本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法。
背景技术：
紫花苜蓿(medicagosativa)是奶牛养殖中应用广泛的优质蛋白类牧草，被誉为牧草之王。我国气候属雨热同季，在夏季降水较多的区域苜蓿收获常与雨季重合，损失较大。青贮作为提升牧草饲用价值的有效手段之一，是解决苜蓿雨季收贮困难的优选方法。苜蓿青贮(alfalfasilage)，柔软多汁、适口性好且消化率高，便于长期保存。
苜蓿中富含木质素，而木质素是一类结构复杂、稳定的生物大分子物质。动物体内缺乏降解木质素的酶类，因此不能消化吸收，从而降低了饲料的饲用品质及营养价值，在一定程度上影响了苜蓿青贮的推广和应用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法，能够有效地降低苜蓿青贮中木质素的含量，提高苜蓿青贮的饲用品质及营养价值。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种苜蓿青贮发酵剂，包括植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；
所述植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1:0.9～1.1。
优选的，所述植物乳杆菌cicc20765发酵液的制备方法包括：将植物乳杆菌cicc20765菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到植物乳杆菌cicc20765发酵液；所述液态发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。
优选的，所述凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的制备方法包括：将凝结芽孢杆菌accc10229菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述液态发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。
优选的，所述植物乳杆菌cicc20765菌液的活菌数为1.0×108～×1.0×1010cfu/g；所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的活菌数为1.0×108～×1.0×1010cfu/g。
优选的，所述接种量独立为液态发酵培养基总重量的5％～15％。
本发明提供了一种苜蓿青贮的制备方法，包括如下步骤：
1)将苜蓿与上述方案所述的苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物；
2)将所述步骤1)的总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。
优选的，所述步骤1)中苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比为1kg：1.4～1.6ml。
优选的，步骤1)中所述混合前还包括将苜蓿青贮发酵剂进行稀释；所述稀释的倍数为3～5倍。
优选的，步骤1)中所述混合前还包括将苜蓿切割成2～5cm的苜蓿小段。
优选的，所述步骤2)中密封发酵的温度为20～30℃。
本发明提供了一种苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法。所述苜蓿青贮发酵剂包括植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1:0.9～1.1。本发明中，在青贮饲料中同时添加植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液进行发酵，可以使苜蓿细胞壁膨胀，导致纤维间的孔隙度增加，从而有利于木质纤维素消化酶的接触和消化，降低苜蓿青贮中木质素的含量。实施例结果表明植物乳杆菌cicc20765与凝结芽孢杆菌accc10229搭配可以显著降低苜蓿青贮中木质素的含量1.38～11.98％。
具体实施方式
本发明提供了一种苜蓿青贮发酵剂，包括植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1:0.9～1.1。在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比优选为1:1。在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765发酵液的活菌数优选为1.0×108～×1.0×1010cfu/g，更优选为1.0×109cfu/g。
在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765发酵液的制备方法优选包括：将植物乳杆菌cicc20765菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到植物乳杆菌cicc20765发酵液；所述液态发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。本发明对所述液态发酵培养基中各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765菌液的接种的量优选为液态发酵培养基总重量的5％～15％，更优选为10％。在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765菌液的制备方法优选包括将植物乳杆菌cicc20765依次进行活化和扩大培养得到。在本发明中，所述活化的方式优选为将植物乳杆菌cicc20765在mrs固体斜面培养基上划线，将划线后的培养基在35℃下培养至长出菌落。在本发明中，所述活化的次数优选为2次。在本发明中，所述扩大培养的方式优选为将活化后的单菌落接种于mrs液体培养基中，在35℃，120rpm过夜，得到植物乳杆菌cicc20765菌液。
在本发明中，所述发酵的温度为30～40℃，优选为35℃；所述发酵的搅拌速度为80～120rpm，优选为100rpm；所述发酵的时间为20～28h，优选为24h。
在本发明中，所述植物乳杆菌cicc20765购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的制备方法优选包括：将凝结芽孢杆菌accc10229菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述液态发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。本发明对所述液态发酵培养基中各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的接种的量优选为液态发酵培养基总重量的5％～10％，优选为10％。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的制备方法优选包括将凝结芽孢杆菌accc10229依次进行活化和扩大培养得到。在本发明中，所述活化的方式优选为将凝结芽孢杆菌accc10229在mrs固体斜面培养基上划线，将划线后的培养基在35℃下培养至长出菌落。在本发明中，所述活化的次数优选为2次。在本发明中，所述扩大培养的方式优选为将活化后的单菌落接种于mrs液体培养基中，在35℃，120rpm过夜，得到凝结芽孢杆菌accc10229菌液。
在本发明中，所述发酵的温度为30～40℃，优选为35℃；所述发酵的搅拌速度为80～120rpm，优选为100rpm；所述发酵的时间为20～28h，优选为24h。
在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
在本发明中，在青贮饲料中同时添加植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液进行发酵，可以使苜蓿细胞壁膨胀，导致纤维间的孔隙度增加，从而有利于木质纤维素消化酶的接触和消化。
本发明提供了一种苜蓿青贮的制备方法，包括如下步骤：
1)将苜蓿与上述方案所述的苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物；
2)将所述步骤1)的总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。
本发明将苜蓿与苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物。在本发明中，所述混合前优选将苜蓿切割成2～5cm的小段，更优选为4cm的小段。在本发明中，所述苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg：1.4～1.6ml，更优选为1kg：1.5ml。
本发明对苜蓿的来源没有特殊限定，采用本领域常规苜蓿即可。本发明实施例中用丹农种子公司提供的北极熊品种，在天津农业资源与环境研究所的“海滨盐碱地绿化土壤改良科研试验基地”种植得到。
在本发明中，所述混合前优选将苜蓿青贮发酵剂进行稀释；所述稀释的倍数优选为3～5倍，更优选为4倍。所述稀释用稀释液优选为水。在本发明中，所述混合的方式优选为将苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿上。
得到总混物后，本发明优选将所述总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。在本发明中，所述密封的方式优选为采用聚乙烯塑料进行密封。在密封前优选排出空气。在本发明中，所述发酵的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述发酵的时间优选为45d。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用已灭菌的接种环从冻存管中取出植物乳杆菌cicc20765和凝结芽孢杆菌accc10229，分别于mrs固体斜面上划线，将划线后的mrs固体培养基置于35℃培养箱中培养出菌落，活化2次后挑取单菌落接于mrs液体培养基中于35℃，120rpm/min过夜，得到植物乳杆菌cicc20765菌液和凝结芽孢杆菌accc10229菌液备用。
将得到的植物乳杆菌cicc20765菌液和凝结芽孢杆菌accc10229菌液分别调整至菌浓度为1.0×109cfu/g后，分别接种(接种量为液体培养基重量的10％)到液体培养基中(蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，吐温5ml，蒸馏水定容到1l；按上述配方配制好液态培养基后，调节ph值至5.9)，在35℃，100rpm的条件下培养24h，得到植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液。
试验用苜蓿为丹农种子公司提供的北极熊品种，种植区域为天津市农业资源与环境研究所的“滨海盐碱地绿化土壤改良科研试验基地”，亩播种量1.2kg。苜蓿于第一茬初花期刈割苜蓿，晾晒24h后(干物质含量29.13±0.75％)，用铡草机将其切割成2～5cm的小段，用于制作苜蓿青贮。
实施例2
取实施例1得到的植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照0.9:1.1的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。
取实施例1的苜蓿小段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿小段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg：1.6ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释3倍后再喷洒到苜蓿小段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在20℃下发酵50d后开袋，分析青贮苜蓿营养成分。
实施例3
取实施例1得到的植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照1.1:0.9的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。
取实施例1的苜蓿小段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿小段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg：1.4ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释5倍后再喷洒到苜蓿小段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在30℃下发酵40d后开袋，分析青贮苜蓿营养成分。
实施例4
取实施例1得到的植物乳杆菌cicc20765发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照1:1的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。
取实施例1的苜蓿小段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿小段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg：1.5ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释4倍后再喷洒到苜蓿小段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在25℃下发酵45d后开袋，分析青贮苜蓿营养成分。
对比例1
除不添加发酵剂外，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组1。
将实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组2。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组3。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组4。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的戊糖片球菌cicc22737发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组5。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的戊糖片球菌cicc22737发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组6。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组7。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组8。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液和乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组9。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液和乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液、乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1:1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组10。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液和戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和乳酸片球菌cicc22737发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组11。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌accc11016(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心)发酵液、戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的植物乳杆菌accc11016发酵液、戊糖片球菌cicc22737发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1:1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组12。
将实施例1的植物乳杆菌cicc20765发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组13。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液和实施例1的植物乳杆菌cicc20765发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组14。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液、实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液和实施例1的植物乳杆菌cicc20765发酵液按照1:1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组15。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将制备得到的戊糖片球菌cicc22737发酵液和实施例1的植物乳杆菌cicc20765发酵液按照1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组16。
采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737发酵液(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，将制备得到的戊糖片球菌cicc22737发酵液、实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229和实施例1的植物乳杆菌cicc20765发酵液按照1:1:1的质量比混合后，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组17。
实施例5
对实施例4及对比例1中对照组1～17制备得到的苜蓿青贮的营养成分进行分析。样品由cvas饲料分析中国服务中心通过近红外光谱(nearinfrared，nir)进行营养价值评估，测定木质素的含量。具体测定结果如表1所示。
表1不同发酵剂对苜蓿青贮中木质素含量的影响
由表1可以看出，植物乳杆菌cicc20765与凝结芽孢杆菌accc10229搭配可以显著降低苜蓿青贮中木质素的含量，相较于对照组1～17木质素含量降低1.38％～11.98％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。