一种微载体生物反应罐的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种微载体生物反应罐。

背景技术：

传统的微载体生物反应罐对罐内液体的加热方式为电热毯加热的方式，通过加热电热毯，电热毯贴在反应罐壁外，通过热传导加热到罐内液体，在刚开始加热时电热毯温度很高，直接接触罐体表面，导致罐内的壁上温度过高，会影响罐内的载体上的细胞贴壁与生长。

罐内取样管的长度是固定的，当罐内细胞培养到24h后需要换液，排出罐内的营养液，然后加入新的营养液，排罐内营养液时，需要在反应罐组装灭菌前先调节取样管长度，调节的长度只能根据我们使用载体量来预估，而且事先调节不准确，不能彻底排干液体或把载体排出，损失部分载体。

在观察罐内载体上的细胞时需要将载体细胞取出罐外去观察，操作比较烦锁，影响观察细胞的实际状态，在收获最终抗原时需要把所有培养液包括载体排出罐外，然后再通过一道过滤网过滤收获的抗原同载体的混合液，费时费力，载体细胞取出罐外去观察，一方面浪费载体细胞，另一方面细胞取出后会产生一些变化，观察到的细胞状态有偏差。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于克服现有技术的不足，提供一种微载体生物反应罐，改进微载体生物反应罐培养装置，方便罐内细胞实时观察，方便排废液，方便过滤载体，提高效率，提高细胞贴壁率，提高24h的细胞密度，培养状态更好的细胞。

本实用新型采用的技术方案是：

一种微载体生物反应罐，其包括罐体，罐体内设有搅拌器、生物反应探测电极、消泡装置，罐体的上表面对应设有搅拌器安装口、电极接口和消泡装置接口，搅拌器用于罐体内液体进行搅拌，罐体的底部设有排出口，排出口外延有排出管，排出管上设有排出阀门，罐体的内壁对应排出口处设有过滤筛网，

罐体上表面还设有进气接口和液料接口，进气接口用于向罐体不同位置通入气体，液料接口包括补液口、取样口、两个以上进料口，补液口用于培养过程中补充培养液，进料口用于向罐体内添加培养物料，

取样口内安装有调节杆，调节杆的一端伸入罐体内，调节杆的另一端套设有限位套，限位套将调节杆的另一端限位在取样口，并通过调整限位套的位置改变调节杆伸入罐体的长度，调节杆的一端上套设有伸缩管，伸缩管的一端固定在调节杆的一端端头，伸缩管的另一端连接取样管，

取样管上设有第一过滤气头和第一开关阀体，第一开关阀体设在第一过滤气头对应取样口的一端，取样管的另一端分别连接第二支管和观察管的一端，第二支管另一端设有收集瓶，收集瓶上设有第四过滤气头，第二支管上设有第四开关阀体；观察管呈水平设置，观察管具有一透明观察区，观察管的另一端通过第三开关阀体连接有第二过滤气头；罐体的侧壁具有夹层空间，夹层空间内充入夹套水，夹层空间设有加热管对夹套水加热，罐体的侧壁的外侧面间隔设有两个连通夹层空间的通孔，两个通孔分别接入一循环泵的两端。

进一步地，生物反应探测电极包括pH电极、温度电极和溶氧电极，电极接口包括pH电极接口、温度电极接口和溶氧电极接口。

进一步地，进气接口包括呼吸器接口、深层进气接口和表层进气接口。

进一步地，进气接口还包括滤网进气接口，一通气管通过滤网进气接口通入罐体内并对着过滤筛网出气。

进一步地，搅拌器包括搅拌轴，搅拌轴上分布有多个搅拌桨，搅拌器安装口设于罐体的上表面的中心处，搅拌轴的一端固定于搅拌轴安装口，搅拌轴与搅拌桨构成搅拌器，搅拌器在罐体内呈竖直设置。

进一步地，观察管的另一端还连接第一支管的一端，第一支管上设有第二开关阀体，第一支管的另一端设有备用留样瓶，备用留样瓶上设有第三过滤气头。收集瓶

进一步地，取样管、第一支管和第二支管均为软管，第一开关阀体、第二开关阀体、第三开关阀体和第四开关阀体均为气夹。

进一步地，取样管、第一支管和第二支管均为硬质管道，第一开关阀体、第二开关阀体、第三开关阀体和第四开关阀体均为气阀。

本实用新型采用以上技术方案，生物反应罐内液体的加热方式设计为反应罐为两层，中间有夹套安装加热管，夹套的水通过蠕动泵不断的循环，夹套的水加热罐内的液体。取样的管在罐内部分使用可伸缩的管，当培养载体量大时，在排废液时将管升到适当的位置，当培养载体量小时，在排废液时将管降到适当的位置，这样不至于把载体排出。在罐外部分的取样管连接一个装置，当载体细胞流过装置时停止，将这装置放置在显微镜上观察细胞状态。同时观察后可以将残留的打回罐内不浪费。在反应罐的底部侧面安装一个载体过滤网，在过滤网上方装有一个通气管，在收获时最终抗原去除载体时，开启过滤网上方的气体，在过滤时不至于载体堵住过滤网，过滤通畅。本实用新型具有如下优点：1、罐内取样口设计成可升降调节的，在排废液时可根据载体量的液位高低调节取样口的高度，方便操作同时可以排液更彻底。2、加热罐内液体使用加热管加热罐内夹套水，通过泵循环流动夹套水，夹套水水浴加热罐内液体，这样罐内液体温度均匀，且不会局部太高。3、在线观察细胞通过罐外加装一个管道与罐内连接，在罐外管道加装一个定制的透明玻璃管，可以通过吸力将罐内的载体细胞流入透明管中，置显微镜下随时观察细胞状态，同时观察后可以将残留的打回罐内不浪费。4、在罐底侧面装一个过滤口，过滤口装有载体过滤网，在收获抗原液时可通过过滤网过滤去除载体，在过滤过程中载体容易把过滤网堵住，我们在过滤网上方加装一个进气管，在过滤过程中开启通气，可将过滤网上的载体排走不至于堵住过滤网，很顺畅的收获抗原。

以往收获载体与抗原后再滤需要2-3人操作，采用本实用新型后收获抗原时在线过滤载体只需1人操作，提高效率，节约劳动力。本实用新型改进微载体生物反应罐培养装置，方便罐内细胞实时观察，方便排废液，方便过滤载体，提高效率，提高细胞贴壁率，提高24h的细胞密度，培养状态更好的细胞。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本实用新型做进一步详细说明；

图1为本实用新型一种微载体生物反应罐的结构示意图；

图2为本实用新型一种微载体生物反应罐的剖视示意图。

具体实施方式

如图1或2所示，本实用新型公开一种微载体生物反应罐，其包括罐体1，罐体1内设有搅拌器、生物反应探测电极、消泡装置，罐体1的上表面对应设有搅拌器安装口11、电极接口和消泡装置接口12，搅拌器用于罐体1内液体进行搅拌，罐体1的底部设有排出口13，排出口13外延有排出管2，排出管2上设有排出阀门21，罐体1的内壁对应排出口13处设有过滤筛网22，

罐体1上表面还设有进气接口和液料接口，进气接口用于向罐体1不同位置通入气体，液料接口包括补液口14、取样口15、两个以上进料口10，补液口14用于培养过程中补充培养液，进料口10用于向罐体1内添加培养物料，

取样口15内安装有调节杆3，调节杆3的一端伸入罐体1内，调节杆3的另一端套设有限位套31，限位套31将调节杆3的另一端限位在取样口15，并通过调整限位套31的位置改变调节杆3伸入罐体1的长度，调节杆3的一端上套设有伸缩管4，伸缩管4的一端固定在调节杆3的一端端头，伸缩管4的另一端连接取样管5，

取样管5上设有第一过滤气头F1和第一开关阀体K1，第一开关阀体K1设在第一过滤气头F1对应取样口15的一端，取样管5的另一端分别连接第二支管30和观察管6的一端，第二支管30另一端设有收集瓶40，收集瓶40上设有第四过滤气头F4，第二支管30上设有第四开关阀体K4；观察管6呈水平设置，观察管6具有一透明观察区61，观察管6的另一端通过第三开关阀体K3连接有第二过滤气头F2；

罐体1的侧壁具有夹层空间，夹层空间内充入夹套水，夹层空间设有加热管60对夹套水加热，罐体1的侧壁的外侧面间隔设有两个连通夹层空间的通孔22，两个通孔22分别接入一循环泵23的两端。

进一步地，生物反应探测电极包括pH电极、温度电极和溶氧电极，电极接口包括pH电极接口17、温度电极接口18和溶氧电极接口19。

进一步地，进气接口包括呼吸器接口24、深层进气接口25和表层进气接口26。

进一步地，进气接口还包括滤网进气接口27，一通气管50通过滤网进气接口27通入罐体1内并对着过滤筛网22出气。

进一步地，搅拌器包括搅拌轴28，搅拌轴28上分布有多个搅拌桨29，搅拌器安装口11设于罐体1的上表面的中心处，搅拌轴28的一端固定于搅拌轴28安装口，搅拌轴28与搅拌桨29构成搅拌器，搅拌器在罐体1内呈竖直设置。

进一步地，收集瓶观察管6的另一端还连接第一支管7的一端，第一支管上设有第二开关阀体K2，第一支管7的另一端设有备用留样瓶9，备用留样瓶9上设有第三过滤气头F3。设置备用留样瓶9需要小批量测试时，使用备用留样瓶9收集样品。

进一步地，取样管5、第一支管7和第二支管30均为软管，第一开关阀体K1、第二开关阀体K2、第三开关阀体K3和第四开关阀体K4均为气夹。

进一步地，取样管5、第一支管7和第二支管30均为硬质管道，第一开关阀体K1、第二开关阀体K2、第三开关阀体K3和第四开关阀体K4均为气阀。

进一步地，本实用新型进一步公开了一种应用该微载体生物反应罐培养细胞的方法，其包括以下步骤：

步骤1，生物反应罐开启预热：将生物反应罐的pH、温度、溶氧电极连接好，加好反应罐夹套的水，连接好加热管60并开启电源加热，开启循环泵23让罐内的水进行循环使温度均匀。

步骤2，转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用0.25%的胰酶消化液消化细胞，消化后的细胞充分摇匀。

步骤3，细胞计数：取适量消化后的细胞用维持液进行稀释，稀释后取适量稀释后细胞加至细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞液的细胞密度。

步骤4，细胞上罐培养：向生物反应罐中按3-5g/升添加微载体，按30-50个细胞/微载体添加细胞；

根据反应罐中微载体的数量、每球细胞数与转瓶消化后细胞密度计算所需使用细胞量，将所需细胞量通过细胞瓶与进料口对应的管道加入生物反应罐中；调节生物反应罐相关器件的细胞培养参数：温度：36.5-37.5℃，DO：50%-60%，pH：7.2-7.4，转数：40-60r/min,选择通气系统模式（Air/O2/CO2），开启通气系统通过进气接口向生物反应罐进行通气培养。

步骤5，24h换液：当生物反应罐中细胞培养至24h后，停止搅拌，静置3-5分钟，调节伸缩管4下端口取样高度，使伸缩管4下端口取样高度在载体液面上方0.5cm处，排出细胞培养液，然后通过补液口14加入等量的细胞维持液继续培养。

步骤5中排出细胞培养液的具体方法：打开第一开关阀体K1和第四开关阀体K4，关闭第二开关阀体K2和第三开关阀体K3, 通气系统通过进气接口向罐体通气加压，使用废液瓶作为收集瓶，由于罐体内压力大于罐体外的压力，载体液面上方0.5cm以上的培养液在压力的作用下通过伸缩管流经取样管不断流入收集瓶，直到培养液的液面低于伸缩管4下端口取样高度时停止；此时关闭第一开关阀体K1的同时分别在过滤气头F1和在过滤气头F2使用注射器打气，将透明观察区61及相关管道部分的细胞培养液打入收集瓶。

步骤6，细胞观察：当细胞培养至48h后，保持搅拌的同时打开第一开关阀体K1和第三开关阀体K3，关闭第二开关阀体K2和第四开关阀体K4,在过滤气头F2使用注射器中吸气，生物反应罐罐体1的载体及细胞就流经透明观察区61时停止抽气，关闭第一开关阀体K1，将细胞观察区放置显微镜下观察，观察后，打开第一开关阀体K1，使用注射器在过滤气头F2中打气，将透明观察区61及相关管道部分的载体与细胞由原路经取样口打入罐体内。

步骤7，第一次收获抗原：当细胞培养至72h后，停止搅拌，静置3-5分钟，调节取使伸缩管4下端口取样高度至罐内载体上方0.5cm处，收集第一次抗原并将收获抗原液置-15度以下冰柜冷冻保存，然后通过补液口14加入等量的细胞维持液继续培养。

收集第一次抗原的具体方法：打开第一开关阀体K1和第四开关阀体K4，关闭第二开关阀体K2和第三开关阀体K3, 通气系统通过进气接口向罐体通气加压，使用抗原瓶作为收集瓶，由于罐体内压力大于罐体外的压力，载体液面上方0.5cm以上的培养液在压力的作用下通过伸缩管流经取样管不断流入收集瓶，直到培养液的液面低于伸缩管4下端口取样高度时停止；此时关闭第一开关阀体K1的同时分别在过滤气头F1和在过滤气头F2使用注射器打气，将透明观察区61及相关管道部分的细胞培养液打入收集瓶。

步骤8，第二次收获抗原并换液培养：当生物反应罐细胞培养至96h后，停止搅拌，静置3-5分钟，调节使伸缩管4下端口取样高度至罐内载体上方0.5cm处，通过取样口15再次收获培养上清抗原液，将收获第二抗原液置-15度下冰柜冷冻保存。

收集第二次抗原的具体方法：打开第一开关阀体K1和第四开关阀体K4，关闭第二开关阀体K2和第三开关阀体K3, 通气系统通过进气接口向罐体通气加压，使用抗原瓶作为收集瓶，由于罐体内压力大于罐体外的压力，载体液面上方0.5cm以上的培养液在压力的作用下通过伸缩管流经取样管不断流入收集瓶，直到培养液的液面低于伸缩管4下端口取样高度时停止；此时关闭第一开关阀体K1的同时分别在过滤气头F1和在过滤气头F2使用注射器打气，将透明观察区61及相关管道部分的细胞培养液打入收集瓶。

步骤9，第三次收获抗原：当生物反应罐内的细胞培养至96-120h后，调节转数为100-150转3-5分钟，然后停止搅拌，静置3-5分钟，通过通气系统从进气接口向罐体通气加压，开启排出管2上的排出阀门21收获过滤后的抗原，同时开启过滤网上方的通气管50进气，保证收获过滤后的抗原并进行留样检测抗原效价，顺畅的收获抗原，将最终收获的第三次抗原液置-15度以下冰柜冷冻保存。

本实用新型采用以上技术方案，生物反应罐内液体的加热方式设计为反应罐为两层，中间有夹套安装加热管60，夹套的水通过蠕动泵不断的循环，夹套的水加热罐内的液体。取样的管在罐内部分使用可伸缩的管，当培养载体量大时，在排废液时将管升到适当的位置，当培养载体量大时，在排废液时将管降到适当的位置，这样不至于把载体排出。在罐外部分的取样管5连接一个装置，当载体细胞流过装置时停止，将这装置放置在显微镜上观察细胞状态。同时观察后可以将残留的打回罐内不浪费。在反应罐的底部侧面安装一个载体过滤网，在过滤网上方装有一个通气管50，在收获时最终抗原去除载体时，开启过滤网上方的气体，在过滤时不至于载体堵住过滤网，过滤通畅。本实用新型具有如下优点：1、罐内取样口15设计成可升降调节的，在排废液时可根据载体量的液位高低调节取样口15的高度，方便操作同时可以排液更彻底。2、加热罐内液体使用加热管60加热罐内夹套水，通过泵循环流动夹套水，夹套水水浴加热罐内液体，这样罐内液体温度均匀，且不会局部太高。3、在线观察细胞通过罐外加装一个管道与罐内连接，在罐外管道加装一个定制的透明玻璃管，可以通过吸力将罐内的载体细胞流入透明管中，置显微镜下随时观察细胞状态，同时观察后可以将残留的打回罐内不浪费。4、在罐底侧面装一个过滤口，过滤口装有载体过滤网，在收获抗原液时可通过过滤网过滤去除载体，在过滤过程中载体容易把过滤网堵住，我们在过滤网上方加装一个进气管，在过滤过程中开启通气，可将过滤口的载体排走不至于堵住过滤口，很顺畅的收获抗原。以往收获载体与抗原后再滤需要2-3人操作，采用本实用新型后收获抗原时在线过滤载体只需1人操作，提高效率，节约劳动力。本实用新型改进微载体生物反应罐培养装置，方便罐内细胞实时观察，方便排废液，方便过滤载体，提高效率，提高细胞贴壁率，提高24h的细胞密度，培养状态更好的细胞。