本发明涉及微生物发酵技术领域，具体来说，涉及一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法。
背景技术：
芽孢杆菌是一类能形成芽孢(内生孢子)的杆菌，广泛分布于土壤、水、空气以及动物肠道等处，大多数芽孢芽孢具有无毒、对人畜无害、不污染环境、能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶、多肽或脂类等活性物质，可促进植物生长与防治植物病害，并具有繁殖速度快、营养简单、抗逆性强、定植与繁殖能力强等优点，因此成为研究最多的农用益生细菌，其中，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是芽孢杆菌的一种。
研究表明，枯草芽孢杆菌具有产生广谱抗菌活性物质、与病原菌营养竞争和诱导植物系统抗性等生防作用以及促进植物生长的作用。目前枯草芽孢芽孢杆菌在烟草、油菜、辣椒、黄瓜等作物土传病害的防治与促生、增产、提质上效果显著，因此枯草芽孢杆菌是一种具有生物农药与生物肥料开发价值的一类芽孢杆菌，拥有广阔的应用前景。
当前，国内外生产枯草芽孢杆菌菌剂方法主要包括液体深层发酵与纯固体发酵。其中，液体深层发酵存在生产成本高、难以得到高密度的活菌与芽孢、代谢物不能充分利用、后续处理复杂(如发酵液真空浓缩，固态粉剂载体的吸附，干燥等)、有废液排放等弊端，而纯固体发酵由于多级固体扩种增加染菌风险且工艺复杂、发酵发酵周期长，因此不适合推广使用。如何在保证有效活菌数的同时，尽可能提高芽孢率，同时兼顾生产成本，成为困扰枯草芽孢杆菌菌剂实际工业生产的瓶颈问题。
技术实现要素：
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法旨在利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数与芽孢得率，降低菌剂的原料与后处理成本，为建立规模化的发酵工艺提供参考依据。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，包括如下步骤：
s1、将活化后的枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，进行摇床培养，得种子液；
s2、将所述种子液接种于发酵罐深层的液体发酵培养基中，进行发酵培养，得到液体发酵产物；所述液体发酵培养基配方为：8～14g/l玉米粉、10～25g/l黄豆粉、1～4g/lnacl、0.5～1.5g/lkh2po4、0.5～2g/lk2hpo4、1～5g/lmgso4·7h2o、1～5g/lcaco3、初始ph6.5～7.5；
s3、将液体发酵产物接种于多孔性浅盘固体发酵培养基中，进行浅盘固体发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵物；所述浅盘固体发酵培养基配方为：50～85份麦麸、4～15份豆粕粉、5～15份棉籽粕、3～10份玉米秸秆粉、3～10份谷壳、1～5份糖蜜、0.1～0.5份(nh4)2so4、0.5～2份mgso4·7h2o、0.02～0.06份mnso4，调节水分至55～70％；
s4、将所述枯草芽孢杆菌发酵物通风干燥后粉粹即得枯草芽孢杆菌菌剂。
上述的方法，优选的，所述s1中，所述种子培养基为ypd种子培养基。
上述的方法，优选的，所述摇床培养具体为：36℃、160r·min-1摇床培养16h。
上述的方法，优选的，所述s2中，所述种子液的接种量为1～3v/v％。
上述的方法，优选的，所述s2中，所述发酵罐深层液体发酵条件为：装料系数0.5～0.6、罐压0.06mpa，温度30～36℃，通气量为0.5～1.5vvm、转速为160～200r/min，发酵时间16h。
上述的方法，优选的，所述s3中，所述液体发酵产物的接种量为20～30v/w％。
上述的方法，优选的，所述浅盘固体发酵的具体过程为：在无菌操作台上，用无菌不锈多孔钢盘分装已灭菌的固体发酵培养基，堆料厚度约3～5cm，同时接入所述液体发酵物并混匀，然后将接种后固体培养基置于固体培养箱中，培养温度30～36℃，在培养过程中每隔1天翻动一次培养基，发酵时间72h。
上述的方法，优选的，所述s4具体为：将所述枯草芽孢杆菌发酵物在温度不高于50℃的条件下通风干燥，使含水量控制在20％以下，然后粉粹即得枯草芽孢杆菌菌剂。
上述的方法，优选的，所述s2中，所述液体发酵培养基配方为：9～12g/l玉米粉、13～18g/l黄豆粉、2～3.5g/lnacl、0.6～1.2g/lkh2po4、1～2g/lk2hpo4、2～4g/lmgso4·7h2o、2～4g/lcaco3、初始ph6.5～7.5。
上述的方法，优选的，所述s2中，所述液体发酵培养基配方为：10g/l玉米粉、15g/l黄豆粉、3g/lnacl、1g/lkh2po4、1.5g/lk2hpo4、3.5g/lmgso4·7h2o、3g/lcaco3、初始ph7.0±0.2。
上述的方法，优选的，所述浅盘固体发酵培养基配方为：65～80份麦麸、5～10份豆粕粉、8～12份棉籽粕、4～8份玉米秸秆粉、4～8份谷壳、2～4份糖蜜、0.2～0.4份(nh4)2so4、1～2.5份mgso4·7h2o、0.02～0.05份mnso4，调节水分至60～65％。
上述的方法，优选的，所述浅盘固体发酵培养基配方为：70份麦麸、5份豆粕粉、10份棉籽粕、5份玉米秸秆粉、5份谷壳、3份糖蜜、0.25份(nh4)2so4、2份mgso4·7h2o、0.05份mnso4，调节水分至60％。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，首先利用液体发酵快速生产大量的菌体作为固体发酵的接种体，然后将液体菌液按20～30％(v/m)接种量混合到固体基质中，迅速形成优势菌群，并生成大量芽孢，从而缩短了发酵周期，提高了产率，减少了杂菌污染几率，节约了资源。同时发酵过程中的生防代谢产物也得以保留，克服了液体发酵代谢物不能充分利用、有废液排放等弊端。具有工艺简单、生产成本较低、节省动力、易于控制管理、活菌与芽孢产量高、后处理简单等优势，有利于微生物菌剂的应用与推广。
(2)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，发酵罐液体深层发酵培养基的培养基成分以玉米粉与黄豆粉作为培养基的碳氮源，nacl、kh2po4、k2hpo4、mgso4·7h2o作为无机盐。碳源、氮源、无机盐)是细胞生长与繁殖所必需的营养成分。枯草芽孢杆菌发酵培养时，培养基营养成分组成及比例要恰当，尤其是碳氮比(c/n)，如c/n过低，发酵起始阶段菌体大量繁殖，导致菌体提前自溶，不利于芽孢的形成，而c/n过高，则菌体繁殖减少，发酵后期活菌及芽孢总量偏低。本发明具体限定了液体发酵培养基配方为：8～14g/l玉米粉、10～25g/l黄豆粉、1～4g/lnacl、0.5～1.5g/lkh2po4、0.5～2g/lk2hpo4、1～5g/lmgso4·7h2o、1～5g/lcaco3，具有合适的碳氮比，原料简单易得，成本低，易扩大化生产。同时，nacl、kh2po4、k2hpo4、mgso4·7h2o作为无机盐对芽孢杆菌菌体量与芽孢形成有促进作用，其中kh2po4、k2hpo4与caco3还可起到缓冲发酵液ph的作用，从而可防止菌体自溶和促进芽孢形成。因此应根据菌种特点，。本发明根据培养基优化原则，优选来源容易、价格低廉、利于生长且芽孢产率高的培养基成分用于发酵生产，确定了最适的发酵培养基最终配比，实现了高产芽孢的目的。
(3)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，发酵罐液体深层发酵条件为：装料系数0.5～0.6、罐压0.06mpa，温度30～36℃，通气量为0.5～1.5vvm、转速为160～200r/min，发酵时间16h。在枯草芽孢杆菌发酵过程中，除了需要适宜的营养条件外，培养条件也至关重要，需要得到高的活菌或芽孢产量则要求发酵保持在适宜的环境条件下进行，主要包括溶氧、温度、发酵时间等，而在发酵罐液体深层发酵过程中，溶氧主要由装料量、通气量与转速控制。本发明具体限定了装料系数0.5～0.6、罐压0.06mpa，温度30～36℃，通气量为0.5～1.5vvm、转速为160～200r/min，发酵时间16h，是液体深层发酵保持在适宜的环境条件下进行，显著提高了活菌与芽孢的产量。
(4)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，浅盘固体发酵培养基配方直接以麦麸、豆粕粉、棉籽粕、玉米秸秆粉、谷壳、糖蜜作为主要固体发酵培养基原料，并添加(nh4)2so4、mgso4·7h2o、mnso4作为外源成分。麦麸、豆粕粉、棉籽粕、玉米秸秆粉、谷壳、糖蜜是农产品加工副产物，将其作为培养基营养物质，不仅可以降低生产成本，增加经济效益，还可以提高农业资源的综合利用水平，减少环境污染。其中麦麸、豆粕粉、棉籽粕、玉米秸秆粉能够为菌种提供较好的营养物质，但是枯草芽孢杆菌单独利用其生长繁殖还是存在很大局限性。所以当在固体底物之中添加适量的外源碳源(糖蜜)、氮源((nh4)2so4)、无机盐(mgso4·7h2o、mnso4)可加快芽孢杆菌生长繁殖，扩大菌体数量、诱导芽孢形成，进而提高了芽孢的产量。而稻壳也能对固体基质起到有效的支撑作用，以此来增加固态基质中空气的流动性。
(5)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，浅盘固体发酵过程中，堆料厚度与翻动频率对空气对流、散热均有一定影响，堆积太厚且翻动频率低不仅容易造成发酵死角，且影响发酵过程中的溶氧与温度，堆积太浅则生产所需浅盘增多，不仅加大劳动力且浪费空间。本发明具体限定了堆料厚度约3～5cm，在培养过程中每隔1天翻动一次培养基，使得发酵过程中具有良好的空气对流、散热快，提高的发酵的效率。发酵时间也直接影响发酵产品中的菌体与芽孢含量，时间过短发酵未完成，产品中芽孢含量过低，发酵时间过长，不仅会造成菌体与芽孢衰亡，且生产成本也增加，本发明具体限定了发酵时间为72h，保证了芽孢的产量。
(6)本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，所得活菌数与芽孢率高，菌剂产品中的有效活菌数≥5.8×1010cfu/g，芽孢率在95％以上。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
枯草芽孢杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心，编号为accc10118。
实施例1
一种本发明的液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，具体包括如下步骤：
(1)摇瓶种子液制备：用接种环挑取一环活化后的枯草芽孢杆菌菌苔，接种于1.2lypd种子培养基中进行摇床培养，摇床培养条件：温度36℃、摇床转速160r·min-1、培养时间12h，得摇瓶种子液。
(2)发酵罐深层液体发酵培养：将步骤(1)中所得的摇瓶种子液按体积比2％的接种量接入100l发酵罐中。发酵罐中液体发酵培养基组成：10g/l玉米粉、15g/l黄豆粉、3g/lnacl、1g/lkh2po4、1.5g/lk2hpo4、3.5g/lmgso4·7h2o、3g/lcaco3、初始ph7.0±0.2，装液量60l，罐压0.06mpa，温度30℃，通气量为1vvm、转速为200r/min，发酵时间16h，得液体发酵产物。
(3)浅盘固体发酵培养：
3.1、制备固体发酵培养基：按麦麸70份、豆粕粉5份、棉籽粕10份、玉米秸秆粉5份、谷壳5份、糖蜜3份、(nh4)2so40.25份、mgso4·7h2o2份、mnso40.05份，调节水分至60％，灭菌备用。
3.2、在无菌操作台中，将固体培养基用无菌不锈多孔钢盘分装，堆料厚度约4cm，同时将步骤(2)中所得的液体发酵产物按25％(v/m)的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中并混匀，然后将接种后的固体培养基置于固体培养箱中，培养温度控制在30℃，在培养过程中每隔1天翻动一次培养基，发酵时间72h，得到枯草芽孢杆菌固体发酵产物。此时固体发酵产物中有效活菌数达4.32×1010cfu/g以上、芽孢数达95％以上。
(4)发酵后处理：固体发酵结束后，将枯草芽孢杆菌固体发酵产物在温度不高于50℃的条件下通风干燥，使含水量控制在20％以下，然后粉粹、包装分袋，即得枯草芽孢杆菌菌剂。
最终发酵后处理得到的菌剂中有效活菌数达6,3×1010cfu/g以上，芽孢率95％以上，室温下，保质期为18个月。
实施例2
一种本发明的液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，具体包括如下步骤：
(1)摇瓶种子液制备：用接种环挑取一环活化后的枯草芽孢杆菌菌苔，接种于1.2lypd种子培养基中进行摇床培养，摇床培养条件：温度36℃、摇床转速160r·min-1、培养时间12h，得摇瓶种子液。
(2)发酵罐深层液体发酵培养：将步骤(1)中所得的摇瓶种子液按体积比2％的接种量接入100l发酵罐中。发酵罐中液体发酵培养基组成：8g/l玉米粉、10g/l黄豆粉、1g/lnacl、0.5g/lkh2po4、0.5g/lk2hpo4、1g/lmgso4·7h2o、1g/lcaco3、初始ph6.7±0.2，装料系数0.5，罐压0.06mpa，温度30℃，通气量为0.5vvm、转速为160r/min，发酵时间16h，得液体发酵产物。
(3)浅盘固体发酵培养：
3.1、制备固体发酵培养基：按麦麸50份、豆粕粉4份、棉籽粕5份、玉米秸秆粉3份、谷壳3份、糖蜜1份、(nh4)2so40.1份、mgso4·7h2o0.5份、mnso40.02份，调节水分至55％，灭菌备用。
3.2、在无菌操作台中，将固体培养基用无菌不锈多孔钢盘分装，堆料厚度约3cm，同时将步骤(2)中所得的液体发酵产物按20％(v/m)的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中并混匀，然后将接种后的固体培养基置于固体培养箱中，培养温度控制在30℃，在培养过程中每隔1天翻动一次培养基，发酵时间72h，得到枯草芽孢杆菌固体发酵产物。此时固体发酵产物中有效活菌数达4.1×1010cfu/g以上、芽孢数达90％以上。
(4)发酵后处理：固体发酵结束后，将枯草芽孢杆菌固体发酵产物在温度不高于50℃的条件下通风干燥，使含水量控制在20％以下，然后粉粹、包装分袋，即得枯草芽孢杆菌菌剂。
发酵后处理得到的菌剂中有效活菌数达5.8×1010cfu/g以上，芽孢率95％以上，室温下，保质期为18个月。
实施例3
一种本发明的液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，具体包括如下步骤：
(1)摇瓶种子液制备：用接种环挑取一环活化后的枯草芽孢杆菌菌苔，接种于1.2lypd种子培养基中进行摇床培养，摇床培养条件：温度36℃、摇床转速160r·min-1、培养时间12h，得摇瓶种子液。
(2)发酵罐深层液体发酵培养：将步骤(1)中所得的摇瓶种子液按体积比3％的接种量接入100l发酵罐中。发酵罐中液体发酵培养基组成：14g/l玉米粉、25g/l黄豆粉、4g/lnacl、1.5g/lkh2po4、2g/lk2hpo4、5g/lmgso4·7h2o、5g/lcaco3、初始ph7.3±0.2，装料系数0.6、罐压0.06mpa，温度36℃，通气量为1.5vvm、转速为200r/min，发酵时间16h，得液体发酵产物。
(3)浅盘固体发酵培养：
3.1、制备固体发酵培养基：按麦麸85份、豆粕粉15份、棉籽粕15份、玉米秸秆粉10份、谷壳10份、糖蜜5份、(nh4)2so40.5份、mgso4·7h2o2份、mnso40.06份，调节水分至70％，灭菌备用。
3.2、在无菌操作台中，将固体培养基用无菌不锈多孔钢盘分装，堆料厚度约5cm，同时将步骤(2)中所得的液体发酵产物按30％(v/m)的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中并混匀，然后将接种后的固体培养基置于固体培养箱中，培养温度控制在36℃，在培养过程中每隔1天翻动一次培养基，发酵时间72h，得到枯草芽孢杆菌固体发酵产物。此时固体发酵产物中有效活菌数达3.8×1010cfu/g以上、芽孢数达90％以上。
(4)发酵后处理：固体发酵结束后，将枯草芽孢杆菌固体发酵产物在温度不高于50℃的条件下通风干燥，使含水量控制在20％以下，然后粉粹、包装分袋，即得枯草芽孢杆菌菌剂。
发酵后处理得到的菌剂中有效活菌数达6.0×1010cfu/g以上，芽孢率95％以上，室温下，保质期为18个月。
对比例1
枯草芽孢杆菌采用本发明实施例1中的液体发酵培养基进行液体发酵，发酵16h后发酵液中的有效活菌含量低于0.15×1010cfu/ml，芽孢率低于6％。
对比例2
枯草芽孢杆菌只进行固体发酵，即按照摇瓶种子-固体种子培养-固体发酵培养步骤进行发酵培养，此固体种子培养基与固体发酵培养基均为本发明中所述的固体发酵培养基。固体种子培养时间24h后均匀混入固体发酵培养基中，其余固体种子与发酵发酵条件均参照本发明实施例1，固体发酵后72h后有效活菌数低于2.8×1010cfu/g、芽孢数低于75％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。