1.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统,所述表达系统包括:
一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(escherichiacoli)细胞,所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体,所述异源核酸构建体包含:
(i)鼠李糖诱导型启动子序列;以及
(ii)表达序列,所述表达序列包含第一部分和第二部分,所述第一部分包含与所述第二部分的5'末端连接的编码周质分泌信号的核苷酸序列,以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列,并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。
2.根据权利要求1所述的表达系统,其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的表达系统,其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的突变形式的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达系统,其中所述白喉毒素多肽的突变形式为crm197。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统,其中所述周质分泌信号包含氨基酸序列mkvkvlsllvpallvagaana(seqidno:1),或发挥周质分泌信号的功能、与seqidno:1序列具有至少90%同一性的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统,其中编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的所述核苷酸序列是用于在大肠杆菌中表达的优化序列。
7.根据权利要求6所述的表达系统,其中所述优化序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的天然核苷酸序列(例如,seqidno:2的序列)具有至少95%的同一性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的表达系统,其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌b菌株细胞。
9.根据权利要求9所述的表达系统,其中所述大肠杆菌b菌株细胞是大肠杆菌bl21菌株细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统,其中所述鼠李糖诱导型启动子是rhapbad启动子。
11.根据权利要求10所述的表达系统,其中所述rhapbad启动子包含下述核苷酸序列:
caccacaattcagcaaattgtgaacatcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaaggtcgcgaattcaggcgctttttagactgg(seqidno:4)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的表达系统,其中所述有缺陷的鼠李糖分解代谢途径是由编码参与所述鼠李糖分解代谢途径的多肽的基因的失活引起的。
13.根据权利要求12所述的表达系统,其中参与所述鼠李糖分解代谢途径的所述多肽是l-鼠李树胶糖激酶(rhab)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的表达系统,其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的鼠李糖转运蛋白(rhat)基因。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的表达系统,其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的麦芽糖转运蛋白亚基(male)基因。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的表达系统,其中所述大肠杆菌细胞表达融合至亲和标签的亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运蛋白亚基(livk)。
17.根据权利要求16所述的表达系统,其中所述亲和标签为组氨酸标签。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的表达系统,其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的sula基因。
19.一种生产白喉毒素多肽或其突变形式的方法,所述方法包括:
(a)在含有除鼠李糖以外的碳源的培养基中培养权利要求1至18中任一项所述的大肠杆菌细胞,直至在600nm处的光密度(od600)达到至少大约150;
(b)向培养物中添加鼠李糖,并用含有碳源的溶液向所述培养物进料足以产生所述白喉毒素多肽或其突变形式的一段时间;以及
(c)收集从所述细胞的周质产生的白喉毒素多肽或其突变形式。
20.根据权利要求19所述的方法,其中进行所述培养步骤(a)直至od600达到至少大约180或od600达到大约180至大约220。
21.根据权利要求19或20所述的方法,其中所述培养基包含大约0.1g/l至大约100g/l,或大约5g/l至大约50g/l的酵母提取物。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法,其中所述培养基包含浓度为至少大约0.001g/l的铁源。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法,其中所述培养步骤(a)的长度为大约24小时至大约32小时,或大约26小时至大约30小时,例如大约28小时。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法,其中所述培养步骤(a)包括第一阶段和第二阶段。
25.根据权利要求24所述的方法,其中在所述第一阶段,所述培养基中包含浓度为大约10g/l至大约30g/l或大约20g/l的葡萄糖。
26.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述第一阶段的长度为大约8小时至大约16小时、大约10小时至大约14小时或大约12小时。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法,其中所述第二阶段包括用含有除鼠李糖以外的所述碳源(例如,葡萄糖)的进料溶液向所述培养物进料。
28.根据权利要求27所述的方法,其中进料流速为大约2ml/l/h至大约50ml/l/h,或大约5ml/l/h至大约40ml/l/h。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述进料流速随时间增加。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法,其中所述进料持续大约8小时至大约20小时、大约12小时至大约20小时或大约16小时。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法,其中所述进料溶液包含浓度为大约400g/l至800g/l或大约650g/l的葡萄糖。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法,其中以大约0.01%至大约0.2%、大约0.01%至大约0.1%或大约0.05%的浓度添加鼠李糖。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法,其中所述步骤(b)的长度为大约4小时至大约8小时或大约6小时。
34.根据权利要求19至33中任一项所述的方法,其中所述步骤(b)的进料溶液包含甘油作为碳源。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述甘油的浓度为大约400g/l至大约800g/l或大约665g/l。
36.根据权利要求19至35中任一项所述的方法,其中所述步骤(b)中的进料流速为大约5ml/l/h至大约30ml/l/h、大约10ml/l/h至大约20ml/l/h或大约14ml/l/h。
37.根据权利要求19至36中任一项所述的方法,其中步骤(a)和/或步骤(b)在大约20℃至大约30℃或大约26℃的温度下进行。
38.根据权利要求19至37中任一项所述的方法,其中在所述步骤(a)和/或步骤(b)中的培养物具有大约6.0至大约7.0或大约6.8的ph。
39.根据权利要求19至38中任一项所述的方法,其中步骤(a)和(b)在发酵生物反应器中进行。
40.根据权利要求19至39中任一项所述的方法,其进一步包括纯化在步骤(c)中收集的白喉毒素多肽或其突变形式。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述纯化包括离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱和/或混合模式色谱。
42.根据权利要求41的方法,其中所述纯化包括亲和色谱。
43.根据权利要求19至42中任一项所述的方法,其中可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少2.0g。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少3.0g。
45.根据权利要求43所述的方法,其中所述可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少4.0g。
46.一种大肠杆菌细胞,其包含有缺陷的sula基因和有缺陷的lon基因。
47.根据权利要求46所述的大肠杆菌细胞,其中所述大肠杆菌细胞为bl21菌株细胞。
48.根据权利要求47所述的大肠杆菌细胞,其中所述大肠杆菌细胞为bl21(de3)菌株细胞。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的大肠杆菌细胞,其中所述细胞在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷。
50.根据权利要求49所述的大肠杆菌细胞,其中所述细胞包含有缺陷的rhab基因。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞,其中所述有缺陷的sula基因包含seqidno:10所示的核苷酸序列。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的大肠杆菌细胞用于通过同源重组进行基因靶向的用途。
53.一种通过同源重组进行基因靶向的方法,所述方法包括在供体底物dna分子存在的情况下,在权利要求46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞内的dna分子中引入体内双链断裂。
54.根据权利要求53所述的方法,其中使用crispr-cas系统引入双链断裂。
55.一种表达系统,其包含权利要求46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞,其中所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体,所述异源核酸构建体包含与编码多肽的核酸分子可操作地连接的诱导型启动子序列。
56.根据权利要求55所述的表达系统,其中所述诱导型启动子是鼠李糖诱导型启动子。
57.一种通过同源重组提高不含lon蛋白酶的大肠杆菌细胞对基因靶向的顺从性的方法,所述方法包括在所述大肠杆菌细胞中引入降低所述大肠杆菌中sula基因的功能的遗传改变。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述大肠杆菌细胞是bl21菌株细胞。
59.根据权利要求57或58所述的方法,其中所述大肠杆菌细胞在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷。