一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物，具体的所述生物标志物为linc01929。

背景技术：

乳腺癌(breastcancer)是女性最普遍的恶性肿瘤之一，通常发生在乳腺上皮组织。据资料统计，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％(darabi,hetal.breastcancerriskpredictionandindividualisedscreeningbasedoncommongeneticvariationandbreastdensitymeasurement.breastcancerres,2012.14(1):p.r25.)。全球每年有135万新增加的乳腺癌，其中有42万死亡，每年递增是2％(wen,w.,etal.,predictionofbreastcancerriskbasedoncommongeneticvariantsinwomenofeastasianancestry.breastcancerres,2016.18(1):p.124.)。中国每年有4万多妇女死于本病，虽然不是乳腺癌高发国家，但是其增长速度远远高于其他国家。它的发病影响因素较多，遗传易感性和基因与环境相互作用均与其发生、进展和转移密切相关(mavaddat,netal.,predictionofbreastcancerriskbasedonprofilingwithcommongeneticvariants.jnatlcancerinst,2015.107(5).)。虽然通过之前的研究已经发现了多种致癌基因和抑癌基因，使乳腺癌的诊断率有所提高，治疗效果有所改善，但并不能完全解决问题。因此需要对肿瘤发生的分子机制深入了解，为乳腺癌患者的治疗提供新的有效的治疗方法。在没有完全找到乳腺癌的发病原因之前，乳腺癌的早诊断、早治疗，是降低乳腺癌死亡率的关键。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrnas)是一类缺乏蛋白编码功能的核苷酸转录本，包含200至100000核苷酸，具有高度保守的序列元件和特定的空间二级结构，存在于细胞核或胞浆内(hajjari,m.,a.khoshnevisan,andyk.shin,molecularfunctionandregulationoflongnon-codingrnas:paradigmswithpotentialrolesincancer.tumourbiol,2014.35(11):p.10645-63.)。lncrnas在表观遗传调控、选择性剪接、rna衰变、细胞分化、细胞周期控制及癌细胞转移和耐药性等细胞调控过程中发挥着重要的作用(richtig,g.,etal.,functionandclinicalimplicationsoflongnon-codingrnasinmelanoma.intjmolsci,2017.18(4).)。随着对lncrnas研究的深入，越来越多的证据表明lncrnas参与各种生物过程和疾病发病机理，尤其是肿瘤发生，在多种人类肿瘤中，lncrnas都普遍存在着差异表达的现象。到目前为止，lncrnas在肿瘤方面已取得了不小的进展，如hotair和gws5，已经分别被确定为致癌基因和抑癌因子。然而，lncrnas的数量十分庞大，只有少数与癌症相关的lncrnas被报道出来，且针对lncrnas在乳腺癌中的研究仍处于起步阶段。因此，那些对乳腺癌发生和发展至关重要的新型的lncrnas还有待被研究者们不断发现及探索。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与乳腺癌相关的lncrna标志物，将其应用到临床中，从而实现乳腺癌的早期诊断和治疗，进行有效干预，提高患者的生存率和生存质量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了linc01929的应用，用于制备诊断早期乳腺癌的产品。

进一步，所述产品包括检测样本中linc01929表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括通过反转录pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片技术检测linc01929表达水平的试剂。

本发明提供了一种诊断乳腺癌的产品，包括芯片或试剂盒，其中，所述芯片或试剂盒包括检测linc01929表达水平的试剂。

进一步，所述芯片中检测linc01929表达水平的试剂包括特异性识别linc01929基因的探针；所述试剂盒中检测linc01929表达水平的试剂包括特异性扩增linc01929基因的引物或特异性识别linc01929基因的探针。

进一步，特异性扩增linc01929基因的引物序列如seqidno.1～2所示。

在本发明中，试剂盒还包括容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，以及附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

本发明提供了linc01929在构建预测早期乳腺癌的计算模型中的应用。

正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌的风险或与有助于评估早期乳腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌风险的个体、具有乳腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

本发明提供了linc01929在筛选治疗乳腺癌的候选药物中的应用。

进一步，筛选步骤如下：

用待筛选物质处理表达或含有linc01929基因的体系；和

检测所述体系中linc01929基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制linc01929基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗乳腺癌的候选药物。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对linc01929基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了linc01929在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括linc01929的抑制剂。所述抑制剂选自：以linc01929或其转录本为靶序列、且能够抑制linc01929基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包括(但并不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

本发明的药物组合物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

在本发明中，“标志物”、“生物标志物”“基因标志物”可以通用，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，转录linc01929的基因是位于人18号染长臂2区1带上，id为101927229，本发明中的linc01929包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的linc01929如genebank中公开的nr_110743.1所示。熟悉本领域的技术人员可以了解，对测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因组进行比对，只要测序片段可以比对到相关的基因上，就可以看做是该基因的表达。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

lncrna水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)、核糖核酸酶保护试验和基于pcr的方法。

所述测定方法可以根据所需lncrna信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)和基于pcr的方法(例如，qrt-pcr)。qrt-pcr等方法也可以对样品中lncrna的量进行准确定量。

本发明的优点与有益效果：

本发明首次发现了linc01929的差异表达与乳腺癌的发生发展相关，通过检测linc01929的表达水平可以判断受试者是否患有早期乳腺癌。

本发明公开了一种筛选治疗乳腺癌的候选药物的方法，通过检测待选物质是否可以下调linc01929的表达水平来判断待筛选物质是否为治疗乳腺癌的候选药物。

附图说明

图1是利用qpcr检测linc01929基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与早期乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集30例i-ii期的乳腺癌组织样本及与之相对应的癌旁组织样本，从中随机选取5例进行高通量测序，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，排除其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解；然后加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min后，4℃，11000rpm离心15min；将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min后4℃，11000rpm离心15min；用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次，4℃，8000rpm离心5min；然后将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

3、总rna定量与纯度分析

将提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、构建cdna文库

使用epicentre的ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna；对完整的rna序列，利用金属离子进行随机打断，将rna随机断裂成200bp左右的小片段；采用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建。

5、测序

使用illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的lncrna，使用r-3.3.3工具中的deseq2的对reads数进行差异表达分析，差异表达lncrna筛选标准：fdr<0.05，abs(log2fc)>2。

7、结果

结果显示，与癌旁组织相比，linc01929在早期乳腺癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2qpcr测序验证linc01929基因的差异表达

1、利用前面收集的30例i-ii期乳腺癌的组织样本和癌旁组织样本对linc01929进行大样本qpcr验证。

2、rna提取操作步骤同实施例1

3、qpcr

1)逆转录反应

采用tiangen公司的fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录。

首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据genebank中linc01929基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，在进行linc01929的引物设计时，选择不同转录产物序列的共同序列进行设计，具体引物序列如下：

linc01929基因：

正向引物为5’-tcctctcataccactaacatc-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-gcaccaacttcaagacaat-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

qpcr结果如图1所示，与癌旁组织相比，linc01929在早期乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)；其中表达上调的癌组织样本有29例，无显著性差异的有1例，提示linc01929可作为分子标志物应用于乳腺癌的诊断和治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>赣南医学院第一附属医院

<120>一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcctctcataccactaacatc21

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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