本发明属于中草药领域，尤其涉及了哥王中总香豆素类物质的提取方法。
背景技术：
：了哥王为瑞香科植物了哥王(wikstromiaindica(l.)c.a.mey.)的干燥根或根皮，又名南岭荛花、地棉皮、九信菜、雀仔麻、山雁皮等。了哥王具有清热解毒，散结逐淤，消肿止痛之功效。在临床上常用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、急慢性支气管炎、急性扁桃体炎以及慢性肝炎、肝硬化与多种癌症的辅助治疗。但是未经炮制或者提取的了哥王是有一定毒性的，在历代本草中均有记载，如《岭南采药录》就有“其性味苦寒、微辛、有毒”的记载。虽然该药疗效确切，但因其毒性较大临床应用受到一定的限制。通过炮制或者提取是降低其毒性的有效方法。经研究报道，了哥王的主要成分为香豆素类、木脂素类、黄酮类、挥发油，此外还含有酸、醇或酯类、醌类、甾体类、萜类、二芳基庚烷类等化合物，包括5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮、山奈酚、南荛苷、芜花素、小麦黄素、荛花三香豆素、西瑞香素、伞形花内醋、牛芳苷元、罗汉松树脂酚、松脂酚、南荛酚、β-谷甾醇、胡萝卜甾醇、7-酮基-β-7基谷甾醇、豆甾烷-3,7-二醇、5-豆甾烯-3β，7a-二醇、了哥王多糖体-1、灰绿曲霉酰胺等几十种化学成分。香豆素类化合物化学名称：2h1-benzopyran-2-one，具有苯骈α-吡喃酮母核。根据环上取代基及其位置的不同，常将香豆素类化合物分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素。其中一些香豆素类化合物结构式如下：近年来，香豆素类化合物对动物致病细菌和真菌的抑菌(杀菌)活性得到了广泛研究。许多香豆素类化合物杀菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳菌、病原真菌均具有抑制活性。香豆素类化合物是了哥王中发现最早、普遍存在且具有生物活性的成分。目前己从了哥王中分离鉴定出多个香豆素类化合物，包括简单香豆素类，伞形花内酯；双香豆素类化合物，西瑞香素、6-oh-7-o-7'-双香豆素(6'-hydroxy-7-o-7'-dicoumarin)和西瑞香素-7-o-β-d-葡萄糖昔(daphnoretin-7-o-β-d-glucoside)，以及daphnogitin和edgeworin(两种香豆素类化合物)，三香豆素类，荛花三香豆素等。技术实现要素：本发明的目的在于：通过不同提取方法的研究，快速高效的从了哥王中提取香豆素类化合物。本发明目的通过以下方案实现：一种了哥王中总香豆素类物质的提取方法，其制备方法如下：(1)将了哥王根茎粗粉置于容器中，加入8～10倍量的50％～70％的乙醇，在超声条件下提取15～45分钟，得到乙醇提取液；(2)将步骤(1)所得的乙醇提取液浓缩至无醇味的膏体后，用5～8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯，萃取0.5～2小时，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液a，将所述乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物a；(3)在步骤(2)所得的剩余液a中加入体积比1:1的正丁醇，萃取0.5～2小时，分离，得到正丁醇萃取液，将所述正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物b；(4)将大孔吸附树脂湿法装柱，加95％乙醇浸泡，然后水洗至无醇，备用；(5)合并步骤(2)所得的萃取物a和步骤(3)所得的萃取物b，用5～8倍量的水配成混悬液，上柱；(6)依次用55％的乙醇，由氯仿和甲醇按体积比1:1组成的洗脱液进行洗脱；(7)合并洗脱液，浓缩干燥，即得到所述总香豆素类物质。作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(1)为加入8倍量的55％的乙醇，在超声条件下提取30分钟。作为对上述技术方案的进一步改进，所述大孔树脂为ab-8大孔吸附树脂。本发明还提供了一种采用上述提取方法得到的了哥王提取物。本发明还提供了一种抗炎镇痛药物，其包括采用上述方法得到的了哥王提取物。作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物为口服制剂。对药材有效成分进行分离精制，最大限度地去粗取精是中医现代化研究的重要组成部分。分离精制的目的是降低某些中药的毒性，或者提高某些药物的治疗效果，也是研究中药作用机理的重要途径。了哥王属有毒药材，虽药理作用广泛、疗效确切，但应用不慎会引发安全性问题。中草药的精制方法对生药化学成分有着较大的影响，或是使某些成分的溶解度和浸出度发生变化，或是导致某些成分消失或转化、生成新的化学成分，所以精制过程对于中草药的应用非常重要。了哥王精制时一定要注意去毒与存效并重，不可偏废，否则，顾此失彼，可能造成毒去效失，甚至效失毒存的结果，达不到临床应用的目的。经过检测，本发明的了哥王提取物中至少含5种香豆素类成分，包括伞形花内酯、西瑞香素、daphnogitin、西瑞香素-7-o-β-d-葡萄糖昔、荛花三豆香素，且提取得率为0.32mg/g。经过试验，本发明的了哥王提取物具有良好的镇痛抗炎效果，而且毒副作用低。正是由于抗炎镇痛效果明显且毒副作用低，因此可以开发制备成为口服制剂。此外，与现有的煎煮法以及乙醇提取法相比，本发明的了哥王提取物提取率高，提取速度快，可以应用于工业化生产。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未详细注明的实验条件和操作，通常按照本领域常规的实验条件和操作进行。实施例1：(1)将洗净的了哥王根皮干燥后粉碎，过10目筛，得了哥王茎皮粗粉；(2)称取了哥王粗粉2kg，置于容器中，加入8倍体积的55％(体积分数)的乙醇超声提取30分钟，放置冷却；(3)过滤，滤液进行减压蒸馏，浓缩至没有醇味，得到了哥王乙醇提取物浸膏，用8倍量的水稀释得到稀释液，加入体积比1:1的乙酸乙酯，萃取0.5小时，分离，得到乙酸乙酯萃取物和剩余液，将乙酸乙酯萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物a50.8g；(4)在步骤(3)所得的剩余液中加入体积比1:1的正丁醇，萃取0.5小时，分离，得到正丁醇萃取液，将正丁醇萃取物挥干溶剂，干燥，得到萃取物b105.8g；(5)将大孔吸附树脂湿法装柱，加95％乙醇浸泡，然后水洗至无醇，备用；(6)合并步骤(2)所得的萃取物a和步骤(3)所得的萃取物b，用8倍量的水配成混悬液，上柱；(7)依次用55％的乙醇，由氯仿和甲醇按体积比1:1组成的洗脱液进行洗脱；(8)合并洗脱液，浓缩干燥，得到所述总香豆素类物质。实施例2：本实施例采用紫外分光光度法测定了哥王中香豆素类物质瑞香苷的含量。吸收波长的确定：准确称取10mg瑞香苷单体化合物，乙醇定容至50ml，吸取2ml至比色皿中，在波长245～600nm之间扫描，得到最大吸收波长为310nm。标准曲线的建立：以瑞香苷为标准品，进行了哥王提取物中总香豆素含量的测定。精密称取10mg瑞香苷标准品，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度(0.20g/l)得对照品溶液。分别吸取对照品溶液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5ml分置于50ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度。以无水乙醇为空白对照，于310nm处测定其吸光度，并根据测定结果绘制标准曲线，获得标准曲线方程。瑞香苷含量测定：称取实施例1所得了哥王提取物总香豆素类物质1g，以乙醇为溶剂，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过滤，滤液为待测样品。将待测样品于310nm处测定吸光度，根据吸光度测定结果及标准曲线方程，计算出瑞香苷含量，重复试验3次。通过上述方法计算出香豆素类化合物瑞香苷的含量为0.32mg/g。通过检测，实施例1所得到总香豆素类物质中含有以下物质：1.1h-nmr(500mhz,cd3od)谱中，δ:6.70(1h,d,j＝2.5hz),6.79(1h,dd,j＝8.5,2.5hz),7.45(1h,d,j＝8.5hz)为一组abx系统，推测一个香豆素母核上7-位有含氧取代；6.18(1h,d,j＝9.5hz)和7.84(1h,d,j＝9.5hz)相互耦合裂分，分别为香豆素结构中4位和3位质子信号，即为a-吡喃环的4位及3位各有一个未取代的质子相互耦合，根据文献可以推断该化合物为伞形花内酯。2.1h-nmr(500mhz,cd3od)谱中，δ:6.24(1h,d,j＝9.5hz),6.30(1h,d,j＝9.5hz),7.91(1h,d,j＝9.5hz)为分别为香豆素母核上的3,4位h信号，提示该化合物为一双香豆素；δ:6.80(1h,d,j＝2.5hz)，6.95(1h,dd,j＝8.5,2.5hz)，7.58(1h,d,j＝8,5hz)为一组abx系统，推测一个香豆素母核上7一位有含氧取代；6.91(1h,s)，7.38(1h,s)为另一个香豆素苯环上58对位h信号，根据文献可以推断该化合物为为daphnogitin。3.fecl3反应呈阳性，提示该化合物可能含有酚羟基。在1h-nmr(500mhz,,dmso-d6)谱中，δ:3.83(3h,s)即为-och3的信号；8.06(1h,d,j＝9.5hz,h-4')和6.39(1h,d,j＝9.5hz,h-3')相互耦合分裂，分别为香豆素结构中4’位和3’位质子信号，即a-吡喃环的4-位及3-位各有一个未取代的质子；7.85(1h,s)为另一个吡喃环4-位的未取代的质子，而3-位已取代；7.71(1h,d,j＝8.5hz),7.19(1h,dd,j＝8.5,2.5hz),7.19(1h,d,j＝2.5hz)，为一组明显的abx系统，结合13c-nmr(125mhz,dmso-d6)δ:155.7，推测香豆素母核上7一位有含氧基团取代；6.87(1h,s)和7.22(1h,s)则为另一个香豆素母核上对位h-5和h-8的信号，推测该化合物为双香豆素类化合物。通过分析以上的信息，推测该化合物为西瑞香素。4.1h-nmr(500mhz,cd3od)谱中，δ:3.81(3h,s)即为-och3的信号；8.05(1h,d,j＝9.5hz,h-4')和6.40(1h,d,j＝9.5hz,h-3')相互耦合分裂，分别为香豆素结构中4'位和3’位质子信号，即a-吡喃环的4-位及3-位各有一个未取代的质子；7.88(1h,s)为另一个吡喃环4-位的未取代的质子，而3-位已取代；7.73(1h,d,j＝8.5hz),7.13(1h,dd,j＝8.5,2.5hz),7.21(1h,d,j＝2.5hz)为一组明显的abx系统，结合13c-nmr(125mhz,dmso-d6)δ:155.7，推测香豆素母核上7-位有含氧基团取代；7.28(1h,s)和7.25(1h,s)则为另一个香豆素母核上对位h-5和h-8的信号；5.10(1h,d,j＝7.0hz，葡萄糖端基h质子)，4.56～5.38(4h,m,葡萄糖-oh上h质子)，3.16～3.72(6h,m，葡萄糖上其它h质子)，推测该化合物为双香豆素昔类化合物。通过分析以上的信息，推测该化合物为西瑞香素-7-o-β-d-葡萄糖苷。5.fecl3反应呈阳性，提示该化合物可能含有酚羟基基。在1h-nmr(500mhz,cd3od)谱中，δ:7.01(1h,d,j＝8.5hz)，7.05(1h,dd,j＝2.5,8.5hz),7.60(1h,d,j＝8.5hz)为一组abx系统，推测香豆素母核上7-位有取代基；6.18(1h,d,j＝9.5hz)和7.91(1h,d,j＝9.5hz)相互耦合裂分，分别为香豆素结构中3’位和4’位质子信号；6.32(1h,d,j＝9.5hz)和7.93(1h,d,j＝9.5hz)相互耦合裂分，分别为香豆素结构中3’位和4’位质子信号；基于以上数推测该化合物为荛花三香豆素。实施例9：抗炎效果检测选nih雌性小鼠45只，体重20g左右，随机分为3组，每组15只，即空白对照组(0.9％生理盐水，20ml/kg)，实施例1了哥王总香豆素类提取物组和阳性对照组(吲哚美辛，0.2g/kg,20ml/kg)。实施例1了哥王总香豆素类提取物组用蒸馏水配成混悬液。动物的喂养条件：清洁通风环境，湿度50±5％，室温23±1℃，光照周期为12小时，水食自取。小鼠连续灌胃给药4天,每天1次，实验前小鼠禁食不禁水12h。于末次给药后60min用二甲苯(0.02m1/只)均匀涂在每只小鼠右耳正反两面致炎，左耳不涂作对照，致炎后30min脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径9mm的打孔器在相同位置取左右两耳片。于分析天平上称重，计算左耳片和右耳片重量的差值(肿胀度)及抑制率。计算均数与标准差，比较组间差异。肿胀度(mg)＝左耳片重-右耳片重通过观察可见，各实验组小鼠右耳，经二甲苯涂布后，迅速有不同程度变红、变大现象，鼠耳部分血管清晰可见。实施例1了哥王总香豆素类提取物组和阳性对照组对二甲苯所引起的小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，与空白对照组比较均有统计学差异。表1：肿胀抑制率测定结果组别肿胀度(mg)抑制率(％)空白对照组3.0±0.820实施例10.65±0.3278.3％阳性对照组0.76±0.2774.7％了哥王总香豆素类提取物能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，抗炎效果好。实施例10：镇痛效果检测选nih雌性小鼠45只，体重20g左右，随机分为3组，每组15只，即空白对照组(0.9％生理盐水，20ml/kg)，实施例1了哥王总香豆素类提取物组，和阳性对照组(罗通定,0.04g/kg)。动物的喂养条件：清洁通风环境，湿度50±5％，室温23±1℃，光照周期为12小时，水食自取。实施例1了哥王总香豆素类提取物组用蒸馏水配成混悬液。小鼠给药4天,每天1次，实验前小鼠禁食不禁水12h。第4天末次给药30min后，腹腔注射0.7％冰醋酸10ml/kg，观察15min内出现的扭体次数。扭体反应的表现为腹部收缩内凹，身体扭曲，后肢伸展。各给药组与空白对照组比较。计算各药的镇痛抑制百分率，观察药物的镇痛作用。结果显示，腹腔注射0.7％的冰醋酸能使小鼠出现明显的扭体反应。了哥王总香豆素类提取物能对抗醋酸刺激所致的疼痛反应，使小鼠扭体次数明显减少。表2：对醋酸致小鼠疼痛的镇痛效果组别扭体次数抑制率(％)空白对照组30.2±5.00实施例113.2±3.356.3％阳性对照组14.3±5.252.6％了哥王总香豆素类提取物能明显抑制醋酸致小鼠疼痛，镇痛效果好。以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。当前第1页12