，水稻白叶枯病是对水稻危害最严重的三大病害之一，请见(johnm,stephaneg,shimpeim,etal.top10plantpathogenicbacteriainmolecularplantpathology[j].molecularplantpathology,2012,13(6):614-629)。柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞柑橘致病变种xanthomonasaxonopodispv.citri引起的一种严重危害柑橘枝、叶及果实的细菌性病害，请见(任建国，黄思良，岑贞陆，等.21种药剂对柑橘溃疡病的防治试验[j].中国南方果树，2005，34(3):13-15)，是包括中国在内世界性检疫对象。该病在我国一些柑橘产区均有发生，尤其以广东、广西、湖南、福建等省(区)受害严重，造成落叶、枯梢，削弱树势，严重的可引起落果，影响柑橘产量和果品质量，请见(方毅敏，张宜绪.柑桔溃疡病发病程度对落叶、落果、果实大小及品质的影响[j].植物病理学报，1992，22(4):361-364)。

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)引起的细菌性病害(李瑶,承河元,方书苗,等.猕猴桃细菌性溃疡病流行预测初探[j].应用生态学报,2001,12(3):359-362.)。其发生具有范围广、传播快、致病性强、防治难度大等特点，可在短期内造成大面积树体死亡，是猕猴桃生产和发展中的毁灭性病害(李黎,钟彩虹,李大卫,等.猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展[j].华中农业大学学报,2013,32(5):124-133.)

然而，目前以上病害防治仍以化学农药为主，而化学农药有污染环境、对人畜不安全、破坏生态环境等弊端。生物防治具有环境友好、易降解、对人畜无害等优点，是防治植物病害的可行方案。其中芽胞杆菌(bacilus)是一类理想的生防菌筛选对象，主要包括枯草芽胞杆菌(b.subtilis)、巨大芽胞杆菌(b.megaterlum)、多粘芽胞杆菌(b.polymyxa)、短小芽胞杆菌(b.pumilus)、解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciens)以及蜡状芽胞杆菌(b.cereus)等。

申请号为201610174472.8的中国发明专利公开了一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用，该发明分离筛选了一株优良的牡丹内生解淀粉芽胞杆菌，但该菌株只对盆栽牡丹灰霉病具有良好的防病作用，应用范围较窄，同时对牡丹具有一定的促生作用；申请号为201410735508.6的中国发明专利公开了一株解淀粉芽孢杆菌lh-1在防治棉花黄萎病、大白菜软腐病、青枯病、桃树腐烂病、苹果腐烂病等方面的应用，需利用解淀粉芽孢杆菌与壳寡糖组合成微生态菌剂，比较而言只对棉花黄萎病的防治效果较好；田呈明等公开了一株拮抗植物病原细菌的细菌菌株及其应用，该发明筛选的拮抗菌为深层类芽孢杆菌(paenibacillusprofundus)xzq-20，能产生蛋白酶，能抑制欧美杨溃疡病菌(lonsdaleaquercina)、猕猴桃溃疡病菌(pseudomonassyringae)、白菜软腐病菌(erwiniacarotovora)及核桃黑斑病菌(xanthomonasjuglandis)等植物病原细菌的生长，可用于防治由欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌及核桃黑斑病菌等病原细菌引起的植物病害。但该菌株仅对植物病原细菌具有良好的拮抗作用，不能拮抗病原真菌。

申请号为201410469787.6的中国发明专利公开了一株荧光假单胞菌及其在防治核桃黑斑病中的应用，该菌株为荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株gh2-1，不仅能够高效的防治核桃黑斑病害，还能有效促进核桃生长，但该菌株菌种种子液需要26℃摇床振荡培养3～5d，大量固体发酵还需要培养5～6d，生物菌剂制备时间较长，且抑菌谱较窄；也有利用核桃内生菌解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciens)ht-q6，防治核桃炭疽病菌、梨褐腐病菌、苹果褐腐病菌、茄子枯萎病菌、番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、梨黑斑病菌、苹果干腐病菌、西瓜炭疽病菌和菜豆菌核病菌的报道，申请号为201510462700.7的中国发明专利公开了利用西瓜内生菌解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciens)xk-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用(申请号：201510462700.7)，但这两个发明中解淀粉芽胞杆菌拮抗的均为病原真菌，对病原细菌没有拮抗作用。

然而，关于特基拉芽胞杆菌能同时在多种植物病原细菌病害及真菌病害上的研究报道很少，本发明将保护该菌在有效预防和治疗由黄单胞菌属病原菌和丁香假单胞杆菌引起的植物病害中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18和应用。该特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18在有效预防和治疗由黄单胞菌属病原菌、丁香假单胞杆菌和灰葡萄孢引起的植物病害中的应用，是一株具有广谱拮抗作用的生防芽孢杆菌，填补了单一微生物菌剂同时防治黄单胞菌属病原菌、丁香假单胞杆菌、灰葡萄孢等多种植物病原细菌和病原真菌的技术空白。

为了实现第一目的，本发明所设计一种特基拉芽胞杆菌，其特征在于：该菌株为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18，cctccno：m2018831。

申请人从患灰霉病兰花根际土壤筛选得到一株细菌，结合生理生化特征和分子特征鉴定为特基拉芽胞杆菌，并命名为bacillustequilensisxg18。该菌株bacillustequilensisxg18已于2018年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为m2018831。

进一步地，所述特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18中含有seqidno：1所示的核苷酸序列。

上述特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18有如下特征：该菌株在形态和培养特征方面：在lb固体培养基上生长为乳白色，不透明，菌落呈近圆形，显微镜下观察单个菌为杆状，革兰氏染色结果为阳性。

上述筛选得到菌株培养，提取dna，对基因组中16srdna序列分析如seqidno：1所示(片段长度为1435bp)与genbank数据库中序列进行blast分析，选取7株菌株用clustalx2.1进行多序列比对分析，利用mega6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，菌株xg18与genbank中登录号为jf411301.1(bacillustequilensisstrainkm11)菌株聚类到一起，且同源性达到99％。依据16srdna分类标准，一般认为16srdna序列同源性大于97％，可认为属于同一个种，

为了实现第二目的，本发明所设计一种特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18在防治由黄单胞菌属病原菌引起的植物病害中的应用；其中，

所述植物病害为野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestris(xcc)引起的甘蓝黑腐病；

或者，水稻白叶枯菌x.oryzaepv.oryzae(xoo)引起的水稻白叶枯病和柑橘溃疡病菌x.axonopodispv.citri(xac)引起的柑橘溃疡病，

所述植物病害的植物包括十字花科作物、水稻、番茄和柑橘。

为了实现第三目的，本发明所设计一种特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18在防治由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)引起的植物病害中的应用；其中，

所述植物病害为猕猴桃溃疡病、番茄细菌性叶斑病和十字花科细菌性黑斑病。

本发明还提供了一种特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18在防治由灰葡萄孢(botrytiscinerea，bc)引起的植物病害中的应用；

上述特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的生防菌剂的制备：

将lb平板或者斜面上的xg18菌落挑取一环移植到试管活化，30℃摇床培养16h，转速150rpm，试管中lb液体培养基为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠5g/l，ph7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量移植到装有100mllb液体培养基的250ml锥形瓶中，转速150rpm，35℃摇床培养10h-24h，当菌含量大于2×10⁸cfu/ml以上即可获得发酵菌液，储存作为生防菌剂。该生防菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养基中培养10-24h即可获得很好的拮抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本。

本发明的有益效果：

1、本发明的生防菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养基中培养10-24h即可获得很好的拮抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本。

2、该菌定植力强，同时对多种细菌性病害和真菌病害均有很强的拮抗作用，具有良好的开发应用前景。

3、抑菌圈拮抗实验表明：该特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对水稻白叶枯菌x.oryzaepv.oryzae(xoo)病害具有明显的抑制作用。

附图说明

图1为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18菌落和显微形态示意图；

图2为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18菌株对水稻白叶枯菌x.oryzaepv.oryzae(xoo)的抑菌圈效果图；

图3为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18菌株对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)的抑菌圈效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的筛选和鉴定

1.特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的筛选

a.芽胞杆菌的分离纯化：

取患有灰霉病的兰花植株根际土样10g加入到盛有90ml无菌水和30-50颗玻璃珠的三角瓶中，制成1：10浓度的悬浮液，在28℃，180rpm摇床中振荡20-30min后，将菌悬液放置在75-85℃水浴中保持12-18min。将lml土壤悬浮液移入盛有9ml无菌水的试管中，制成10^-2菌悬液，依次类推，获得10^-3，10^-4，10^-5以及10^-6菌悬液。梯度稀释后，吸取100μl稀释倍数为10^-3-10^-6的菌悬液均匀涂布在分离培养基--牛肉膏蛋白胨培养基上，培养基配方如下(1l)：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4。将涂布有菌悬液的平板置于30℃培养箱中1周，24h后随即观察分离培养基上菌落状态，用三步划线发进行分离纯化，统一编号登记。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏。用50％(v/v)甘油作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

b.芽胞杆菌的初筛：

先采用点接法，分别取100μl野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestris，xcc)和丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)菌液(约1×10⁷cfu/ml)均匀涂布lb平板上，然后用无菌牙签在每个平板上点接四个参试菌株(依次选择xg1、xg2、xg3…xg28中的4个菌株)，每个处理设置三个重复。在30℃以及37℃恒温箱中培养20-28h。同时采用平板对峙法进一步筛选其中能同时拮抗灰葡萄孢的拮抗细菌，将打好直径为7mm的病原菌饼放置pda平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗菌，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复三次，进一步筛选抑菌直径大于5mm的菌株。

c.芽胞杆菌的复筛：

采用管碟法复筛：将初筛有拮抗作用的菌株在lb液体培养基中以150rpm适温培养20-28h，发酵液以8000rpm离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤至灭菌ep管中。将涂布有100μl病原细菌(约1×10⁷cfu/ml)的lb琼脂平板上等距离用打孔器打直径为7mm的孔。每个孔中接入50μl发酵液，以无菌水为对照，每个处理设置三次重复。在30℃恒温箱中培养20-28h后测量抑菌圈直径，根据数值大小确定拮抗程度。筛选出对野油菜黄单胞菌和丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种有拮抗作用的菌株。同时，分别将初筛拮抗菌滤液与约50℃的pda固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的灰葡萄孢菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径，筛选出对灰霉病有拮抗作用的菌株。

2.特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的和鉴定：

a.特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的形态学和生理生化特征：

该菌株在形态和培养特征方面：菌体杆状，周生鞭毛，并具有运动性；菌落为乳白色，呈近圆形，边缘不规则，不产生可溶性色素。如图1所示。在生理生化鉴定方面：属于革兰氏染色阳性菌，具有接触酶活性，能利用d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-甘露糖产酸，能利用柠檬酸盐，能够水解酪素并使明胶液化，v-p反应阳性，不具有卵磷脂酶活性，不能水解马尿酸盐和酪氨酸，不能利用葡萄糖产气。

b.特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18的分子学鉴定：

上述筛选得到菌株培养，提取dna，对基因组中16srdna序列分析如seqidno：1所示(片段长度为1435bp)与genbank数据库中序列进行blast分析，选取7株菌株用clustalx2.1进行多序列比对分析，利用mega6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，菌株xg18与genbank中登录号为jf411301.1(bacillustequilensisstrainkm11)菌株聚类到一起，且同源性达到99％。依据16srdna分类标准，一般认为16srdna序列同源性大于97％，可认为属于同一个种，

结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株xg18属于特基拉芽胞杆菌，命名为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18。

实施例2

利用特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18制备生防菌剂的方法：

将lb平板或者斜面上的xg18菌落挑取一环移植到试管活化，35℃摇床培养16h，转速150rpm，试管中lb液体培养基为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠5g/l，ph7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量移植到装有100mllb液体培养基的250ml锥形瓶中，转速150rpm，35℃摇床培养10h-24h，当菌含量大于2×10⁸cfu/ml以上即可获得发酵菌液，储存作为生防菌剂。

实施例3特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对黄单胞菌属病原菌的拮抗作用

1.分别取lb平板上3种黄单胞菌的单菌落各一环置于灭菌的液体lb培养基中，28℃摇床培养24-48h，转速150rpm，即得到野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestris(xcc)、水稻白叶枯菌x.oryzaepv.oryzae(xoo)、柑橘溃疡病菌x.axonopodispv.citri(xac)3种病原菌的发酵菌液；

2.取lb平板上特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18单菌落一环于灭菌的液体lb培养基中，35℃摇床培养12h，转速150rpm，即得到拮抗菌bacillustequilensisxg18菌体发酵菌液；

3.取步骤1中3种病原菌发酵菌液各100μl，分别涂布于lb固体培养基上，然后再使用无菌打孔器在lb固体培养基上均匀打6个7mm的孔，其中3个孔中分别加入50μl特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18发酵菌液，另外3个孔中分别加入50μl无菌水的处理作为空白对照，28℃培养24h后观察拮抗菌对3种病原菌抑菌圈的大小。其抑菌效果见表1和图2。

结果表明，该特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestris(xcc)、水稻白叶枯菌x.oryzaepv.oryzae(xoo)、柑橘溃疡病菌x.axonopodispv.citri(xac)3个亚种均具有很好的抑菌效果，抑菌圈达到22mm以上，尤其是对水稻白叶枯菌的抑菌圈达到30mm以上。

表1b.tequilensisxg18发酵液对黄单胞菌属病原菌的抑菌效果评价

注：所述的植物包括十字花科作物、水稻、番茄和柑橘等。

实施例4特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)影响即为特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种抑菌圈实验：

1.取lb平板上一环丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)单菌落置于灭菌的液体lb培养基中，28℃摇床培养24-48h，转速150rpm，即得到丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)的发酵菌液；

2.取lb平板上特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18单菌落一环于灭菌的液体lb培养基中，35℃摇床培养12h，转速150rpm，即得到拮抗菌bacillustequilensisxg18菌体发酵菌液；

3.取步骤1中病原菌发酵菌液100μl，涂布于lb固体培养基上，然后再使用无菌打孔器在lb固体培养基上均匀打6个7mm的孔，其中3个孔中分别加入50μl特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18发酵菌液，另外3个孔中分别加入50μl无菌水的处理作为空白对照，28℃培养24h后观察拮抗菌对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种抑菌圈的大小。

结果表明，该特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种具有较好的抑菌效果，抑菌圈达到22mm以上(表2)。对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonassyringaepv.actinidiae，psa)的抑菌圈效果图，结果见图3，稀释10倍后的拮抗菌发酵液抑菌圈同样达到22mm以上。

表2b.amyloliquefaciensd2wm发酵液对黄单胞菌属病原菌的抑菌效果评价

所述植物病害为猕猴桃溃疡病、番茄细菌性叶斑病和十字花科细菌性黑斑病等。

实施例5特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对灰葡萄孢的抑菌效果

1.将上述生防菌剂经过10000r/min室温离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，得到拮抗菌滤液；

2.取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的pda固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的灰葡萄孢菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。

无菌滤液抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－0.7)×100％。

表3显示特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18对灰葡萄孢的抑菌率均达到90％以上。

表3bacillusamyloliquefaciensd2wm无菌滤液对油茶主要病害的抑菌率

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110>湖北工程学院

<120>特基拉芽胞杆菌bacillustequilensisxg18和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1435

<212>dna

<213>bacillustequilensisxg18(特基拉芽胞杆菌xg18)

<400>1

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