一种CRP和miR-365-3p联合检测胃癌的引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物和医学检测
技术领域：
，具体涉及一种crp和mir-365-3p联合检测胃癌的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：胃癌是发生于消化系统中最常见的恶性肿瘤，其发病率位居全世界消化系统恶性肿瘤第一位，我国胃癌发病率及死亡率居恶性肿瘤第二位。由于胃癌早期症状比较不明显而难被患者察觉，一般有明显症状及就医时都已是中晚期胃癌，因错过了最佳的治疗时间，所以胃癌患者的死亡率较高，且生存质量较差。因此胃癌的早期发现、早期诊断是提高疗效的关键。microrna(mirna)是一类内源性的非编码rna，长约为20个核苷酸左右，mirna广泛存在于真核生物的细胞内，能通过与3’端或5’端的非翻译区结合方式对dna进行直接或间接的调控，从而影响细胞的增殖、分化、凋亡等，达到调节生物体生长与发育。mirnas不仅存在组织及细胞中，同时存在于许多体液中，包括血清，血浆，唾液，尿液和羊水等。通常把血浆或是血清mirna认为是循环mirnas。mirnas在体液的存在可表示无创癌症生物学标志物。由于失调的mirna早期表达事件在肿瘤中发生，检测循环mirna水平可用于早期癌症诊断和治疗反应的预测以及潜在的病人选择标准临床试验中的作用。近年来研究发现胃癌的发生与发展都涉及到多种mirna的表达异常。hsa-mir-365a-3p是mir-365家族成员之一，有相关研究报道了mir-365与人类胃癌具有一定相关性，其表达水平与胃癌的发生发展程度呈负相关。c反应蛋白(c-reactiveprotein，crp)是临床常用的一种急性时相蛋白反应指标，健康人血液中存在微量crp，但恶性肿瘤、炎症、感染时，机体巨噬细胞、淋巴细胞产生和分泌某些细胞因子，如白细胞介素6等，可刺激肝脏加速合成crp，使其浓度有不同程度升高。血清crp的检测对肿瘤评估具有重要的临床价值，一般在组织损伤6小时内crp开始升高，48小时达高峰。研究发现高敏crp的血清浓度可以作为胃、肠、肝、胆及胰腺肿瘤的一个较可靠的诊断参数。crp在胃癌中是一种促癌因子，其表达与胃癌的发展程度呈正相关。根据软件靶标预测，申请人发现mir-365能与crp的种子区竞争性结合，抑制其对下游靶标基因的作用，因此利用血液中mir-365-3p和crp的联合检测可以很好地预测胃癌。技术实现要素：针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种crp和mir-365-3p联合检测胃癌的引物、检测试剂盒及检测方法，该方法克服了mir-365作为单独的胃癌标志物时易产生假阳性的问题，同时比单独的蛋白标志物具有更高的灵敏度和更好的预测能力。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的第一个目的在于提出一种血液中crp和mir-365-3p联合检测胃癌的引物，包括扩增mir-365-3p和内参基因u6的上、下游引物；所述扩增mir-365-3p的上、下游引物如seqidno.1和seqidno.2所示，所述扩增内参基因u6的上、下游引物如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明的第二个目的在于提出一种血液中crp和mir-365-3p联合检测胃癌的试剂盒，包括扩增mir-365-3p的上、下游引物，扩增内参基因u6的上、下游引物和crp检测试剂；所述扩增mir-365-3p的上、下游引物如seqidno.1和seqidno.2所示，所述扩增内参基因u6的上、下游引物如seqidno.3和seqidno.4所示。进一步地，所述试剂盒还包括pcrmix反应液和去离子水。本发明的第三个目的在于提出一种血液中crp和mir-365-3p联合检测胃癌的方法，包括如下步骤：(1)取待检血液样本两份，一份常温离心，获取血浆，提取血浆中的总rna并测定血浆纯度；另一份提取血清中的crp；(2)对步骤(1)中的总rna进行逆转录，得到cdna；(3)分别采用实时定量pcr技术对mir-365-3p和内参基因u6的拷贝数进行定量检测，检测过程中所用引物如seqidno:1～4所示；(4)对步骤(1)提取的血清crp进行定量检测；(4)对mir-365-3ppcr扩增产物和crp进行分析，根据待检样本血清中mir-365-3p相对表达量与正常人之比、crp相对表达量与正常人之比确定待检样本是否患有胃癌。进一步地，所述步骤(3)中pcr反应体系为2×pcrpre-masterbuffer5μl，浓度为20um的上游引物0.5μl，浓度为20um的下游引物0.5μl，模板cdna1μl，去离子水13μl。现有的胃癌的检查一般采用彩超等一些复杂的医疗设备来对检测者进行检测，其不仅检测成本大，而且也加大了医护人员劳动力，操作比较复杂，对医护人员技术要求比较高，不能满足用户需求。基于现有的癌症检测，mir-365作为单独的胃癌标志物，极易出现假阳性的现象，对实验结果存在误差。crp不仅是癌症标志物，同时也是炎症表示物，而且临床尚未能给出crp的最佳临界值，对胃癌的监测没有绝对的参考价值。因此，与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：(1)本发明的技术方案结合crp和mir-365-3p联合检测胃癌，其中mir-365-3p的检测通过设计特异性高的靶标引物、内参引物，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系。该方法克服了mir-365作为单独的胃癌标志物时易产生假阳性的问题，同时比单独的蛋白标志物具有更高的灵敏度和更好的预测能力。(2)本发明的试剂盒及检测方法设置内参u6基因引物，通过内参基因的扩增能有效避免假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性，最终确保试剂盒检测结果准确无误。(3)该方法操作简单，降低了检测成本，同时也降低了对医护人员技术水平的要求，只需对人体血液中的mir-365和crp的浓度进行检测，对mir-365-3ppcr扩增产物和crp进行分析，根据待检样本血清中mir-365-3p相对表达量与正常人之比、crp相对表达量与正常人之比确定待检样本是否患有胃癌。若待测者血清中has-mir-365-3p相对表达量与对正常人之比低于0.32，且crp相对表达量与正常人之比高于3.98，则待测者有大于95％的可能性患胃癌。附图说明图1为实施例2中mir-365基因在正常人血液和胃癌患者血液中的表达情况结果图；图2为实施例2中crp在正常人血液和胃癌患者血液中的表达情况结果图。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。实施例1：1、mir-365-3p相对表达量的测定(1)取待测者的血液，提取血清中的rna向待测者血清中加入rnaisoplus试剂，提取总rna。按照rnaisoplus(总rna提取试剂盒)使用说明书上要求加入1mlrnaisoplus，室温裂解15min后裂解液移至ep管，离心后留取上清，加入0.2ml氯仿，颠倒混匀后室温放置5min；离心后留取上清，加入0.5ml异丙醇静置后离心；弃上清后加入lml75％乙醇，轻轻振荡，离心弃上清干燥沉淀物；ddh2o(depc处理过灭菌超纯水)溶解稀释，使用nanodrop2000测定rna浓度，适当稀释后再次测定浓度，选取od260/od280值在1.8-2.0之间样品进行下一步实验，所有样品于-80℃保存。(2)rna逆转录在pcr扩增仪中进行反应，反应体系如表1所示：表1逆转录反应体系反应条件为：25℃，30分钟；42℃，30分钟；85℃，5分钟。反应结束后将cdna产物立即取出，并置于冰上快速冷却，之后的所有步骤均在冰上进行，不要随便从冰上移走cdna产物。(3)实时荧光定量pcr实时荧光定量pcr检测mir-365-3p相对表达量，u6作为内参。其中上下游引物序列具体如下：mir-365-3p：seqidno.1forwardprimergccgctaaggcacgcgseqidno.2reverseprimertatggttgttcacgactccttcacu6：seqidno.3forwardprimerctcgcttcggcagcacaseqidno.4reverseprimeraacgcttcacgaatttgcgt实验组总反应体系20.0μl，反应体系如表2所示：表2实验组荧光定量pcr体系反应条件为：预变性95℃10min；扩增反应95℃2s、60℃20s、70℃l0s采集荧光，共40cycles，溶解曲线70℃30min。内参组总反应体系20.0μl，反应体系如表3所示：表3内参组荧光定量pcr体系反应条件为：预变性95℃10min；扩增反应95℃2s、60℃20s、70℃l0s采集荧光，共40cycles，溶解曲线70℃30min。2、crp相对表达量的测定(eilsa试剂盒检测)准备试剂与收集血样，提取待测者血清中的crp。(抽血前一天不吃过于油腻、高蛋白食物，避免大量饮酒，血液中的酒精成分会直接影响检验结果。体检前一天的晚八点以后，开始禁食12小时，以免影响检测结果。)10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释；收集标本，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻保存(-20℃或-70℃)避免反复冻融。标准品液配置：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成40ng/ml的溶液。取8个10ml离心管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入40ng/ul的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混合后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。洗涤液：用重蒸水1：20稀释。检测程序(1)加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。(2)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。(3)每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)将反应板充分混匀后置37℃20分钟。(4)洗板：同前。(5)每孔加酶标体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟。(6)洗板：同前。(7)每孔加入底物工作液100ul，置37洗板：同前，暗处反应15分钟。(8)每孔加入100ul终止液混匀。30分钟后用酶标仪在450nm处测吸光值。实施例2：(1)选取20例胃癌患者和20例正常人，按照实施例1中的方法进行检测，检测结果进行统计学分析，所有实验均重复三次，数据均采用spss16.0处理，采用平均值±标准差的方式表示。结果如表3、表4、图1和图2所示。表3临床上胃癌患者与正常人血液中mir-365-3p相对表达量组别mir-365-3p相对表达量胃癌患者38.15±4.15正常人98.46±6.78表4临床上胃癌患者与正常人血液中crp相对表达量组别mir-365-3p相对表达量胃癌患者27.70±1.68正常人5.87±2.35通过该实施例2表明，若待测者血清中has-mir-365-3p相对表达量与正常人之比低于0.32，且crp相对表达量与正常人之比高于3.98，则待测者有大于95％的可能性患胃癌。(2)随机选取6例胃癌患者和6例正常人，按照实施例1中的方法进行检测，其中6例胃癌患者的血清中has-mir-365-3p、crp的相对表达量与正常人之比均符合低于0.32、高于3.98，表明利用血液中has-mir-365-3p和crp的表达水平对胃癌进行诊断有非常高的准确率。因此，本发明的技术方案结合crp和mir-365-3p联合检测胃癌，利用mir-365-3p的检测通过设计特异性高的靶标引物、内参引物，设计出科学合理的pcr反应体系。该方法克服了mir-365作为单独的胃癌标志物时易产生假阳性的问题，同时比单独的蛋白标志物具有更高的灵敏度和更好的预测能力。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>武汉科技大学<120>一种crp和mir-365-3p联合检测胃癌的引物、试剂盒及检测方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gccgctaaggcacgcg16<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tatggttgttcacgactccttcac24<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctcgcttcggcagcaca17<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aacgcttcacgaatttgcgt20当前第1页12