长链非编码RNA在肿瘤中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及长链非编码rna在肿瘤中的应用，具体的涉及loc105378728在直肠腺癌诊疗中的应用。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcancer,crc)是最常见的恶性肿瘤之一，其在全球的发病率与死亡率均位于第三位，每年约有130万新发病例。在我国，随着人们物质生活水平的丰富，土地与水资源的污染，人口老龄化的加剧，近年来结直肠癌的发病率与死亡率均呈上升趋势，且患病年龄明显提前，已经成为威肋、人类健康的常见恶性疾病之一。直肠腺癌属于直肠癌的一种，是指齿状线以上至乙状结肠与直肠移行部之间的腺癌，占结直肠癌的75％～85％，是消化道常见的恶性肿瘤。我国直肠癌的发病率占大肠癌总发病率的60％～70％，但是病因至今仍不甚清楚。缺乏早期预防手段，由于诊断技术的限制，结直肠癌的早期诊断率较低，很多患者都是在出现临床症状后就医，此时往往已到病情晚期，丧失了最佳治疗时机。因此，依托基础研究，探索新的可靠的无创的早期诊断方法是未来研究的一个重要方向。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类长度介于200到100,000个核苷酸之间的没有编码功能的rna(kongh,wuy,zhum,etal.longnon-codingrivas:novelprognosticbiomarkersfarlivermetastasesinpatientswithearlystagecolorectalcancer.oncotarget.2016aug42；7(31):50428-36.)。长链非编码rna因为没有编码蛋白质的功能，曾经一度被认为是基因转录和翻译过程中的“噪音”，而未被重视。然而有越来越多的研究发现长链非编码rna其实参与了结直肠癌的各个生物学和病理过程，包括凋亡、增殖和转移(huartem.theemergingroleof1ncrnasincancer.naturemedicine.2015nov；21(11):1253-61.)。除此之外，许多近年来的证据表明长链非编码rna能够作为竞争性内源性rna(competingendogenousrnas,cernas)或被称为分子海绵，通过吸附或调控小rna(mirna)来参与基因和蛋白的调控。虽然对长链非编码rna的研究不断地得到深入，对其功能的了解也越来越深，但是长链非编码rna的大多数功能仍然有待进一步地阐明。

长链非编码rna在基因调控中扮演着关键的角色，影响着包括细胞增殖、迁移和基因组的稳定性等各个方面的生物活性，并且也有越来越多的证据显示许多长链非编码rna在结直肠癌的调控中扮演着关键的角色。研究与直肠腺癌相关的lncrna，为直肠腺癌的早期诊断和治疗提供了新的途径。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与直肠腺癌发生发展相关的生物标志物，以及其在诊断和治疗直肠腺癌中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种检测试剂，所述试剂为检测loc105378728水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别loc105378728的探针；或

特异性扩增loc105378728的引物。

进一步，所述特异性扩增loc105378728的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括检测loc105378728水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别loc105378728的探针；或

特异性扩增loc105378728的引物。

进一步，所述特异性扩增loc105378728的引物序列如seqidno.1～2所示。

进一步，本发明第二方面所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的loc105378728的抑制剂。所述抑制剂选自：以loc105378728或其转录本为靶序列、且能够抑制loc105378728基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为sirna。

进一步，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第四方面提供了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有loc105378728基因的体系；和

检测所述体系中loc105378728基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制loc105378728基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对loc105378728基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明的第五方面提供了一种预测直肠腺癌的计算模型，所述计算模型包括对loc105378728的计算分析模块。

本发明的第六方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用；

c.loc105378728在构建预测直肠腺癌的计算模型中的应用；

d.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用；

e.loc105378728在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用。

附图说明

图1是利用qpcr检测loc105378728基因在直肠腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明基于高通量测序以及生物信息学分析方法，检测直肠腺癌标本中lncrna在肿瘤组织和癌旁组织的表达，首次发现了loc105378728在直肠腺癌中表达上调，为直肠腺癌的早期诊断及治疗提供了新的手段。

转录loc105378728的基因是位于人1号染色体上，本发明中的loc105378728包括野生型、突变型或其片段。目前已经公开的loc105378728的转录产物有6个，序列分别如国际公共核酸数据库genebank中转录产物xr_947355.2、xr_947358.2、xr_947356.2、xr_947354.2、xr_947359.2、xr_947357.2所示。本领域技术人员知道，在对原始测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因进行比对，只要测序片段可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本同时包含在本发明中，其突变型或其片段也包含在本发明中。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平，例如核酸测序技术、核酸扩增技术、核酸杂交技术。测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

试剂盒、芯片、核酸膜条

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测loc105378728的表达。作为优选的实施方案，所述试剂盒包含与生物标志物的lncrna特异性结合的一种或多种探针或引物。作为更为优选的实施方式，所述试剂盒还包含洗涤溶液。作为更为优选的实施方式，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、lncrna分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于loc105378728所示的部分或全部序列。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的针对loc105378728的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括loc105378728基因在内的多个基因(例如，与直肠腺癌相关的多个基因)的表达水平，将直肠腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高直肠腺癌诊断的准确率。

在本发明中，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于直肠腺癌的风险或与有助于评估直肠腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有直肠腺癌风险的个体、具有直肠腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

本发明中的“药物”、“药物组合物”可以通用。作为可选择的实施方案中，药物组合物包括loc105378728基因的抑制剂以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的ph以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

在本发明中，术语“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

本发明的药物组合物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集5例直肠腺癌组织样本及与之相对应的癌旁组织样本，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，排除其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，具体操作按说明书进行。

3、总rna定量与纯度分析

将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、构建cdna文库

使用ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna；对完整的rna序列，利用金属离子进行随机打断，将rna随机断裂成200bp左右的小片段；采用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建。

5、测序

使用illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

对转录组测序数据进行生物信息学分析，用cutadapt对reads进行修剪，将质控后的数据比对到参考基因组grch38上，cuffquant定量lncrna的表达量并标准化输出；cuffdiff比较对照组跟疾病组lncrna的表达差异，差异表达lncrna的筛选标准：p_value<0.05，|log2fc|>1。

7、结果

结果显示，与癌旁组织相比，loc105378728在直肠腺癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2qpcr测序验证loc105378728基因的差异表达

1、对loc105378728基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌癌旁组织和直肠腺癌组织各30例。

2、rna提取

利用qiagen的组织rna提取试剂盒提取rna样品，具体操作详见说明书。

3、qpcr

1)逆转录反应

采用tiangen公司的fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据genebank中loc105378728基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，在进行loc105378728的引物设计时，选择不同转录产物序列的共同序列进行设计，具体引物序列如下：

loc105378728基因：

正向引物为5’-tggctgctgtattgttat-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-gaggaatcttaggctgtt-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

qpcr结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁组织相比，loc105378728在直肠腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)；其中表达上调的样本有29例，1例则无显著的变化，提示loc105378728可作为分子标志物应用于直肠腺癌的诊断和治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>泰山医学院泰山医学院附属医院

<120>长链非编码rna在肿瘤中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggctgctgtattgttat18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaggaatcttaggctgtt18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatcccatcaccatcttccag21

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagccccagccttctccat19