一种放流中国对虾资源的调查方法与流程

本发明属于海水动物放流技术领域，具体地涉及一种放流中国对虾资源的调查方法，即一种全新的可对放流中国对虾的时空分布与资源动态变化实现精确调查的方法。

背景技术：

中国对虾(fenneropenaeuschinensis)是我国特有的一年生大型经济虾类，主要分布在黄渤海沿岸海区，经济效益显著。二十世纪八十年代以来，由于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生中国对虾的盲目需求等综合因素的影响，中国对虾野生资源量急剧萎缩。为保护、恢复中国对虾种群和渔业资源，我国于1984年开始在特定海区进行中国对虾移殖/增殖放流，每年放流约30亿尾仔虾。

经过连续多年的大规模种苗放流，中国对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法精确地掌握放流群体的时空分布与资源量动态变化，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是中国对虾放流迫切需要解决的重大问题。精确掌握物种的时空分布和种群动态变化是合理利用和开发渔业资源的前提。然而，对于研究人员与政策制定者而言，收集水生生物种群分布与种群动态变化的精确数据是其面临的最大挑战。传统的资源调查方法费时费力且灵敏度低下，往往不能真实地反映出中国对虾的时空分布与种群的资源量动态变化情况，这主要是由于中国对虾的生活史类型导致：1)在增殖放流前期，中国对虾本底资源量匮乏，运用传统的资源调查方法对其进行检测效率低且效果差；2)在增殖放流初期，中国对虾游泳能力薄弱，用传统的调查方法不能准确地获取有关其种群分布与资源量动态变化的信息；3)目前国内渔业资源调查主要以底拖网为主，而底拖网并非中国对虾渔业资源的调查方式。因此，探索一种能够准确检测中国对虾时空分布与资源量动态变化的方法至关重要。并且该方法应该具备以下特征：1)能够准确地检测到中国对虾而不受其他物种的干扰；2)检测的最终结果不受到人为主观因素的影响。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可对放流中国对虾的时空分布与种群动态变化实现快速且精确的调查方法，从而掌握中国对虾自放流后在自然海域中的分布与种群动态变化，以精确评估中国对虾放流效果，进而制定科学的放流规划、有效促进野生中国对虾种群资源的恢复。

本发明的放流中国对虾资源的调查方法，包括以下的步骤

1)自中国对虾放流后，在调查海域采集水样，并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤2l海水进行样品的富集，其中每个采样点做3次技术重复，收集的样品准备进行edna的提取；

2)提取步骤1)收集样品的edna，并将edna稀释到定量pcr所要求的浓度范围以内；

3)采用荧光定量检测系统进行样品edna的定量分析，荧光定量检测系统根据荧光值的变化生成中国对虾mtdnacoi基因的标准曲线与扩增曲线,从而自动得出未知浓度edna样品中中国对虾mtdnacoi基因的拷贝数；根据定量pcr的结果最终确定中国对虾在自然海域中的时空分布与资源量动态变化；

其中所述的中国对虾edna检测技术中实时荧光定量pcr的引物以及探针的序列如下：

正向序列coidf为：aggggtaggaacaggatgaac(seqidno:1)、

反向序列coidr为：gacaccagctagatgcagcg(seqidno:2)、

探针probe为：5＇fam-tcagctagaattgctcatgccggagcttcagt-3＇bhq1(seqidno:3)；

进一步，所述的实时荧光定量pcr的反应体系为：20μl反应体系，其中包括10μl2×taqmanfastqpcrmastermix，0.4μlforward引物(10μmol·l^–1)，0.4μlreverse引物(10μmol·l^–1)，0.4μl探针(10μmol·l^–1)，2μl模板dna，6.8μlpcr-gradewater；

进一步，所述的实时荧光定量pcr的扩增反应程序为2步法：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃退火延伸34s，40个循环。

其中在定量分析时，所使用的中国对虾edna检测技术中制备标准品质粒dna所用的普通pcr引物序列如下：

正向序列coipf为：ttgtagttacagcccacgct(seqidno:4)，

反向序列coipr为：aaattatcccgaaggcgggt(seqidno:5)；

进一步，所述的普通pcr的反应体系为：50μl反应体系，其中10×taqbuffer5μl，dntps(各2.5mm)1μl，正反向引物(coipf/coipr)(10mm)各1μl，taqdnapolymerase(5u/μl)1μl，模板dna(50ng/μl)2μl,mgcl2(25mm)3μl，ddh2o36μl；

进一步，所述的第一组引物的pcr的扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明能够实现对整个海域所有放流群体的精确检测，为增殖放流效果的评价奠定了基础。与现有技术相比的优势主要在以下几个方面：1)灵敏度高，该技术不受种群密度与生活史特征的影响，具有较高的检出率；2)经济高效，省时省力，该技术比传统方法需要更少的物力、财力、人力以及时间；3)对生态系统干扰低，技术只需要对采集的水样进行分析便可以得到结果，对生物及生态系统干扰较低；4)对调查人员的要求低，该技术只需要分子生物学的方法即可，而不要求调查人员具有很强的形态学分类鉴定能力；5)采样受限小，该技术所要求的采样方法简单且要求低，受外界影响因素更小。

本发明用于放流个体的检测方法是通过特异性扩增水体环境中中国对虾释放的dna来完成的，其主要来源于中国对虾的排泄物以及虾体的脱落物，对处于任何生长时期的中国对虾均能够起到有效的检测效果，且不需要采集任何中国对虾标本，通过实时荧光定量pcr不仅能够对中国对虾的有无进行判断，而且能够通过中国对虾释放的dna的拷贝数推测出中国对虾的生物量，能够快速且准确地对中国对虾的时空分布与种群动态变化进行检测，进而对增殖放流的效果进行评估。

附图说明

图1：中国对虾edna降解与时间之间的关系图；

图2：不同滤膜类型及过滤水量所富集的edna的浓度图；

图3：不同滤膜类型及过滤水量所富集的edna的产量图；

图4：2017年6月使用本发明方法对渤海中国对虾的调查图。

具体实施方式

为了解决背景技术中所列出的需要具备的2个条件：1)能够准确地检测到中国对虾而不受对虾属其他亲缘物种的干扰；2)检测的最终结果不会受到人为主观因素的影响，不会由于人为因素而导致结果误判。edna(environmentaldna,edna)是指从皮肤、粘液、唾液、精子、分泌物、卵、粪便、尿液、血液、根、叶、果实、花粉和腐烂体等释放出来的游离的dna分子。本发明对采集样品的edna进行检测，通过建立的方法来有效的收集放流中国对虾的edna，通过设计的高度特异性的引物，利用实时荧光定量pcr(taqman探针法)扩增来自海洋环境的edna，根据pcr反应的最终结果进行相关的定性与定量分析研究，从而推测出自然海域中国对虾的时空分布与种群的动态变化。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：中国对虾edna检测技术的建立以及优化

一、中国对虾edna在水体中存留时间的检测

edna极易降解且在环境中含量极低，因而其在环境中的存留时间将会直接影响后期的定性与定量分析。为了能够将edna技术准确地应用到水生生态系统的研究领域中，探究edna在水体中的存留时间显得尤为重要。一般而言，水生动物释放的edna在水体的存留时间为7-30天，但是不同的生物种类其生活史特征不同，释放edna的速率不同，释放的edna量的多少与edna片段的大小也各不相同。因此，对于不同的物种而言，其释放的dna在环境中的存留时间是不一样的。申请人研究发现，以中国对虾为研究对象，从中国对虾养殖池内取25l水样用提前消过毒的无菌白色塑料桶带回实验室，室温保存(桶内用充气泵保持充气直至取样完毕)，期间每隔24h从水桶内取15ml水样，装进50ml无菌离心管内，同时在离心管内加3mol/l的醋酸钠溶液1.5ml与无水乙醇33ml，每次取三个平行样本，-20℃保存直至进行edna提取，edna提取完成后应用实时荧光定量pcr(taqman探针法)定量分析水环境中edna随时间的降解情况，结果表明：当edna的释放源头被去除后，edna在水体中的含量与时间呈负相关关系，其在环境中的存留时间为一个月左右(图1)。通过探索中国对虾释放到水体中的dna的存留时间，后期即可为合理规划物种的定性检测与定量评估提供理论依据，将人为因素造成的实验误差降到最低。

二、edna技术操作流程的建立及优化

edna检测中，由于物种之间的差异，其释放的edna量的多少与edna片段的大小各不相同。因此，本发明设计了不同edna富集与提取方法，以期达到最佳的研究效果。以中国对虾为研究对象，设计了如下方案：采用滤膜法富集edna，选取直径为47mm的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、尼龙膜共4四种材质的滤膜，每种滤膜根据其孔径大小设置0.45μm、0.8μm、1.2μm、5μm共4个梯度，取样水量设置500ml、1l、2l三个梯度，结合dneasybloodandtissuekit(qiagen,hilden,germany)试剂盒提取edna。edna提取完成后，用实时荧光定量pcr(taqman探针法)检测每张滤膜上富集的edna的拷贝数，根据拷贝数的大小确定最适于中国对虾edna富集的滤膜种类、滤膜孔径大小以及取水样体积。最终结果显示：滤膜材质、滤膜孔径大小及取样水体体积均对中国对虾的定性与定量分析具有一定的影响，其中0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤2l水样能够检测到的dna浓度最高(图2)，为1750copies/μl，且其edna产量也最大(图3)，并依据此建立了一套中国对虾edna技术的操作流程，提高中了国对虾的检出率，为后续中国对虾的分布监测及生物量评估提供了基础。

实施例2：中国对虾edna检测技术在渤海生态系统中的应用

2017年6月，在进行渤海渔业资源调查时，利用本发明方法对渤海的放流中国对虾进行了时空分布的检测与相对资源量的分析。具体实施方案为：根据渔业资源调查时设置的54个调查站位，在每个站位取2l表层海水(0m-1.0m)并用0.45μm的玻璃纤维滤膜结合真空过滤装置过滤，进行edna的富集，每个站点做3次技术重复，过滤完成后，每个滤膜样本卷起来用独立的锡箔纸包裹起来-20℃避光保存带回实验室。在实验室用dneasybloodandtissuekit(qiagen,hilden,germany)试剂盒进行edna提取，提取完成将edna稀释到实时荧光定量pcr要求的浓度范围以内；用传统的酚-氯仿-异戊醇方法进行中国对虾基因组dna的提取，提取完成后用引物对coipf/coipr(序列见表1)进行基因组dna的pcr扩增(pcr的反应体系为：50μl反应体系，其中10×taqbuffer5μl，dntps(各2.5mm)1μl，正反向引物(coipf/coipr)(10mm)各1μl，taqdnapolymerase(5u/μl)1μl，模板dna(50ng/μl)2μl,mgcl2(25mm)3μl，ddh2o36μl；pcr的扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。)，并将pcr产物纯化，连接到pmd-18-t质粒载体上，转化入大肠杆菌感受态细胞中构建pmd-18-t-coi重组质粒，在lb固体平板培养基上过夜培养，挑取单菌落扩大培养进行重组质粒dna提取，最后将重组质粒dna稀释到特定浓度作为标准品dna；随即用bbi生命科学有限公司的2×taqmanfastqpcrmastermix(lowrox)实时荧光定量pcr试剂盒结合引物对coidf/coidr(序列见表1)进行edna的定量分析(pcr的反应体系为：20μl反应体系，其中包括10μl2×taqmanfastqpcrmastermix，0.4μlforward引物(10μmol·l^–1)，0.4μlreverse引物(10μmol·l^–1)，0.4μl探针(10μmol·l^–1)，2μl模板dna，6.8μlpcr-gradewater；pcr的扩增反应程序为2步法：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃退火延伸34s，40个循环。)。最终结果显示：在渤海渔业资源调查中设置的54站位，均能够检测到中国对虾(图4)，而底拖网调查的结果为只有一个站点能够检测到中国对虾且只有一只中国对虾(并非当年所放流的中国对虾)，证明了此方法的在渔业资源调查中具有极大的潜力。

表1中国对虾mtdnacoi基因pcr扩增引物信息

结果表明本发明的方法在中国对虾的检测中具有极大的潜力，非常适合将其应用到渔业资源调查中来，其具有底拖网所没有的极高的灵敏性，在中国对虾的时空分布与种群动态变化检测方面具有非常广泛的应用前景。可应用于中国对虾放流实践中放流个体的时空分布检测与种群动态变化检测，进而实现对放流效果的精确评估。