一种用于检测呼吸道病原体的引物组、试剂盒和方法与流程

本发明涉及呼吸道病原体检测
技术领域：
，具体而言，涉及一种用于检测呼吸道病原体的引物组、试剂盒和方法。
背景技术：
：急性呼吸道感染(acuterespiratoryinfections,aris)是全球范围内人类最常见的传染性疾病之一，也是造成全世界发病率和死亡率的重要原因之一。急性呼吸道感染多发于儿童、老年人及免疫功能低下者，尤其是儿科的常见病、多发病。急性呼吸道感染分为上呼吸道感染(upperrespiratorytractinfections,uris)和下呼吸道感染(lowerrespiratorytractinfections,lris)。上呼吸道感染最常见的症状包括喉痛、鼻塞、头痛、打喷嚏、咳嗽、发热，90％左右由病毒引起。下呼吸道感染最常见的症状同上呼吸道感染相似，病因主要是细菌和真菌，细菌及其他病原体感染多继发于病毒感染之后。临床上常见的呼吸道病原体有如鼻病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、冠状病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等。由于呼吸道病原体种类繁多，呼吸道感染病症相似，同一种病原体可引起多种的临床症状，不同的病原体也可引起同一种临床症状，仅靠临床症状难以确定真正的病原体，且多病毒共感染、病毒变异和新病毒的出现使呼吸道病原体检测技术面临巨大挑战。快速准确鉴定病原体对于控制传染病流行，制定治疗和用药方案，特别是抗生素的合理应用具有重要意义。目前，临床上最准确的呼吸道病原体检测方法为病毒培养，具有特异性高的特点，是临床诊断的“金标准”。但该法耗时长、敏感性低、对实验操作要求高；此外还有细菌培养和药敏法，可以检测耐药情况，但样本易污染，对结果影响大；病毒抗原的测定可作为感染证据，检测快速，但敏感性低，且不能区分污染和定植菌；抗体检测虽然操作简便，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性和假阴性结果。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，分子诊断方法得到了迅猛发展，成为呼吸道病毒检测的一项革命性技术。多重pcr检测技术因其快速、简便和高通量等特点，在呼吸道病原体检测中得到广泛应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测呼吸道病原体的引物组。该引物组可以对常见的呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻/肠病毒(rhv/ehv)、副流感病毒(hpiv1-4)、冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)、博卡病毒(bov)、流感病毒a(ifua)、流感病毒b(ifub)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)、肺炎支原体(m.pneumonia)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)等实现检测，具有较高的灵敏度和特异性，成本低、检测方便以及较好的重复性等特点。本发明的另一目的在于提供一种用于检测呼吸道病原体的试剂盒。该试剂盒对常见的呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻/肠病毒(rhv/ehv)、副流感病毒(hpiv1-4)、冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)、博卡病毒(bov)、流感病毒a(ifua)、流感病毒b(ifub)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)、肺炎支原体(m.pneumonia)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)等实现检测，具有较高的灵敏度和特异性，成本低、使用方便以及较好的重复性等特点。本发明的另一目的在于提供一种检测呼吸道病原体的方法，该方法可以对常见的呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻/肠病毒(rhv/ehv)、副流感病毒(hpiv1-4)、冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)、博卡病毒(bov)、流感病毒a(ifua)、流感病毒b(ifub)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)、肺炎支原体(m.pneumonia)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)等实现检测，具有较高的灵敏度和特异性，成本低、操作方便以及较好的重复性等特点。本发明是这样实现的：一方面，本发明提供了一种用于检测呼吸道病原体的引物组，其包括如下第1引物对-第13引物对中的任意一对或几对引物的组合：其中，第1引物对包括seqidno.1～2所示的引物，第2引物对包括seqidno.3～4所示的引物，第3引物对包括seqidno.5～6所示的引物，第4引物对包括seqidno.7～8所示的引物，第5引物对包括seqidno.9～10所示的引物，第6引物对包括seqidno.11～12所示的引物，第7引物对包括seqidno.13～14所示的引物，第8引物对包括seqidno.15～16所示的引物，第9引物对包括seqidno.17～18所示的引物，第10引物对包括seqidno.19～20所示的引物，第11引物对包括seqidno.21～22所示的引物，第12引物对包括seqidno.23～24所示的引物，第13引物对包括seqidno.25～26所示的引物。其中，第1引物对用于检测呼吸道合胞病毒(rsv)，第2引物对用于检测腺病毒(adv)，第3引物对用于检测人偏肺病毒(hmpv)，第4引物对用于检测鼻/肠病毒(rhv/ehv)(也就是说，第4引物对即可以检测鼻病毒(rhv)，也可以检测肠病毒(ehv))，第5引物对用于检测副流感病毒(hpiv1-4)，第6引物对用于检测冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)(也就是说，第6引物对可以检测cov-229e，sars，nl63和oc43四种冠状病毒)，第7引物对用于检测博卡病毒(bov)，第8引物对用于检测流感病毒a(ifua)，第9引物对用于检测流感病毒b(ifub)，第10引物对用于检测百日咳杆菌(bordetellapertussis,b.p)，第11引物对用于检测副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis,b.pp)，第12引物对用于检测肺炎支原体(m.pneumonia,m.p)，第13引物对用于检测肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae,c.p)。上述的各引物对的上下游引物序列见下表1。表1注：序列中：y＝c/t，w＝a/t，b＝g/t/c，n＝a/t/c/g，r＝a/g。本发明提供的引物组可以在同一pcr反应体系进行扩增，以检测样品中的多种呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻/肠病毒(rhv/ehv)、副流感病毒(hpiv1-4)、冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)、博卡病毒(bov)、流感病毒a(ifua)、流感病毒b(ifub)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)、肺炎支原体(m.pneumonia)以及肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)等，该引物组经过了发明人科学合理设置，有效地避免了多重pcr反应的非特异性扩增，提高了检测特异性和灵敏度，其具有较好的重复性。此外，相较于常规多重pcr多采用探针法来检测，导致检测成本较高，通过本发明的引物组，可采用染料法来检测，既可以多重pcr检测，也可以将每对引物独立使用检测样品，pcr反应结束后通过高分辨率扩增曲线得知扩增产物tm值保证检测的特异性，避免了探针法检测通道受限的缺点，极大地降低了检测成本。另一方面，本发明提供了一种用于检测呼吸道病原体的试剂盒，其包括如上所述的用于检测呼吸道病原体的引物组。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括如下试剂：pcr反应mix、ung酶、rnasefreewater、阳性对照品以及阴性对照品。其中，阳性对照品为分别含13种呼吸道病原体的保守序列dna的13种puc57质粒。进一步地，在本发明的一些实施方案中，阳性对照品包括如下puc57质粒：rsv阳性质粒、adv阳性质粒、m.p阳性质粒、b.pp阳性质粒、bov阳性质粒、c.p阳性质粒、hmpv阳性质粒、cov阳性质粒、hrv阳性质粒、ifa阳性质粒、ifb阳性质粒、hpiv阳性质粒或b.p阳性质粒。bov阳性质粒含有的bov保守序列如seqidno.27所示。cov阳性质粒含有的cov保守序列如seqidno.28所示。hpiv阳性质粒含有的hpiv保守序列如seqidno.29所示。hrv阳性质粒含有的hrv保守序列如seqidno.30所示。ifb阳性质粒含有的ifb保守序列如seqidno.31所示。b.p阳性质粒含有的b.p保守序列如seqidno.32所示。b.pp阳性质粒含有的b.pp保守序列如seqidno.33所示。c.p阳性质粒含有的c.p保守序列如seqidno.34所示。ifa阳性质粒含有的ifa保守序列如seqidno.35所示。hmpv阳性质粒含有的hmpv保守序列如seqidno.36所示。rsv阳性质粒含有的rsv保守序列如seqidno.37所示。adv阳性质粒含有的adv保守序列如seqidno.38所示。m.p阳性质粒含有的m.p保守序列如seqidno.39所示。上述的保护序列插入到puc57质粒的酶切位点为ecorv。puc57质粒的结构图如14所示。该试剂盒对常见的呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻/肠病毒(rhv/ehv)、副流感病毒(hpiv1-4)、冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)、博卡病毒(bov)、流感病毒a(ifua)、流感病毒b(ifub)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)、肺炎支原体(m.pneumonia)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)等实现检测，具有较高的灵敏度和特异性，成本低、使用方便以及较好的重复性等特点。另一方面，本发明提供了一种检测呼吸道病原体的方法，其包括：对待测样品使用上述的用于检测呼吸道病原体的引物组进行pcr扩增。进一步，在本发明的一些实施方案中，在pcr扩增体系中，各引物对的上游引物浓度为200-500nm；各引物对的下游引物浓度为200-500nm。进一步，在本发明的一些实施方案中，在pcr扩增体系中，各引物对的上游引物浓度为300nm；各引物对的下游引物浓度为300nm。进一步，在本发明的一些实施方案中，pcr扩增的退火温度为60-62℃。进一步，在本发明的一些实施方案中，pcr扩增体系中含有第1引物对-第13引物对。进一步，在本发明的一些实施方案中，pcr扩增体系含有如下组分：荧光染料、pcr反应mastermix以及ung酶(unituracil-dnaglycosylase)。进一步，在本发明的一些实施方案中，荧光染料为sybrgreeni。当然，需要说明的是，荧光染料也可以是其他类别的可与双链dna结合的荧光染料。进一步，在本发明的一些实施方案中，所述检测以非疾病诊断为目的。进一步，在本发明的一些实施方案中，上述的待测样品为从呼吸道(例如口腔、鼻腔等)上的分泌物中提取的基因组dna。本发明的有益效果包括：①特异性强，通过严谨的引物设计与验证，保证各病原体在使用多重pcr检测时无明显非特异性扩增，尽可能的避免出现假阳性或假阴性结果；②灵敏度高，在反应体系中，呼吸道合胞病毒、腺病毒、人偏肺病毒、鼻/肠病毒、博卡病毒、副流感病毒、流感病毒b、冠状病毒的检测灵敏度可达10copies左右，副流感病毒、流感病毒a、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的检测灵敏度可达100copies左右。③检测成本低，本发明的检测方法采用染料法代替探针法来做实时定量pcr检测，极大的降低了检测成本避免了探针法检测通道受限的缺点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的rsv阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图2为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的adv阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图3为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的m.p阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图4为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的b.pp阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图5为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的bov阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图6为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的c.p阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图7为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的hmpv阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图8为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的cov阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图9为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的hrv阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图10为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的ifa阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图11为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的ifb阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图12为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的hpiv阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图13为实施例1中灵敏度验证针对不同浓度梯度的b.p阳性质粒的荧光扩增结果(左侧为荧光曲线，右侧为标准曲线)。图14为puc57质粒的结构图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的用于检测呼吸道病原体的引物组，其包括如第1引物对-第13引物；其中，第1引物对包括seqidno.1～2所示的引物，第2引物对包括seqidno.3～4所示的引物，第3引物对包括seqidno.5～6所示的引物，第4引物对包括seqidno.7～8所示的引物，第5引物对包括seqidno.9～10所示的引物，第6引物对包括seqidno.11～12所示的引物，第7引物对包括seqidno.13～14所示的引物，第8引物对包括seqidno.15～16所示的引物，第9引物对包括seqidno.17～18所示的引物，第10引物对包括seqidno.19～20所示的引物，第11引物对包括seqidno.21～22所示的引物，第12引物对包括seqidno.23～24所示的引物，第13引物对包括seqidno.25～26所示的引物。第1引物对用于检测呼吸道合胞病毒(rsv)，第2引物对用于检测腺病毒(adv)，第3引物对用于检测人偏肺病毒(hmpv)，第4引物对用于检测鼻/肠病毒(rhv/ehv)，第5引物对用于检测副流感病毒(hpiv1-4)，第6引物对用于检测冠状病毒(cov-229e，sars，nl63，oc43)，第7引物对用于检测博卡病毒(bov)，第8引物对用于检测流感病毒a(ifua)，第9引物对用于检测流感病毒b(ifub)，第10引物对用于检测百日咳杆菌(bordetellapertussis)，第11引物对用于检测副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)，第12引物对用于检测肺炎支原体(m.pneumonia)，第13引物对用于检测肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)。上述各引物对针对的病原体、检测靶基因、扩增子大小、序列、以及扩增子tm值见下表2。表2注：序列中：y＝c/t，w＝a/t，b＝g/t/c，n＝a/t/c/g，r＝a/g。本实施例还提供了使用上述的引物组检测呼吸道病原体的方法，具体如下：1、临床样本采集①请病人先用生理盐水漱口。②拭子放入生理盐水中湿润。③鼻拭子采集：以拭子测量鼻孔到耳根的距离并以手指做标记，将拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻孔，直至手指触及鼻子，使拭子在鼻内停留15-30秒，然后轻轻旋转3次。咽拭子采集：由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔黏膜等处。④将拭子投入病毒运送培养基中，折断拭杆，使其完全置于管中。⑤旋紧管盖，做好标记，放入塑料袋密封好。⑥保存于4℃或冰上(短期保存)。2、临床样本核酸提取采用市场上在售的核酸提取试剂盒，按照其说明书要求进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其a260/a280应在1.6～2.0之间。3、多重pcr反应检测呼吸道病原体其反应液配置方法如下：1x含sybrgreeni的pcr反应mastermix；200nm～500nm上游引物(各上游引物浓度为300nm)；200nm～500nm下游引物(各下游引物浓度为300nm)；0.2unituracil-dnaglycosylase(ung酶)；阳性质粒dna或样品dna模板1μl；加rnasefreewater补齐至20μl。注意每次检测都要设置阳性对照和阴性对照。检测方法的扩增程序为：逆转录42℃10min，预变性95℃5min，变性95℃20s退火61℃20s延伸72℃20s共45cycles，融解曲线95℃5s60℃1min95℃continuous，降温40℃1min。第四步：结果判读实验结果成立的条件：阳性对照ct值≤30，且扩增曲线平滑呈s型，阴性对照无扩增或ct值≥40且无扩增曲线，满足该条件的基础之上，结果的判定标准如下表3所示。表3：13种呼吸道病原体检测结果的判读标准病原体类型阳性结果阴性结果rsvct<35且呈特定s型曲线ct>37hrvct<35且呈特定s型曲线ct>37ifbct<38且呈特定s型曲线ct>40advct<38且呈特定s型曲线ct>40covct<38且呈特定s型曲线ct>40hpivct<34且呈特定s型曲线ct>36m.pct<37且呈特定s型曲线ct>39bovct<36且呈特定s型曲线ct>38hmpvct<36且呈特定s型曲线ct>38c.pct<36且呈特定s型曲线ct>38ifact<37且呈特定s型曲线ct>39b.ppct<35且呈特定s型曲线ct>37b.pct<37且呈特定s型曲线ct>39表中：hrv代表鼻或肠病毒(rhv/ehv)，ifb代表流感病毒b(ifub)，cov代表冠状病毒(包括cov-229e，sars，nl63或oc43四种冠状病毒)，ifa代表流感病毒a(ifua)。实验例1(1)特异性验证采用各呼吸道病原体质粒标准品做交叉实验来验证其特异性以rsv为例，pcr8连管的同一行的孔中加入相同的引物对(每个管中仅加入1对引物，共13行，第1-13行分别对应加入的引物对为第1引物对-第13引物对)，同一列孔中加入相同的rsv阳性质粒(即含有rsv保守序列的puc57质粒)模板，保证每个引物对和13种呼吸道病原体中的任意一种都有独立的接触机会，通过这样的交叉实验，统计各ct值，验证引物的特异性。其反应液配置方法如下：1x含sybrgreeni的pcr反应mastermix；300nm上游引物；300nm下游引物；0.2unituracil-dnaglycosylase(ung酶)；阳性质粒dna(rsv阳性质粒、adv阳性质粒、m.p阳性质粒、b.pp阳性质粒、bov阳性质粒、c.p阳性质粒、hmpv阳性质粒、cov阳性质粒、hrv阳性质粒、ifa阳性质粒、ifb阳性质粒、hpiv阳性质粒或b.p阳性质粒)1μl；加rnasefreewater补齐至20μl。注意每次检测都要设置阳性对照和阴性对照。检测方法的扩增程序为：逆转录42℃10min，预变性95℃5min，变性95℃20s退火61℃20s延伸72℃20s共45cycles，融解曲线95℃5s60℃1min95℃continuous，降温40℃1min。结果见表4，由表4结果可以看出，每个引物对只与其对应的呼吸道病原体有扩增，表明各引物对的特异性良好。表4：第1-第13引物对的特异性验证实验结果注：表中所示数字为ct值(2)灵敏度验证采用各呼吸道病原体质粒标准品做交叉实验来验证其灵敏度与重复性，如表5所示，以rsv为例，将rsv阳性质粒标准品依次稀释为10^6、10^5、10^4、10^3、10^2、10^1copies，每个浓度做三个复孔，其反应液配置方法如下：1x含sybrgreeni的pcr反应mastermix；300nm上游引物；300nm下游引物；0.2unituracil-dnaglycosylase(ung酶)；阳性质粒dna1μl；加rnasefreewater补齐至20μl。注意每次检测都要设置阳性对照和阴性对照。检测方法的扩增程序为：逆转录42℃10min，预变性95℃5min，变性95℃20s退火61℃20s延伸72℃20s共45cycles，融解曲线95℃5s60℃1min95℃continuous，降温40℃1min。根据以上pcr体系和反应条件，验证各引物对的灵敏度和重复性。结果见表5和图1-图13，由表5和图1-13的结果可以看出，针对呼吸道合胞病毒、腺病毒、人偏肺病毒、鼻/肠病毒、博卡病毒、副流感病毒、流感病毒b、冠状病毒的引物对的检测灵敏度可达10copies左右，针对副流感病毒、流感病毒a、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的引物对的检测灵敏度可达100copies左右。此外，根据复孔计算出来的std可知，13种呼吸道病原体不同浓度测出的std均小于0.2，满足miqe对pcr实验的要求。表5：各引物对的灵敏度与重复性验证实验结果实验例2采用其他的对照引物进行交叉实验的如下表6所示：因sybr为非特异性染料，这些对照引物在做交叉实验时结果出现较多的非特异性扩增。由此说明，本发明的第1引物对-第13引物对用于检测呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、人偏肺病毒、鼻/肠病毒、副流感病毒、冠状病毒、博卡病毒、流感病毒a、流感病毒b、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的特异性较高。依次补充每种病毒对应的对照引物的序列：表6可以看出，本发明的第1引物对-第13引物对用于检测呼吸道病原体例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、人偏肺病毒、鼻/肠病毒、副流感病毒、冠状病毒、博卡病毒、流感病毒a、流感病毒b、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的特异性较高。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所<120>一种用于检测呼吸道病原体的引物组、试剂盒和方法<160>39<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gcwggyctaggcataatgggag22<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2catatgctttggctgcatc19<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gaygcytcggagtacctgag20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>nisa,c,g,ort<400>4cgccacngtggggttycta19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gcagtgacaccytcatcat19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gytgcactctytctgatcct20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7cccctgaatgyggctaacct20<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8cggacacccaaagtagtyggt21<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ccaagaggrggtatagaagg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10tgattgtctccttgraccat20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tgattgtctccttgraccat20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12gtaccaccaggcttaacata20<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13tcttggtggcattattggctca22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<400>14agctcgctctttatttcctag21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15acagatctcgaggctctcat20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列<400>16ccatttagggcattttggaca21<210>17<211>23<212>dna<213>人工序列<400>17ctgtttggagacacaattgccta23<210>18<211>22<212>dna<213>人工序列<400>18ggtcaaattctttcccaccgaa22<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<400>19tgagaaactggaaatcgccaaccc24<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<400>20atgggcgatcaattgctggac21<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列<400>21gatatcaacgggtgacggatc21<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列<400>22gtatgccaacccagctcga19<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列<400>23tttggtagctggttacgggaat22<210>24<211>23<212>dna<213>人工序列<400>24ggtcggcacgaatttcatataag23<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<400>25cgttattatccgccgcattt20<210>26<211>19<212>dna<213>人工序列<400>26cctgcagcaccttcccata19<210>27<211>400<212>dna<213>人工序列<400>27catgataaatcatattctgaattaataaaaagtggaaaaaatccttacttatatttcaat60aaagctgatgaaaaattcattgacgatttgaaaaacgactggtctcttggtggcattatt120ggctcaagtttctttaaacttaagcgcgccgtggctcctgctctagggaataaagagcga180gctcaaaaaagacacttttattttgcaaactcaaataaaggtgctaaaaaatcaaaaaac240aacgaacctaaaccaagcacctcaaaaatgtctgaaaatgaaattcaagaccaacagcca300tcagaacctaatgatggccaacgaggagggggaggaggtgcgaccggcagtgtgggaggg360gggaaaggttctggtgtgggtatatccacaggtggatggg400<210>28<211>400<212>dna<213>人工序列<400>28actatgacaggccgaatgttccatcaaaaatgtttgaagagtatagcagctacccgaggt60gttcctgttgttataggaaccactaaattttatggtggttgggacgatatgttacgtcat120cttataaaggatgttgacaaccctgttcttatgggttgggattatcctaaatgtgatcgt180gctatgccaaatattttgcgtattgttagtagtttagttttggcccgcaaacatgaattt240tgttgttcacatggtgatagattttatcgccttgcgaatgaatgtgctcaagttttgagt300gaaatagttatgtgtggcggttgctattatgttaagcctggtggtactagcagtggtgat360gcaactactgcttttgctaattctgtttttaatatatgtc400<210>29<211>400<212>dna<213>人工序列<400>29ctgtcttaattggagatatgaatcaacagctctatttggagaaacttgcaaccaaatatt60tggattaaataaattgtttaattggttacaccctcgtcttgaaggaagtacaatctatgt120aggtgatccttactgccctccatcagataaagaacatatatcattagaggatcaccctga180ttctggtttttatgttcataacccaagagggggtatagaaggattttgtcaaaaattatg240gacactcatatctataagtgcaatacatctagcagctgttagaataggcgtgagggtgac300tgcaatggttcaaggagacaatcaagctatagctgtaaccacaagagtaccaaacaatta360tgattacagaattaagaaggagatagtttataaagatgta400<210>30<211>400<212>dna<213>人工序列<400>30tcaggtggattttccctccactagtttggtcgatgaggctaggaattccccacgggtgac60cgtgtcctagcctgcgtggcggccaacccagcttatgctgggacgcccttttaaggacat120ggtgtgaagactcgcatgtgcttggttgtgagtcctccggcccctgaatgcggctaacct180taaccctagagccttatgccacgatccagtggttgtaaggtcgtaatgagcaattccggg240acgggaccgactactttgggtgtccgtgtttctcatttttcttcatattgtcttatggtc300acagcatatatatacatatactgtgatcatgggcgctcaggtttctacacagaaaagtgg360atctcacgaaaatcaaaacattttgaccaatggatcaaat400<210>31<211>400<212>dna<213>人工序列<400>31agcagaagcacgcactttcttaaaatgtcgctgtttggagacacaattgcctacctgctt60tcactaatagaagatggagaaggcaaagcagaactagctgaaaaattacactgttggttc120ggtgggaaagaatttgacctagattctgctttggaatggataaaaaacaaaaggtgccta180actgatatacaaaaagcactaattggtgcctctatatgctttttaaaacccaaagaccaa240gaaagaaaaaggagattcatcacagagcccctgtcaggaatgggaacaacagcaacaaag300aagaaaggcctaattctagctgagagaaaaatgagaagatgtgtaagctttcatgaagca360tttgaaatagcagaaggccacgaaagctcagcattactat400<210>32<211>500<212>dna<213>人工序列<400>32ctaggtgtgaagattcaataggttgtatgcatggttcatccgaaccggatttgagaaact60ggaaatcgccaaccccccagttcactcaaggagcccggccggatgaacacccataagcat120gcccgattgaccttcctacgtcgactcgaaatggtccagcaattgatcgcccatcaagtt180tgtgtgcctgaagcggcccgcgcctatggggtcaccgcgccgactgtgcgcaaatggctg240ggccgcttcctggctcagggccaggcgggcttggccgatgcgtcctcgcgcccgacggtc300tcgccccgagcgattgcgccggccaaggcgctggctatcgtggagctgcgccgcaagcgg360ctgacccaagcgcgcatcgcccaggcgctgggcgtgtcagccagcaccgtcagccgcgtc420ctggcccgcgccggtctgtcgcacctggccgacctggagccggccgagccggtggtgcgc480tacgagcatcaggcccccgg500<210>33<211>500<212>dna<213>人工序列<400>33gctggatcgcaagttgatggagtcgctgggaggctggcagggctatggcgtcgaacgcgt60ggaatggcccgaagacccagggcgcacgctgtcgatctatttgaagccaacggccaaggt120gatgctgtgcgagcagtgcggcgcgcggtgtcgccaggtgcatgagaccacggttcgacg180ggtgcgagatctgccgttattcgagtatcgggtcgttctgcacgtgccgcgccgacgctt240gtggtgtgagcaatgcggcggcccgcgcctggagcggcttgcctggctggggcgatatca300acgggtgacggatcggctggcgcaggcctgcagccaattgctgcaatcgagcaacgtgca360ggcggtggcgaggttcttcgagctgggttggcataccgtcaagacgctggacaaggctcg420gctgcgtgcgtcggtgcgcgaaccggattggtccaagatcgagtatttggcgatggacga480gtttgccctgcacaaagggc500<210>34<211>500<212>dna<213>人工序列<400>34atgaaaaaactcttaaagtcggcgttattatccgccgcatttgctggttctgtcggctcc60ttacaagccttgcctgtagg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