本发明属于天然活性成分提取领域，具体涉及一种昆虫生物活性蛋白的提取方法。
背景技术：
据统计，世界上的昆虫约有100多万种，其中已知的有3650余种可以食用。昆虫具有种类多、数量大、分布广、繁殖快的特点，而昆虫含有高蛋白质、低脂肪、低胆固醇，具有营养结构合理、肉质纤维少的优势，又因易于吸收，并优于植物蛋白质，而为世界各国所关注。据专家们预测，到21世纪，昆虫将成为仅次于微生物和细胞生物的第三大类蛋白质来源。
据报道，昆虫的蛋白质含量比牛肉、猪肉、鸡、鱼都要高。例如，干的黄蜂含蛋白质约81％、蜜蜂为43％、蝉为72％、草蜢为70％、蟋蟀为65％、稻蝗为60.08％、柞蚕蛹为52.14％、蝇蛆为60.88％、黄粉虫为63.19％、鼎实多刺蚁为64.50％、红胸多刺蚁为58.60％等；而且昆虫蛋白质中富含人体所需要的各种氨基酸，尤其含有人体不能自行合成的赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸。此外，虫体中还含有少量脂肪、糖类、多种维生素及矿物质等，还可以从昆虫表皮中提取几丁质，从血液中提取抗菌肽等有益成分。
现有技术中比较常见的昆虫蛋白提取方法一般都是采用碱法或盐法进行提取。其中，碱法提取虽然提取率较高，提取简单易行，生产成本较低，但在高碱的条件下，蛋白提取液中会生成赖一丙氨酸，这种物质不但有毒，而且还会引起营养物质的损失；而且高碱条件下还会造成蛋白质水解，并加速美拉德反应，产生黑褐色物质，从而造成提取液颜色的加深，提取物中非蛋白质含量增加，分离效果降低。除此之外，现有的碱法和盐法提取法对反应设备的要求都较高，并且会造成严重的环境污染，增加后处理的生产成本。
技术实现要素：
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种昆虫生物活性蛋白的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种昆虫生物活性蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，对提取车间进行杀菌处理；
(2)保持提取车间的温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速进行冰冻处理；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白进行冷冻干燥；
(5)将冷冻干燥后的昆虫蛋白置于co2超临界流体环境下进行处理，并于-4℃保存，即可。
所述步骤(1)中，所述杀菌步骤的温度为20-26℃。
所述昆虫蛋白的提取步骤包括水提法、醇提法、酸提法、碱提法、盐提法和/或酶解法。
所述步骤(3)中，所述冰冻处理步骤中控制温度低于-30℃。
所述冰冻步骤具体包括：将提取的昆虫蛋白置于-30至-40℃环境中进行冷冻1-2h；随后降低温度至-40至-50℃环境中进行冷冻处理1-2h。
所述步骤(4)中，所述冷冻干燥步骤温度为低于-20℃。
所述步骤(4)中，所述冷冻干燥步骤为在微真空条件下进行。
所述步骤(5)中，控制co2超临界流体环境的压力为20-30mpa、温度为30-40℃。
所述昆虫包括蜈蚣、全蝎、壁虎、蟾酥和/或蛇。
本发明还公开了由所述方法提取得到的昆虫生物活性蛋白。
本发明还公开了所述的昆虫生物活性蛋白在制备保健品、药物及食品领域中的应用。
本发明所述昆虫生物活性担保的提取方法，在现有昆虫蛋白提取方法的基础上，通过对提取车间进行隔离式的杀菌处理，有效确保提取环境无干扰性；同时通过控制提取过程中的温度控制，有效确保提取的温度性；更通过对提取蛋白液进行梯度冷冻及冷冻干燥的方式进行有效的保存，不仅可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。尤其是利用co2超临界环境对昆虫蛋白进行处理，更进一步确保了提取蛋白的活性不变质。
具体实施方式
实施例1蜈蚣蛋白提取
本实施例所述蜈蚣蛋白的提取基于现有技术通常采用的酶解法进行，如中国专利cn107669844a中记载的蜈蚣蛋白的提取方案，具体包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，确保隔离空气并隔离工作人员的情况下，控制环境温度20-26℃，对提取操作的车间进行杀菌处理；
(2)随后保持整个提取车间维持密闭空间状态，控制提取车间的室内温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；具体提取步骤包括：
将鲜活蜈蚣成虫用液氮冷冻30分钟后取出研磨成粉末，并将粉末倒入一离心管中，向所述离心管中加入磷酸盐缓冲液和0.04倍体积的蛋白酶k水溶液，55℃条件下处理12分钟；
将所述离心管置于沸水中煮7分钟，然后置于冰上冷却，摇匀后再4000r/min离心8min，取上清液；
向所述上清液中加入1.4倍体积的无水乙醇，混匀后再13000r/min离心20min，取上层蛋白液，即为所需的蜈蚣蛋白液；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速置于-30℃环境中进行冷冻2h；随后继续降低温度至-40℃继续进行冷冻处理2h，得到冷冻后的昆虫蛋白；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白在微真空条件下(真空度0.05-0.1mpa)，于-25℃进行冷冻干燥2h；
(5)将干燥后的所述蜈蚣昆虫蛋白置于密闭容器内，排出空气，并向容器中充入co2，控制密闭容器内的压力为20-30mpa、温度为30-40℃，使其处于超临界状态下进行处理，泄压后即得所需的蜈蚣昆虫蛋白，并于-4℃进行保存。
对比例1
本对比例所述蜈蚣蛋白的提取方法同实施例1，其区别仅在于，在进行提取时，对于提取车间并不进行额外的杀菌处理，同时提取得到的蜈蚣蛋白液直接于常规-4℃进行保存，而不进行步骤(3)-(5)的处理。
经测定，实施例1和对比例1制得蜈蚣蛋白均有较好的抗炎免疫活性，相比较而言，实施例1中制得的蜈蚣蛋白的抗炎活性略优于对比例1中蛋白活性。另外，将所制得蜈蚣蛋白各自保存一个月后，本实施例制得蜈蚣蛋白的活性无减弱，而对比例1中制得蜈蚣蛋白活性则大幅减弱。可见，本发明所述昆虫蛋白提取方法可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。
实施例2
本实施例所述全蝎蛋白的提取基于现有技术通常采用的水提法进行，
如中国专利cn103396472a中记载的全蝎蛋白的提取方案，具体包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，确保隔离空气并隔离工作人员的情况下，控制环境温度20-26℃，对提取操作的车间进行杀菌处理；
(2)随后保持整个提取车间维持密闭空间状态，控制提取车间的室内温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；具体提取步骤包括：
取全蝎药材若干，加水浸泡30min，湿法超微粉碎提取10min，提取液8000r/min离心10min后取上清液，过pes6000分子量超滤膜(截留分子量6000da)，用水洗涤截留液至其透过液中无小分子核酸类成分(hplc法检测)。截留液加入核酸沉淀剂聚乙烯亚胺(pei)(0.2mg/ml)，放置1h后，12000r/min离心取上清，加入硫酸铵至其饱和度为70％，0-4℃放置过夜(12h)，溶液8000r/min离心10min，取沉淀，得到全蝎粗蛋白；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速置于-40℃环境中进行冷冻1h；随后继续降低温度至-50℃继续进行冷冻处理1h，得到冷冻后的昆虫蛋白；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白在微真空条件下(真空度0.05-0.1mpa)，于-25℃进行冷冻干燥2h；
(5)将干燥后的所述全蝎昆虫蛋白置于密闭容器内，排出空气，并向容器中充入co2，控制密闭容器内的压力为20-30mpa、温度为30-40℃，使其处于超临界状态下进行处理，泄压后即得所需的全蝎昆虫蛋白，并于-4℃进行保存。
对比例2
本对比例所述全蝎蛋白的提取方法同实施例2，其区别仅在于，在进行提取时，对于提取车间并不进行额外的杀菌处理，同时提取得到的全蝎蛋白液直接于常规-4℃进行保存，而不进行步骤(3)-(5)的处理。
经测定，实施例2和对比例2制得全蝎蛋白均有较好的溶血栓活性，相比较而言，实施例2中制得的全蝎蛋白的溶栓活性略优于对比例2中蛋白活性。另外，将所制得全蝎蛋白各自保存一个月后，本实施例制得全蝎蛋白的活性无减弱，而对比例2中制得全蝎蛋白活性则大幅减弱。可见，本发明所述昆虫蛋白提取方法可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。
实施例3
本实施例所述蟾酥蛋白的提取基于现有技术通常采用的醇提法进行，
如中国专利cn102210711a中记载的蟾酥蛋白的提取方案，具体包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，确保隔离空气并隔离工作人员的情况下，控制环境温度20-26℃，对提取操作的车间进行杀菌处理；
(2)随后保持整个提取车间维持密闭空间状态，控制提取车间的室内温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；具体提取步骤包括：
取蟾酥洗净，加10倍量95％(w/w)乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，过滤后合并滤液，回收乙醇，浓缩得到蟾酥脂溶性提取物蛋白液；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速置于-35℃环境中进行冷冻1.5h；随后继续降低温度至-45℃继续进行冷冻处理1.5h，得到冷冻后的昆虫蛋白；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白在微真空条件下(真空度0.05-0.1mpa)，于-25℃进行冷冻干燥2h；
(5)将干燥后的所述蟾酥昆虫蛋白置于密闭容器内，排出空气，并向容器中充入co2，控制密闭容器内的压力为20-30mpa、温度为30-40℃，使其处于超临界状态下进行处理，泄压后即得所需的蟾酥昆虫蛋白，并于-4℃进行保存。
对比例3
本对比例所述蟾酥蛋白的提取方法同实施例3，其区别仅在于，在进行提取时，对于提取车间并不进行额外的杀菌处理，同时提取得到的蟾酥蛋白液直接于常规-4℃进行保存，而不进行步骤(3)-(5)的处理。
经测定，实施例3和对比例3制得蟾酥蛋白均有较好的抗肺部肿瘤活性，相比较而言，实施例3中制得的蟾酥蛋白的抗肿瘤活性略优于对比例3中蛋白活性。另外，将所制得蟾酥蛋白各自保存两个月后，本实施例制得蟾酥蛋白的活性无减弱，而对比例3中制得蟾酥蛋白活性则大幅减弱。可见，本发明所述昆虫蛋白提取方法可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。
实施例4
本实施例所述壁虎蛋白的提取基于现有技术通常采用的方法进行，如中国专利cn104740594a中记载的壁虎蛋白的提取方案，具体包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，确保隔离空气并隔离工作人员的情况下，控制环境温度20-26℃，对提取操作的车间进行杀菌处理；
(2)随后保持整个提取车间维持密闭空间状态，控制提取车间的室内温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；具体提取步骤包括：
将1000g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置(200520108339.x)中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1-5mpa，时间10-60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆虫被膨化成粉体；
将膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置(201210179076.6)中，加入1-10kg液态二氧化碳、100-500ml甲醇及100-300gnh3·h2o，加压至2-10mpa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10-0℃，时间10-30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-nh3·h2o的混合液；
收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0.5-50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；
溶液用孔径50-100nm的超滤机超滤处理，压力0.3-0.8mpa，温度为常温，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液；
超滤溶液用20％乙腈溶解，c18固相萃取柱用50-100％乙腈活化预处理，加0.02-0.1％三氟乙酸-水平衡，用10％乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10-80％的乙腈梯度脱洗，流速1-10ml/min，收集相关梯度的洗脱成分；
将洗脱成分溶解在4.5％聚乙二醇-7％葡聚糖t500(重量比)溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱(200920274485.8)分离纯化，超声波功率0.2-3.0kw，频率500-1000khz，流速50-500ml/min，紫外检测器波长260-280nm；得到纯化后的壁虎蛋白液；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速置于-35℃环境中进行冷冻1.5h；随后继续降低温度至-45℃继续进行冷冻处理1.5h，得到冷冻后的昆虫蛋白；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白在微真空条件下(真空度0.05-0.1mpa)，于-25℃进行冷冻干燥2h；
(5)将干燥后的所述壁虎昆虫蛋白置于密闭容器内，排出空气，并向容器中充入co2，控制密闭容器内的压力为20-30mpa、温度为30-40℃，使其处于超临界状态下进行处理，泄压后即得所需的壁虎昆虫蛋白，并于-4℃进行保存。
对比例4
本对比例所述壁虎蛋白的提取方法同实施例4，其区别仅在于，在进行提取时，对于提取车间并不进行额外的杀菌处理，同时提取得到的壁虎蛋白液直接于常规-4℃进行保存，而不进行步骤(3)-(5)的处理。
经测定，实施例4和对比例4制得壁虎蛋白均有较好的抗淋巴肿瘤活性，相比较而言，实施例4中制得的壁虎蛋白的抗肿瘤活性略优于对比例4中蛋白活性。另外，将所制得壁虎蛋白各自保存两个月后，本实施例制得壁虎蛋白的活性无减弱，而对比例4中制得壁虎蛋白活性则大幅减弱。可见，本发明所述昆虫蛋白提取方法可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。
实施例5
本实施例所述蛇蛋白的提取基于现有技术通常采用的方法进行，如中国专利cn103919810a中记载的蛇蛋白的提取方案，具体包括如下步骤：
(1)在全封闭状态下，确保隔离空气并隔离工作人员的情况下，控制环境温度20-26℃，对提取操作的车间进行杀菌处理；
(2)随后保持整个提取车间维持密闭空间状态，控制提取车间的室内温度为30-38℃进行昆虫蛋白的提取；具体提取步骤包括：
称取蕲蛇饮片(购自浙江中医药大学饮片厂)5g，粉碎，过100目，制成蕲蛇粉末，60℃烘干30分钟，实际重量为4.976g，置于密闭容器，加入100mlmiliq超纯水，混匀，60℃煎煮40分钟，将提取液转移至离心管(50ml)，4℃、1200×g离心10min，取上清即得粗蛋白；将粗蛋白冷却到0℃，逐步加入固体硫酸铵至饱和度60％，4℃静置2小时，1200×g离心30分钟，收集沉淀，miliq超纯水重新溶解沉淀，装入透析袋(截留分子量1000)中，以miliq超纯水为透析液，4℃透析脱盐，多次更换透析液至透过液测不到硫酸铵，收集截留液用0.45μm滤膜过滤除菌，即为所需蛋白提取液；
(3)将提取得到的昆虫蛋白液迅速置于-35℃环境中进行冷冻1.5h；随后继续降低温度至-45℃继续进行冷冻处理1.5h，得到冷冻后的昆虫蛋白；
(4)随后将冰冻后的昆虫蛋白在微真空条件下(真空度0.05-0.1mpa)，于-25℃进行冷冻干燥2h；
(5)将干燥后的所述蛇昆虫蛋白置于密闭容器内，排出空气，并向容器中充入co2，控制密闭容器内的压力为20-30mpa、温度为30-40℃，使其处于超临界状态下进行处理，泄压后即得所需的蛇昆虫蛋白，并于-4℃进行保存。
对比例5
本对比例所述蕲蛇蛋白的提取方法同实施例5，其区别仅在于，在进行提取时，对于提取车间并不进行额外的杀菌处理，同时提取得到的蕲蛇蛋白液直接于常规-4℃进行保存，而不进行步骤(3)-(5)的处理。
经测定，实施例5和对比例5制得蕲蛇蛋白均有较好的抗炎及消肿镇痛活性，相比较而言，实施例5中制得的蕲蛇蛋白的抗炎及消肿镇痛活性略优于对比例5中蛋白活性。另外，将所制得蕲蛇蛋白各自保存两个月后，本实施例制得蕲蛇蛋白的活性无减弱，而对比例5中制得蕲蛇蛋白活性则大幅减弱。可见，本发明所述昆虫蛋白提取方法可有效提高提取蛋白的活性，并且有助于保持提取蛋白的活性不变质。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。