一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法与流程

本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域，具体是指一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法。

背景技术：

母乳为婴儿营养的重要的来源，婴儿的营养品中，奶粉作为第三大最丰富的固体营养物质，其中所含有的人乳低聚糖(hmo)对婴儿的健康起关键作用，岩藻糖基化的hmo，包括2‘-岩藻糖乳糖(2’-fl)，3-岩藻糖(3-fl)，乳糖新n-四糖(lnnt)等，这些物质可选择性地刺激双歧杆菌的生长，这些岩藻糖基化的人乳低聚糖能够形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿抵抗肠道病原体的感染，如肠道致病性大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌，此外，岩藻糖基化的hmo类似于lewis抗原糖链结构在炎症和肿瘤转移中起着关键作用，能够识别肿瘤细胞的结构并将其转移，在岩藻糖化hmos，2’-岩藻基乳糖能够抑制细菌或病毒粘附在上皮细胞上，这些功能性糖由于它们在营养保健方面的潜在应用而引起了制药业极大的关注。

目前2’-岩藻基乳糖可以通过母乳分离或化学合成的方法获得，然而，有限的母乳来源以及化学合成过程中对侧链的保护和脱保护的严格要求限制了其生产，并且增加了成本，最近的研究表明，发现和鉴定了几种岩藻糖基转移酶，如来源于幽门螺杆菌、双孢杆菌，拟杆菌atcc8482，空肠弯曲杆菌和大肠杆菌o128，o86，o126和o127等等，因此，2’-岩藻基乳糖可以利用α1，2-岩藻糖基转移酶酶法合成，然而，这个反应需要充分的底物gdp-l岩藻糖，增加了大规模合成的成本。

代谢工程和合成生物学的发展为利用微生物合成2’-岩藻基乳糖提供了可能性，在大肠杆菌和沙门氏菌中，gdp-l-岩藻糖参与了细胞壁主要成分荚膜异多糖酸的生物合成，因此，2’-岩藻基乳糖可以由加强gdp-l-岩藻糖生物合成途径的研究将外源岩藻糖基转移酶基因导入大肠杆菌，用于2’-岩藻基乳糖的合成，基于对来源于幽门螺杆菌的α1，2-岩藻糖基转移酶(futc)的鉴定及功能研究，它能够以乳糖作为为受体的底物进行异源表达，从而促进了2’-岩藻基乳糖利用生物技术合成的研究。

技术实现要素：

以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法，为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，并且可以大幅度降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)提供一种2’-岩藻基乳糖产量高，可以大幅度提高2’-岩藻基乳糖的含量的大肠杆菌菌株e.colik-12zk-2；

(2)构建大肠杆菌菌株e.colik-12zk-2，采用crispr/cas9系统对大肠杆菌基因进行敲除，得到敲除菌株；

(3)将与2’-岩藻基乳糖代谢途径相关的基因构建到表达质粒中，导入敲除株内进行2’-岩藻基乳糖相关基因的表达；

(4)发酵后，通过提取、超滤、浓缩和分离等获得2’-岩藻基乳糖。

作为改进，所述的步骤(2)具体包括以下步骤：a、菌株改造：采用crispr/cas9编辑技术将大肠杆菌基因进行敲除，其相关基因包括lacz，laca，mela，wcaj，mdoh，nanketa；

b、质粒的构建：采用gibson连接方法将表达基因构建到pbbr1-mcs2和pmd-18t载体上，其表达基因包括gmd，fcl，manc，manb，futc五个基因。

作为改进，所述的步骤a的e.colik-12zk-2菌种的改造采用的crispr/cas9编辑技术，具体步骤包括：a、转化质粒pcassac至宿主菌，以kan板、37℃进行筛选；

b、挑取阳性克隆子，制备电转感受态细胞，在离心收集前1小时加入10mm的阿拉伯糖诱导red的表达；

c、电转转入含同源片段的质粒ptargett，或不含同源片段的质粒ptargetf+扩增的同源片段，37度复苏1小时后，以kan+spc板进行筛选；

d、过夜培养后对克隆子进行验证；

e、阳性克隆子接lb液体(kan抗性)，加入10mm的鼠李糖，诱导导向质粒ptargetf的sgrna转录，培养过夜，划线分单菌，并验证质粒ptargetf的消除；

f、质粒ptargetf消除的阳性菌重新进行下轮的基因替换操作；

g、直接在5g/l葡萄糖lb培养基中培养至菌浓为0.6-0.8，吸取少量菌液于含5g/l葡萄糖lb固体平板上划线分单菌，再对单菌落进行kan抗性质粒丢失验证。

本发明的有益效果是：本发明提供的枯草芽孢杆菌e.colik-12zk-2菌株是非致病性细菌，该菌株的2’-岩藻基乳糖的产量高，可以大幅度提高2’-岩藻基乳糖的含量，本发明采用大肠杆菌菌株e.colik-12zk-2制备2’-岩藻基乳糖，摇瓶产量高达1g/l。为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，可以大幅度降低生产成本。

附图说明

图1是本发明一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法的岩藻基乳糖的代谢途径示意图。

图2是本发明一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法的实验所用的菌株及质粒表。

图3是本发明一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法的pbbr1-mcs2-gfcb质粒图谱。

图4是本发明一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法的pmd-18-t-futc质粒图谱。

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。

实施例一

从atcc美国模式菌种收集中心购买的一株大肠杆菌dh1(atcc33849)，作为模式菌株，其安全等级为1级，然后对菌株进行一系列的改造，采用crispr/cas9编辑技术将大肠杆菌基因进行敲除，其相关基因包括lacz,laca,mela,wcaj,mdoh,nanketa，同时采用gibson连接方法将表达基因构建到pbbr1-mcs2和pmd-18t载体上，其表达基因包括gmd，fcl，manc，manb，futc五个基因，通过摇瓶发酵其产量高达1g/l。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域，具体是指一种可以产2’‑岩藻基乳糖菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)提供一种2’‑岩藻基乳糖产量高，可以大幅度提高2’‑岩藻基乳糖的含量的大肠杆菌菌株E.coli K‑12 ZK‑2；(2)构建大肠杆菌菌株E.coli K‑12 ZK‑2，采用CRISPR/CAS9系统对大肠杆菌基因进行敲除，得到敲除菌株；(3)将与2’‑岩藻基乳糖代谢途径相关的基因构建到表达质粒中，导入敲除株内进行2’‑岩藻基乳糖相关基因的表达；(4)发酵后，通过提取、超滤、浓缩和分离等获得2’‑岩藻基乳糖。本发明与现有技术相比的优点在于：为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，并且可以大幅度降低生产成本。

技术研发人员：胡学超;史静
受保护的技术使用者：安徽天凯生物科技有限公司
技术研发日：2018.11.20
技术公布日：2019.04.12