用于生产白喉毒素多肽的系统和方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月17日提交的欧洲专利申请号17186713.8和于2018年8月14日提交的美国临时专利申请号62/718854的权益，其中每一篇申请通过引用整体并入本文。
本发明总体上涉及白喉毒素多肽(例如，天然白喉毒素多肽)或其变体(例如，用于结合疫苗crm197的载体蛋白)的生产。
背景技术：
白喉毒素(dtx)是一种由白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)产毒菌株合成并分泌的535个氨基酸的单个多肽链的蛋白毒素，其含有由二硫键连接在一起的a(活性)结构域和b(结合)结构域。该毒素结合至细胞受体(hb-egf受体)并通过内吞作用进入细胞，在此通过蛋白水解切割将所述a结构域从所述b结构域释放。然后，所述a结构域通过由所述b结构域形成的孔离开内体并进入细胞质，其在细胞质中抑制蛋白质合成，最终导致细胞死亡。
白喉是由白喉棒状杆菌细菌引起的感染。症状和并发症(包括心肌炎和神经炎)是由所述细菌产生的dtx引起的。通过使用白喉类毒素(即通过甲醛(福尔马林)处理而获得的灭活形式的dtx结合佐剂(铝盐))进行接种来实现预防白喉。白喉疫苗以几种组合形式递送，一种包括破伤风类毒素(称为dt疫苗)，另一种包括破伤风和百日咳疫苗(称为dpt疫苗)。
交叉反应物质197(crm197)是dtx的突变形式，其含有单个氨基酸取代(g52e)而使该蛋白质无酶促活性且无毒。已经发现crm197是一种用于针对包膜细菌的结合疫苗的理想的载体。结合疫苗包含与免疫原性差和t细胞非依赖性荚膜多糖共价连接的crm197，从而产生具有高度免疫原性的结合抗原，并导致针对所述抗原的长期免疫。含有crm197作为载体蛋白的疫苗包括针对脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)的疫苗，例如
使用天然宿主菌株白喉棒状杆菌难以大量生产(>0.2克/升)白喉毒素多肽(例如，crm197)。此外，经纯化的蛋白质不稳定，并且在冻融后会迅速降解。目前在天然种类白喉棒状杆菌的生产在发酵期间导致每升大约100-200mg的crm197。已报道荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株的产量大约为1.2-1.3g/l(pct公开号wo2011/123139)。尽管crm197的不溶性形式可以在大肠杆菌(e.coli)中发酵到相对中等的产量，但只有一小部分不溶性产物可以转化为可溶性形式(stefan等人,jbiotechnol.2011年12月20日；156(4):245-52,2011)。
另一个主要问题是商业化的蛋白质非常昂贵(每克经纯化的蛋白质高达100000美元)。
因此，需要以更高产量生产可溶性、功能性和稳定的白喉毒素多肽(例如，dtx和crm197)的系统和方法。
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技术实现要素：
本发明涉及用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的系统、方法和产品。
在各种方面和实施方案中，本公开内容提供了以下项目1至59：
1.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：
一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(escherichiacoli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：
(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及
(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含编码与所述第二部分的5'末端连接的周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。
2.项目1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列。
3.项目1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的突变形式的核苷酸序列。
4.项目3所述的表达系统，其中所述白喉毒素多肽的突变形式为crm197。
5.项目1至4中任一项所述的表达系统，其中所述周质分泌信号包含氨基酸序列mkvkvlsllvpallvagaana(seqidno：1)，或与作为周质分泌信号的seqidno：1序列具有至少90％同一性的序列。
6.项目1至5中任一项所述的表达系统，其中编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的所述核苷酸序列是用于在大肠杆菌中表达的优化序列。
7.项目6所述的表达系统，其中所述优化序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的天然核苷酸序列(例如，seqidno：2的序列)具有至少95％的同一性。
8.项目1至7中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌b菌株细胞。
9.项目9所述的表达系统，其中所述大肠杆菌b菌株细胞是大肠杆菌bl21菌株细胞。
10.项目1至9中任一项所述的表达系统，其中所述鼠李糖诱导型启动子是rhapbad启动子。
11.项目10所述的表达系统，其中所述rhapbad启动子包含核苷酸序列：
caccacaattcagcaaattgtgaacatcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaaggtcgcgaattcaggcgctttttagactgg(seqidno：4)。
12.项目1至11中任一项所述的表达系统，其中所述有缺陷的鼠李糖分解代谢途径是由编码参与所述鼠李糖分解代谢途径的多肽的基因的失活引起的。
13.项目12所述的表达系统，其中参与所述鼠李糖分解代谢途径的所述多肽是l-鼠李树胶糖(rhamnulose)激酶(rhab)。
14.项目1至13中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的鼠李糖转运蛋白(rhat)基因。
15.项目1至14中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的麦芽糖转运蛋白亚基(male)基因。
16.项目1至15中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞表达融合至亲和标签的亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运蛋白亚基(livk)。
17.项目16所述的表达系统，其中所述亲和标签为组氨酸标签。
18.项目1至17中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的sula基因。
19.一种生产白喉毒素多肽或其突变形式的方法，所述方法包括：
(a)在含有除鼠李糖以外的碳源的培养基中培养项目1至18中任一项所述的大肠杆菌细胞，直至在600nm处的光密度(od600)达到至少大约150；
(b)向培养物中添加鼠李糖，并用含有碳源的溶液向所述培养物进料一段时间，以足以产生所述白喉毒素多肽或其突变形式；以及
(c)收集从所述细胞的周质产生的白喉毒素多肽或其突变形式。
20.项目19所述的方法，其中进行所述培养步骤(a)直至od600达到至少大约180或od600达到大约180至大约220。
21.项目19或20所述的方法，其中所述培养基包含大约0.1g/l至大约100g/l，或大约5g/l至大约50g/l的酵母提取物。
22.项目19至21中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度至少大约0.001g/l的铁源。
23.项目19至22中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)的长度为大约24小时至大约32小时，或大约26小时至大约30小时，例如大约28小时。
24.项目19至23中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)包括第一阶段和第二阶段。
25.项目24所述的方法，其中在所述第一阶段，所述培养基中包含浓度为大约10g/l至大约30g/l或大约20g/l的葡萄糖。
26.项目24或项目25所述的方法，其中所述第一阶段的长度为大约8小时至大约16小时、大约10小时至大约14小时或大约12小时。
27.项目24至26中任一项所述的方法，其中所述第二阶段包括用含有除鼠李糖以外的所述碳源(例如，葡萄糖)的进料溶液向所述培养物进料。
28.项目27所述的方法，其中进料流速为大约2ml/l/h至大约50ml/l/h，或大约5ml/l/h至大约40ml/l/h。
29.项目28所述的方法，其中所述进料流速随时间增加。
30.项目27至29中任一项所述的方法，其中所述进料持续大约8小时至大约20小时、大约12小时至大约20小时或大约16小时。
31.项目27至30中任一项所述的方法，其中所述进料溶液包含浓度为大约400g/l至800g/l或大约650g/l的葡萄糖。
32.项目19至31中任一项所述的方法，其中以大约0.01％至大约0.2％、大约0.01％至大约0.1％或大约0.05％的浓度添加鼠李糖。
33.项目19至32中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的长度为大约4小时至大约8小时或大约6小时。
34.项目19至33中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的进料溶液包含甘油作为碳源。
35.项目34所述的方法，其中所述甘油的浓度为大约400g/l至大约800g/l或大约665g/l。
36.项目19至35项中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)中的进料流速为大约5ml/l/h至大约30ml/l/h、大约10ml/l/h至大约20ml/l/h或大约14ml/l/h。
37.项目19至36中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)在大约20℃至大约30℃或大约26℃的温度下进行。
38.项目19至37中任一项所述的方法，其中在所述步骤(a)和/或步骤(b)中的培养物具有大约6.0至大约7.0或大约6.8的ph。
39.项目19至38中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在发酵生物反应器中进行。
40.项目19至39中任一项所述的方法，其进一步包括纯化在步骤(c)中收集的白喉毒素多肽或其突变形式。
41.项目40所述的方法，其中所述纯化包括离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱和/或混合模式色谱。
42.项目41的方法，其中所述纯化包括亲和色谱。
43.项目19至42中任一项所述的方法，其中可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少2.0g。
44.项目43所述的方法，其中所述可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少3.0g。
45.项目43所述的方法，其中所述可溶性白喉蛋白或其突变形式的产率为每升培养物至少4.0g。
46.一种大肠杆菌细胞，其包含有缺陷的sula基因和有缺陷的lon基因。
47.项目46所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞为bl21菌株细胞。
48.项目47所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞为bl21(de3)菌株细胞。
49.项目46至48中任一项所述的大肠杆菌细胞，其中所述细胞在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷。
50.项目49所述的大肠杆菌细胞，其中所述细胞包含有缺陷的rhab基因。
51.项目46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞，其中所述有缺陷的sula基因包含seqidno：10所示的核苷酸序列。
52.项目46至51中任一项所述的大肠杆菌细胞用于通过同源重组进行基因靶向的用途。
53.一种通过同源重组进行基因靶向的方法，所述方法包括在供体底物dna分子存在的情况下，将在项目46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞内的dna分子中引入体内双链断裂。
54.项目53所述的方法，其中使用crispr-cas系统引入所述双链断裂。
55.一种表达系统，其包含项目46至50中任一项所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含与编码多肽的核酸分子可操作地连接的诱导型启动子序列。
56.项目55所述的表达系统，其中所述诱导型启动子是鼠李糖诱导型启动子。
57.一种通过同源重组提高不含lon蛋白酶的大肠杆菌细胞对基因靶向的顺从性的方法，所述方法包括在所述大肠杆菌细胞中引入降低所述大肠杆菌中sula基因的功能的遗传改变。
58.项目57所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞是bl21菌株细胞。
59.项目57或58所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷。
通过阅读以下仅通过示例的方式、参考附图给出的本发明的具体实施方案的非限制性描述，本发明的其他目标、优点和特征将变得更加明显。
附图说明
在附图中：
图1a显示了天然白喉毒素(dtx)的氨基酸序列，其中信号肽以粗体和下划线表示(seqidno：7)。
图1b显示了编码天然白喉毒素(dtx)的核苷酸序列，其中编码信号肽的序列以粗体和下划线表示(seqidno：6)。
图2a显示了本文所描述的研究中使用的嵌合crm197多肽的氨基酸序列(seqidno：3)。ompc分泌信号肽的序列以粗体和下划线表示，该序列替换了dtx的天然信号肽。对应于使所述crm197蛋白无酶活性且无毒的取代(g52e)的谷氨酸(e)残基以下划线表示。
图2b显示了编码图2a的嵌合crm197多肽的核苷酸序列，编码ompc分泌信号肽的序列以粗体和下划线表示(seqidno:2)。
图3a显示了代表大肠杆菌bl21δrhab细胞中crm197产生的sds-page凝胶，所述细胞包含具有不同信号序列的crm197构建体并在烧瓶中培养(8％mopsboltbis-trissds-page，t5h，在凝胶上调整od)。在0.05％葡萄糖存在的情况下，通过添加0.1％l-鼠李糖来诱导蛋白质产生(早期自动诱导)。
图3b显示了代表大肠杆菌bl21δrhab细胞中crm197的产生的sds-page凝胶，所述细胞包含具有不同信号序列的crm197构建体并在dasgip反应器中培养34h或36h(8％mopsboltbis-trissds-page，在凝胶上调节od)。
图3c是显示使用ompt和ompc信号序列(在34h)的描绘crm197产量的bradford测定法和凝胶密度分析法的结果的图。
图4a是显示用含有甘油(菱形)或葡萄糖(圆形)作为碳源的进料溶液培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的生长的图。
图4b是显示在以甘油(左栏)或葡萄糖(右栏)作为碳源的进料溶液培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的周质中crm197蛋白的浓度的图。
图5a是显示在24h(三角形，补料分批结束前4h)或28h(正方形，补料分批结束)诱导的大肠杆菌bl21δrhab细胞的生长的图。
图5b是显示在28h(左栏)或24h(右栏)诱导后培养44h的大肠杆菌bl21δrhab细胞的周质中crm197蛋白的浓度的图。
图6a是显示使用(圆形)或不使用(方形)含有甘油的后进料溶液培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的生长的图。
图6b是显示在不使用(左栏)或使用(右栏)含有甘油的后进料溶液培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的周质中crm197蛋白质的浓度的图。
图7是显示在用不同浓度的l-鼠李糖诱导(在28h时准时诱导)后，在dasgip反应器(2.2l)中于26℃培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的周质中crm197蛋白的浓度的图。
图8是显示在用l-鼠李糖诱导后，在微反应器中于26℃、28℃或30℃培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的周质中crm197蛋白的浓度的图。左栏＝培养12h；右栏＝培养24h。
图9是显示在dasgip反应器中数次发酵运行培养大肠杆菌bl21δrhab细胞28h(诱导时间)后的od600nm的图。
图10a显示了代表在实施例6中所描述的条件下培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞的crm197产量的sds-page凝胶。
图10b是显示bradford测定法和凝胶密度分析法的结果的图，其描绘了在实施例6中所描述的条件下培养的大肠杆菌bl21δrhab细胞中crm197的产率。
图11显示了在本文所描述的研究中使用的突变l-鼠李树胶糖激酶(rhamnulokinase)(rhab)基因的序列(seqidno:8)，其中以粗体和下划线表示的2-核苷酸插入导致移码。
图12描绘了在第一个纯化步骤(阴离子交换色谱法)后的crm197制剂的sds-page凝胶，箭头显示了crm197条带和～40kda污染条带。
图13描绘了在ltqorbitrapxl质谱仪上的经纯化的crm197的完整质量分析。
图14描绘了经纯化的crm197制剂在-80℃、-20℃、4℃和室温下在溶液中保存634天后的sds-page凝胶，箭头指示crm197条带。
图15描绘了使用大肠杆菌w3110δrhab细胞产生的crm197制剂的sds-page凝胶。左侧泳道显示了从bl21δrhabdasgip发酵得到的半纯化crm197，而右侧泳道显示了在dasgip发酵罐中诱导28小时后的w3110δrhab周质提取物。
图16描绘了predcas9质粒的图谱。
图17是显示在bl21大肠杆菌菌株中使用crispr-λred对lacz进行基因靶向后获得的cfu数量的图，允许所述细胞在电穿孔后恢复3小时或24小时。
图18是描述大肠杆菌中sos反应的示意图。
图19是显示在bl21δsula大肠杆菌菌株中使用crispr-λred对lacz进行基因靶向后获得的cfu数量的图。
图20显示了b0023(bl21δrhabδsulaδmale)菌株中sula编码区的核苷酸序列(seqidno:10)。粗体、带下划线的核苷酸被引入sula基因座以生成两个终止密码子(在核苷酸序列上方提供的翻译中显示)。
发明详述
除非本文另有指明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)术语“一个/一种”和“所述/该”以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。
除非本文另有指明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独数值的简写方法，并且每个单独数值都被并入本说明书中，就好像它们在本文中被单独记载一样。范围内的值的所有子集也被并入说明书中，就好像它们在本文中被单独记载一样。
除非本文另有指明或明显与上下文矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。
除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。
本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
在本文中，术语“大约”和“近似”具有其普通含义。它们用于指示数值包括用于确定该数值的设备或方法的固有误差变化，或涵盖接近所列举的数值的数值，例如在所列举的数值(或数值范围)的10％或5％之内。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
在本文所描述的研究中，描述了在大肠杆菌中以高产率生产dtx多肽的表达系统和方法的开发。
用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统
因此，在第一方面，本公开内容提供了一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包含：
鼠李糖分解代谢途径有缺陷的大肠杆菌宿主细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：
(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及
(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含编码与所述第二部分的5'末端连接的周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。
在一个实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌b菌株细胞。
在一个实施方案中，所述异源核酸构建体包含在质粒或载体(例如，表达载体)中。因此，在一个实施方案中，所述表达系统包含在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞包含含有本文所定义的异源核酸构建体的质粒或载体。
所述载体可以是能够介导异源蛋白质在大肠杆菌细胞中表达的任何载体。所述载体可以是，例如，自主或自我复制的质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。有用的表达载体可以由例如染色体、非染色体和/或合成核酸序列片段组成。合适的载体包括具有特定宿主范围的载体，例如，对大肠杆菌b菌株细胞具有特异性的载体，以及具有广泛宿主范围的载体，例如，对革兰氏阴性细菌有用的载体。可以使用“低拷贝”、“中拷贝”以及“高拷贝”质粒。所述载体还可包含选择性标记，例如，赋予抗生素抗性(例如，卡那霉素抗性)的序列和表达盒。
用于在大肠杆菌中表达的有用载体的示例包括：pqe70、pqe60和pqe-9(qiagen，inc.)；pbluescriptvektoren、phagescriptvektoren、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagenecloningsystems，inc.)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540、prit5(pharmaciabio-tech，inc.)；plg338、pacyc184、pbr322、puc18、puc19、pkc30、prep4、pacyc177、pacyc184、prsf1010和pbw22(wilms等人，2001，biotechnologyandbioengineering，73(2)95-103)或其衍生物，例如，质粒pbw22-fab-h或质粒pakl14，以及质粒pd861(atum，newark，california)。其他有用的质粒是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如“cloningvectors”(pouwelsp.h.等编，elsevier，amsterdam-newyork-oxford，1985)。在一个实施方案中，所述质粒是pd861质粒。
本公开内容还涉及使用本文所描述的系统/方法在大肠杆菌宿主细胞中进行重组白喉毒素多肽或其突变形式的周质表达。蛋白质在周质中的表达已经用于工业应用，并且已经在hanahan,j.mol.biol.,166:557-580(1983)；hockney,trendsbiotechnol.,12:456-632(1994)；以及hannig等人,trendsbiotechnol.,16:54-60(1998)中进行了综述。因此，在一些实施方案中，提供了包括在适于表达重组白喉毒素多肽或其突变形式的条件下使鼠李糖分解代谢途径有缺陷的大肠杆菌宿主细胞生长的方法，所述大肠杆菌宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含与周质信号序列融合的编码白喉毒素多肽或其突变形式的核酸序列，其与鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。根据这些方法，获得了完整的可溶性白喉毒素多肽或其突变形式的高产率，并且基本上可以回收所有的可溶性白喉毒素多肽或其突变形式。
蛋白质上的周质分泌信号的存在有助于新翻译的蛋白质通过大肠杆菌内膜运输至周质空间。然后切割信号序列。因此，用指导白喉毒素多肽或其突变形式转移至大肠杆菌的周质的信号序列(周质分泌信号)替换天然白喉棒状杆菌(c.diphtheriae)信号序列最终导致具有相同氨基酸序列的成熟蛋白质。如本文所使用的术语“周质分泌信号”是指通常包含大约15至大约30个氨基酸残基的肽，其具有将白喉毒素多肽或其突变形式靶向大肠杆菌细胞的周质的能力。周质分泌信号肽通常由带正电荷的氨基末端(n-区)、中央疏水核心(h-区)和极性切割区(c-区)组成。周质分泌信号肽的示例包括信号识别颗粒(srp)依赖性信号肽(例如，dsba、tolb或tort分泌信号肽)；sec依赖性信号肽(例如，ompf、ompt、ompc、ompa、phoa、male、lamb、livk或pelb分泌信号肽)；以及双精氨酸转位(twinargininetranslocation，tat)信号肽(例如，tora或sufi分泌信号肽)，或其任何变体、组合或融合。在一个实施方案中，所述周质分泌信号肽包含与天然周质分泌信号肽的序列(例如，在上面所列出的那些)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其保留了分泌所述白喉毒素多肽或其突变形式至所述大肠杆菌b菌株细胞的周质的能力。在一个实施方案中，所述周质分泌信号肽为sec依赖性信号肽。在另一个实施方案中，所述周质分泌信号肽为ompc分泌信号肽(包含mkvkvlsllvpallvagaana(seqidno:1)序列或与seqidno:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列或者由其组成)。应当理解，在本文所描述的方法/过程中有用的信号序列不限于上面列出的那些。在一个实施方案中，当在大肠杆菌中表达时，所述周质分泌信号导致至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％或至少大约95％的多肽被导向周质中。在一个实施方案中，编码所述信号序列的核苷酸序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列相邻，并且在相同的阅读框中。
术语“白喉毒素多肽或其突变形式”是指由白喉棒状杆菌的产毒菌株合成和分泌的天然白喉毒素，或其相对于天然白喉毒素的序列包含一种或多种突变的突变形式。在一个实施方案中，相对于所述天然白喉毒素，所述突变形式具有减弱的毒性。白喉毒素的一种众所周知的突变形式是crm197，它在天然毒素片段a的位置52处包含甘氨酸至谷氨酸的取代(g52e)，其导致adp-核糖基转移酶活性的丧失。白喉毒素的其他已知突变形式包括crm30、crm45、crm228、crm107、crm102、crm103、crm9、crm1001、crm228和crm176(参见，例如johnson和nicholls，journalofbacteriology，1994年8月，第4766-4769页)。在美国专利号7585942和8865866中公开了具有减少的与血管内皮或血管内皮细胞的结合的白喉毒素变体，即白喉毒素的突变形式。在一个实施方案中，本文所定义的系统和方法用于生产天然白喉毒素多肽，因此所述异源核酸构建体包含编码天然白喉毒素多肽的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本文所定义的系统和方法用于生产包含crm197突变的白喉毒素多肽，即在片段a的位置52(g52e)处的甘氨酸至谷氨酸的取代。在另一个实施方案中，本文所定义的系统和方法是用于生产crm197多肽，因此，所述异源核酸构建体包含编码crm197多肽的核苷酸序列。
可以使用重组dna技术制备用于本文所描述的系统和方法的dtx多肽或其突变形式的核苷酸序列。例如，所述dtx多肽或其突变形式可以化学合成或可以基于白喉棒状杆菌携带的白喉毒素天然基因或已知突变体的已知核苷酸序列来制备。在一个实施方案中，所述dtx多肽或其突变形式的核苷酸序列被优化用于在大肠杆菌中表达。可以优化异源核酸的多种序列特征，包括但不限于翻译起始区域的修饰、mrna结构元件的改变以及不同密码子偏好的使用。用于优化核酸序列以改善在大肠杆菌宿主细胞中的表达的方法是本领域众所周知的，并且例如在美国专利号7561972中进行了描述。在一个实施方案中，所述优化的核苷酸序列包含至少优化的密码子。在大肠杆菌中很少使用的密码子的存在可能会延迟所编码的蛋白质的翻译，并导致在所述大肠杆菌宿主细胞中的表达降低。因此，在一方面，大肠杆菌中通用密码子用法被用于优化所述dtx多肽或其突变形式在大肠杆菌中的表达。在其他实施方案中，所述dtx多肽或其突变形式在大肠杆菌中表达的优化还包括干扰性二级结构的最小化。在一个实施方案中，所述优化的dtx多肽或dtx多肽突变体序列是优化的crm197序列。以seqidno：2(图2b)的形式提供了示例性crm197核苷酸序列，该序列被优化用于在连接至编码信号序列的上游区域时在大肠杆菌的周质中表达。用于在大肠杆菌中表达的密码子优化序列可以从例如atum(menlopark，ca)商购获得。优化所述dtx多肽或dtx多肽突变体核苷酸序列以在大肠杆菌中表达的其他策略是本领域已知的，并且可以用作本文所描述的策略的补充或替代。在一个实施方案中，所述dtx多肽或其突变形式包含与所述天然成熟dtx多肽(图1a)或crm197多肽(图2a)的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述dtx多肽或其突变形式包含所述天然成熟dtx多肽(图1a)或crm197多肽(图2a)的序列或者由其组成。在一个实施方案中，编码所述dtx多肽或其突变形式的核苷酸序列与编码dtx多肽(例如，图1b)或crm197多肽(例如，图2b)的天然或优化的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施方案中，编码所述dtx多肽或其突变形式的核苷酸序列包含图1b或图2b所示的核苷酸序列或者由其组成。
本文所描述的系统和方法中使用的大肠杆菌菌株可以是任何大肠杆菌菌株，例如，k-12菌株(例如，mg1655(atcc编号47076)或w3110(atcc编号27325))或b菌株。在一个实施方案中，所述大肠杆菌菌株是大肠杆菌b菌株。
术语“大肠杆菌b菌株”是指来自巴斯德研究所(luria,se&anderson,tf,1942,proc.natl.acad.sci.u.s.a.28127-130；daegelen,p等人,2009,j.mol.biol.394634-43-ncbi分类id37762)的一株大肠芽孢杆菌(bacilluscoli)菌株的克隆后代。b菌株的典型特征是缺乏蛋白酶，在高水平葡萄糖下乙酸产生低以及通透性增强。代表性大肠杆菌b菌株包括bl21(bl21aitm、bl21(de3)、bl21startm(de3)、bl21-gold(de3)、bl21(de3)plys、c41(de3)、c43(de3)、blr(de3)、b834(de3tunertm(de3)、er2566、er2833、er3011、er3012、rel606、atcc11303、b-6、b40、bb、bc251、be、br以及cip54.125菌株。在一个实施方案中，本文所描述的系统和方法中使用的大肠杆菌b菌株是大肠杆菌bl21。
术语“鼠李糖诱导型启动子序列”是指当与基因可操作地连接时，在适量鼠李糖存在的情况下诱导该基因表达的核苷酸序列。这种启动子的示例包括鼠李糖启动子rhasb(wo2003/068956)和鼠李糖启动子rhapbad(wo2004/050877)。在一个实施方案中，所述鼠李糖诱导型启动子包含l-鼠李糖操纵子的rhapbad启动子区域。“l-鼠李糖操纵子”是指如在holcroft和egan，2000，j.bacteriol.182(23)，6774-6782中所描述的大肠杆菌rhasr-rhabad操纵子。所述rhabad操纵子是一种正调控的分解代谢操纵子，它转录rhab、rhaa和rhad，与另一个rha操纵子rhasr转录方向相反，其中约240bp的dna分隔了它们各自的转录起始位点。所述rhasr操纵子编码两种l-鼠李糖特异性激活剂rhas和rhar。rhar调节rhasr的转录，而rhas在相对于rhapbad转录起始位点上游的-32至-81处结合dna。此外，rhasr-rhapbad基因间操纵子在相对于rhapbad的转录起始位点的位置-92.5(crp1)处具有分解代谢调节蛋白(crp)结合位点，以及在相对于rhasr的转录起始位点的位置-92.5(crp2)、-115.5(crp3)和116.5(crp4)处具有crp结合位点，以及相对于rhasr的转录起始位点跨越-32至-82的rhar结合位点。
术语“l-鼠李糖操纵子的rhapbad启动子区域”是指rhapbad操纵子，其主要由rhapbad转录起始位点、推定的-35区、pribnow框、crp结合位点cpr1、相对于rhabad的转录起始位点的rhas结合位点以及crp结合位点crp2-4和相对于rhasr的转录起始位点的rhar结合位点组成。“rhapbad启动子”是指rhapbad操纵子的启动子，其主要由rhapbad转录起始位点、推定的-35区、pribnow框、rhas结合位点和相对于rhapbad的转录起始位点的crp1结合位点区域，以及相对于rhasr转录起始位点的crp结合位点crp4或其一部分组成。在一个实施方案中，所述鼠李糖诱导型启动子包含序列caccacaattcagcaaattgtgaacatcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaaggtcgcgaattcaggcgctttttagactgg(seqidno:4)或由其组成。在另一个实施方案中，所述鼠李糖诱导型启动子包含序列
caccacaattcagcaaattgtgaacatcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaaggtcgcgaattcaggcgctttttagactggtcgtaatgaacaatt(seqidno:5)或由其组成。基于鼠李糖启动子的表达系统可商购获得(例如，
当核酸序列与另一种核酸序列处于功能性关系时，它是“可操作地连接”。例如，如果编码信号序列的dna被表达为参与蛋白质分泌的前蛋白的一部分，则编码该信号序列的dna与编码该蛋白质的dna可操作地连接；如果启动子影响编码序列的转录，则该启动子与该编码序列可操作地连接；或如果翻译起始区域所处位置有利于多肽的翻译，则该翻译起始区域(例如，核糖体结合位点)可操作地连接至编码例如该多肽的核酸分子。可以通过在方便的限制性酶切位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在一个实施方案中，本文所描述的表达系统或载体还包含一种或多种增强子。术语“增强子”是指用于增强转录单位转录的核酸序列，而与转录单位的身份、增强子序列相对于转录单位的位置或增强子序列的方向无关。
本发明人已经发现，通过将生物量生长与通过使用在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌菌株(即不能使用鼠李糖作为碳源)以及鼠李糖作为蛋白质产生的诱导物的重组蛋白诱导分开，可以获得显著改善的产量。因此，本文所描述的系统和方法中使用的大肠杆菌宿主细胞在鼠李糖分解代谢途径中是有缺陷的，即不能使用鼠李糖作为碳源。这可以通过使宿主细胞中参与鼠李糖分解代谢的一种或多种基因失活(例如，突变或缺失)来实现。例如，参与大肠杆菌中鼠李糖分解代谢的三(3)种主要的酶是：l-rha异构酶(rhaa)、l-鼠李树胶糖激酶(l-rhamnulosekinase，rhab)和l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(l-rhamnulose-1-phosphatealdolase，rhad)(参见，例如rodionova等人,2013,frontmicrobiol.2013；4:407)。因此，在一个实施方案中，在本文所描述的系统和方法中使用的大肠杆菌宿主细胞中这3种基因中的一种或多种被灭活。在一个实施方案中，在本文所描述的系统和方法中使用的大肠杆菌宿主细胞具有失活的或有缺陷的l-鼠李树胶糖激酶(rhab)基因。参与鼠李糖分解代谢的一种或多种基因的失活可以使用任何方法进行，例如，通过缺失整个基因或引入阻止功能性蛋白质表达的一个或多个突变(例如，在编码区或启动子/增强子区)。例如，可以通过在所述基因的编码序列中插入一个或多个核苷酸以产生有害的移码来实现rhab基因(基因id：948399)的失活。在另一个实施方案中，通过在rhab基因(seqidno：8)的位置221处插入两个核苷酸、在序列中产生有害的移码来实现rhab基因的失活。
如本文所使用的“缺陷基因”是指在其编码和/或调节区域内包含一种或多种突变的基因，相对于野生型基因，所述一种或多种突变导致所述基因表达减少或丧失，或导致基因产物的活性丧失或基因产物的活性降低。这样的突变包括例如缺失、插入、重排、移码突变、提前终止密码子和取代。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞还包含一种或多种修饰，其可以改善所述细胞的生长和/或所述dtx多肽或其突变形式的产生，例如，通过改善细胞代谢(例如，降低乙酸合成代谢)、减轻压力等。同样，可以修饰所述大肠杆菌宿主细胞以表达或过表达一种或多种蛋白质，以改善或增加白喉毒素多肽或其突变形式在周质中的转运和/或折叠。包含编码用于改善或增加周质中白喉毒素多肽的转运和/或折叠的一种或多种蛋白质的序列的一种或多种核酸可以整合至宿主细胞的基因组中，或整合至质粒/载体中，例如，包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列的相同表达质粒/载体，或不同表达质粒/载体。感兴趣的一种或多种基因的过表达也可以通过将控制所述一种或多种基因表达的天然转录控制元件(例如，启动子)修饰或替换为其他允许所述一种或多种基因更强表达的转录控制元件(例如，更有效的启动子)来实现。可以改善或增加白喉毒素多肽的转运和/或折叠的蛋白质的示例是本领域已知的，并且包括但不限于分子伴侣(例如，skp、dnak、dnaj、caflm和cafla)；参与二硫键形成的蛋白质(例如，dsba、dsbb、dsbc和dsbd)；肽基-脯氨酰基顺反异构酶(例如，ppia、ppid、fkpa和sura)；可溶性伴侣蛋白(例如，mbp、gst和硫氧还蛋白)；参与分泌途径的蛋白质(例如，yebf、male、hlya、水蛭素、ompf和spy)；蛋白酶抑制剂(例如，ycca)；以及缓解输出饱和的蛋白质(例如，pspa)。在一些实施方案中，还可以通过缺失或敲低编码可能不利地影响所述dtx多肽或其突变形式产生的蛋白质的基因来修饰所述大肠杆菌宿主细胞，例如，周质蛋白酶(例如，degp、degq、degs、prc(tsp)等)。
在一个实施方案中，本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞包含参与鼠李糖转运的有缺陷的或失活的基因。在一个实施方案中，本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞包含有缺陷的或失活的l-鼠李糖-质子同向转运蛋白(rhat)基因(大肠杆菌菌株b/bl21-de3的uniprotkb登录号aoa140nh91)。可以使用任何方法来进行所述rhat基因的失活，例如，通过删除整个基因或引入一种或多种阻止功能性蛋白质表达的突变(例如，在编码区或启动子/增强子区)。所述rhat基因的失活与所述rhab基因的失活组合可以允许所述重组蛋白的表达水平以浓度依赖性的方式与诱导物l-鼠李糖的消耗相关。对于在周质中分泌的蛋白质(例如，crm197)，可以通过改变l-鼠李糖的浓度来调节(更好地控制)表达速率，从而减少sec转运子饱和时经常发生的聚集，并因此防止形成包涵体(不溶性crm197)。将平衡从不溶性crm197偏向更理想的可溶性crm197可导致操作更稳健。
在一个实施方案中，在本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞还包含一种或多种修饰，用于改善所产生的白喉毒素多肽的纯度。例如，本发明人使用lc-ms/ms分析发现，sds-page凝胶上的主要污染蛋白条带主要包含两种蛋白质，即麦芽糖转运蛋白亚基(male)和支链氨基酸abc转运蛋白周质结合蛋白(livk)。因此，在一个实施方案中，本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞包含一种或多种修饰，以降低经纯化的白喉毒素多肽制剂中male和/或livk的水平。例如，所述修饰可以包含阻止或减少male和/或livk蛋白表达的遗传改变。可以删除整个male和/或livk基因，或者可以将一种或多种阻止功能性蛋白质表达的突变引入该基因(例如，在编码区或启动子/增强子区)。在一个实施方案中，可以修饰编码一种或多种污染蛋白质的基因(例如，livk)以使所表达的蛋白质包含亲和标签。这种方法对于去除对细胞生长/存活重要的一种或多种蛋白质污染物(例如，livk)尤其有用。如本文所使用的术语亲和标签是指被配体(例如，抗体、另一种蛋白质或金属离子)识别的部分(例如，蛋白质、肽或分子)。常用的亲和标签包括钙调蛋白标签、e-标签、flag-标签、ha-标签、his-标签、myc-标签、ne-标签、s-标签、sbp-标签、strep-标签、v5标签、vsv-标签和生物素标签。可以将编码目标蛋白质污染物的基因修饰为包含编码亲和标签的核苷酸序列。
在一个实施方案中，可以使用通过同源重组进行基因靶向将遗传改变引入本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞。如本文所使用的“通过同源重组进行基因靶向”是指采用同源重组在体内修饰dna序列的基因工程技术。这样的技术是本领域已知的并且可用于原核生物(例如，大肠杆菌)，以将遗传变化引入细菌染色体、质粒和细菌人工染色体(bac)中。这类技术的示例在currentprotocolsinmolecularbiology1.16.1-1.16.39,2014年4月和trendsinbiotechnology,2016,34(7):575-587中进行了描述。可以使用通过同源重组进行基因靶向引入各种遗传变化(包括基因敲除、替换、缺失、插入和点突变)。
在bl21大肠杆菌中，通过同源重组进行基因靶向的效率低，但是，本发明人发现，通过使用包含降低细胞分裂抑制剂蛋白sula(sos检查点控制系统的一部分)的水平或功能的一种或多种遗传改变的bl21大肠杆菌菌株可以改善bl21大肠杆菌中基因靶向的效率。不希望受到理论的束缚，本发明人推测，由于bl21大肠杆菌缺乏lon蛋白酶，因此在bl21大肠杆菌中难以通过同源重组进行基因靶向。
所述sula蛋白是大肠杆菌中的一种细胞分裂抑制剂，其在对dna改变(例如，双链断裂)的sos反应期间被诱导。在野生型大肠杆菌中，sula蛋白被lon蛋白酶迅速降解，使细胞在发生双链断裂修复后恢复细胞分裂。在没有所述lon蛋白酶的情况下，所述sula蛋白比通常情况下持续时间更长，并继续抑制细胞分裂。这种延长的细胞分裂抑制被认为减少了大肠杆菌细胞的数量，其在不含(即缺乏)所述lon蛋白酶的大肠杆菌(例如，bl21菌株大肠杆菌)中通过同源重组进行基因靶向后可以恢复。
因此，在一个实施方案中，本文所描述的方法中使用的大肠杆菌宿主细胞包含一种或多种修饰，以降低sula蛋白在所述宿主细胞中的表达或功能。例如，所述修饰可以包含阻止或减少sula蛋白表达的遗传改变。可以删除整个sula基因，或者可以将阻止功能性sula蛋白表达的一种或多种突变引入sula基因中(例如，在编码区或启动子/增强子区)。预期在任何缺乏lon蛋白酶的大肠杆菌菌株中降低或消除sula的功能都将改善基因靶向的效率。在一个实施方案中，包含一种或多种修饰以降低sula蛋白表达或功能的宿主细胞是bl21菌株大肠杆菌宿主细胞(例如，bl21(de3)菌株大肠杆菌细胞)。另一个实施方案是缺乏lon蛋白酶的大肠杆菌细胞，例如，bl21菌株大肠杆菌细胞，其包含有缺陷的sula基因。包含所述有缺陷的sula基因的大肠杆菌细胞可以用于表达目标异源蛋白质，例如但不限于白喉毒素多肽或其突变形式。由于包含所述有缺陷的sula基因的大肠杆菌细胞适于通过同源重组进行基因靶向(亦称为基因编辑)，因此可以使用通过同源重组进行基因靶向将进一步的突变或遗传改变引入所述细胞中，以改善蛋白质表达水平，去除蛋白质污染物(例如，male和/或livk)，或赋予所述大肠杆菌细胞以任何其他所希望的性状。
进一步提供了一种提高不含lon蛋白酶的大肠杆菌细胞对通过同源重组进行基因靶向的顺从性的方法，该方法包括将降低所述sula基因功能的突变引入所述大肠杆菌细胞。如本文中所使用的，如果相对于在不包含降低所述sula基因功能的突变的相同菌株的大肠杆菌细胞中通过同源重组进行基因靶向的效率而言，在引入了降低所述sula基因功能的突变的大肠杆菌细胞中通过同源重组进行基因靶向的效率增加，则认为通过引入降低所述sula基因功能的突变可以提高大肠杆菌细胞对通过同源重组进行基因靶向的顺从性。例如，相对于在不包含降低所述sula基因功能的突变的相同菌株的大肠杆菌细胞中通过同源重组进行基因靶向的效率而言，通过同源重组进行基因靶向的效率可以提高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍或更高。可以通过计算每摩尔供体底物dna的基因编辑菌落形成单位(cfu)的数量来确定通过同源重组进行基因靶向的效率。例如，如果将单链dna(ssdna)寡核苷酸用作供体底物，则通过同源重组进行基因靶向的效率可以计算为发生基因编辑的cfu数/pmol引入所述大肠杆菌细胞的ssdna。可以使用其他供体底物dna，包括例如基因靶向载体和基因靶向pcr片段。通过同源重组进行基因靶向可以使用本领域已知的任何合适的技术(例如，使用crispr-cas系统)来进行。
用于表达白喉毒素多肽或其突变形式的合适的质粒或表达载体的构建对本领域普通技术人员而言是显而易见的。用于从基因工程化细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)制备重组异源蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的。重组白喉毒素多肽或其突变形式可以通过这些方法中的任何一种在大肠杆菌宿主细胞中表达。可以通过几种标准分子生物学技术中的任何一种将核酸引入大肠杆菌宿主细胞，例如在davis等人,basicmethodsinmolecularbiology(1986)和sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989)中所描述的那些技术，包括但不限于磷酸钙转染、显微注射、电穿孔、接合、感染等。类似地，适合于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体可用于实施本文所描述的方法/过程。例如，可以通过标准技术将合适的dna序列插入载体(例如，质粒)中。
产生白喉毒素多肽或其突变形式的方法/过程
如上所述，本发明人已经发现，通过使用在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷(即不能使用鼠李糖作为碳源)的大肠杆菌菌株以及鼠李糖作为蛋白质产生的诱导物将生物质的生长与重组蛋白诱导解偶联，可以获得显著改善的产量。还发现，当所述培养物在600nm处的光密度od(od600)至少为大约150时，通过启动蛋白质产生的“后期”诱导以及在补料分批条件下进行蛋白质产生步骤，可以获得显著改善的产量。
因此，在另一方面，本公开内容提供了一种用于产生白喉毒素多肽或其突变形式的方法，所述方法包括：
(a)在不含鼠李糖的培养基(即，包含非鼠李糖的碳源的培养基)中培养包含本文所定义的异源核酸构建体的大肠杆菌细胞，直至在600nm处的光密度(od600)达到至少大约150；和
(b)向所述培养物中添加鼠李糖，并用含有碳源的溶液向所述培养物进料足以产生所述白喉毒素多肽或其突变形式的一段时间；以及
(c)从所述细胞的周质收集产生的白喉毒素多肽或其突变形式。
因此，在一个实施方案中，本文所描述的方法包括这样的步骤(例如，上述步骤(a))，其中在生长阶段期间，在阻止所述白喉毒素多肽或其突变形式的表达的条件下(尤其是通过使用包含除诱导物鼠李糖之外的碳源的培养基)培养所述大肠杆菌宿主细胞。在各种实施方案中，所述培养或发酵培养基可以选自丰富培养基、基本培养基和无机盐培养基。在一个实施方案中，所述培养基不含或基本上不含血清和动物源性产物。用于在大肠杆菌中产生重组多肽的合适的培养基是本领域众所周知的。所述培养基可以是适合于在大肠杆菌中表达重组蛋白的确定成分、半确定成分或复合培养基。在一个实施方案中，所述培养基包含大约0.1g/l至大约100g/l、大约1g/l至大约100g/l、大约2g/l至大约80g/l、大约4g/l至大约60g/l、大约5g/l至大约50g/l、大约5g/l至大约20g/l或大约10g/l的酵母提取物。在一个实施方案中，所述培养基包含浓度为至少大约0.001g/l、至少大约0.01g/l或至少大约0.1g/l(例如，至少大约0.01g/l至大约1g/l、大约0.05g/l至大约0.05g/l或大约0.1g/l至大约0.2g/l)的铁源。在一个实施方案中，除鼠李糖以外的碳源是糖(例如，葡萄糖、麦芽糖、乳酸等)；提取物(例如，蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物等)或多元醇(例如，甘油)。在一个实施方案中，所述培养基还包含消泡剂。
在某些实施方案中，表达在生物反应器发酵中进行。可以采用任何规模的发酵，包括1升规模和更大的发酵体积。在一个实施方案中，所述发酵体积为或至少为1升。在其他实施方案中，所述发酵体积为或至少为5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1000升、5000升、10000升、50000升或更多。
在一些实施方案中，所述培养步骤(a)的长度为至少大约16小时、至少大约20小时、至少大约24小时或至少大约28小时。在一些实施方案中，所述培养步骤(a)的长度为大约20小时至大约40小时、大约24至大约32小时、大约26至大约30小时或大约28小时。
在其他实施方案中，培养步骤(a)包括两个阶段，即第一阶段和第二阶段。在一个实施方案中，在所述第一阶段中，所述培养基包含糖(例如，葡萄糖)作为碳源，其浓度为至少大约1g/l、至少大约2g/l、至少大约3g/l、至少大约4g/l、至少大约5g/l、至少大约10g/l、至少大约15g/l或至少大约20g/l。在进一步的实施方案中，糖(例如，葡萄糖)以大约5g/l或10g/l至大约40g/l或50g/l(例如，大约10g/l至大约30g/l)的浓度存在。在一个实施方案中，所述糖以大约20g/l的浓度存在。在一个实施方案中，所述步骤(a)的第一阶段的长度为至少大约6小时、至少大约8小时，至少大约10小时或至少大约12小时。在进一步的实施方案中，所述步骤(a)的第一阶段的长度为大约8小时至大约16小时、大约10小时至大约14小时或大约12小时。在一些实施方案中，所述步骤(a)的第二阶段包括用含有除鼠李糖以外的碳源(例如，葡萄糖)的进料溶液向所述培养物进料。进料流速可以是恒定的或随时间变化。在一个实施方案中，所述进料流速在所述第二阶段期间(线性地或指数地)增加。在一个实施方案中，所述进料流速为至少大约1ml/l/h、至少大约2ml/l/h、至少大约3ml/l/h、至少大约4ml/l/h或至少大约5ml/l/h。在一个实施方案中，所述进料流速为大约1ml/l/h、大约2ml/l/h、大约3ml/l/h、大约4ml/l/h或大约5ml/l/h至大约30ml/l/h、大约40ml/l/h、大约50ml/l/h、大约60ml/l/h、大约80ml/l/h或大约100ml/l/h，例如大约2ml/l/h至大约50ml/l/h或大约5ml/l/h至大约40ml/l/h。在进一步的实施方案中，在所述第二阶段开始时的进料流速为大约1ml/l/h、大约2ml/l/h、大约3ml/l/h、大约4ml/l/h或大约5ml/l/h，以及在所述第二阶段结束时的进料流速为大约30ml/l/h、大约40ml/l/h、大约50ml/l/h、大约60ml/l/h、大约80ml/l/h或大约100ml/l/h。在一个实施方案中，在所述第二阶段开始时的进料流速为大约5ml/l/h。在一个实施方案中，在所述第二阶段结束时的进料流速为大约40l/l/h。在一个实施方案中，所述步骤(a)的第二阶段的长度为至少大约6小时、至少大约8小时、至少大约10小时或至少大约12小时。在进一步的实施方案中，所述步骤(a)的第一阶段的长度为大约8小时至大约18小时、大约20小时、大约22小时或大约24小时。在一些实施方案中，所述步骤(a)的第二阶段的长度为大约10小时或大约12小时至大约18小时或大约20小时。在一个实施方案中，所述步骤(a)的第二阶段的长度为大约16小时。在另一个实施方案中，在所述步骤(a)的第二阶段期间使用的进料溶液包含除鼠李糖以外的碳源，例如，葡萄糖，其浓度为至少大约100g/l、至少大约200g/l、至少大约300g/l或至少大约400g/l，例如，大约200g/l、大约300g/l或大约400g/l至大约700g/l、大约800g/l或大约900g/l。在一个实施方案中，除鼠李糖以外的碳源的浓度为大约600g/l至大约700g/l，例如大约650g/l。
当在步骤(a)中达到合适的目标培养细胞密度时，加入合适量的诱导物鼠李糖以启动蛋白质的产生。本发明人已经发现，当所述培养物在600nm处的光密度(od600)为至少大约150时(例如，至少大约180)时，通过启动蛋白质产生的“后期”诱导，可以获得显著改善的产量。在一些实施方案中，在诱导时所述培养物的od600为至少大约160、至少大约170、至少大约180、至少大约190、至少大约200、至少大约210、至少大约220、至少大约230或至少大约240。在一些实施方案中，在诱导时所述培养物的od600为大约150、160、170、180、190或200至大约220、230、240、250、260、270、280、290或300，例如，大约180至大约220。在一些实施方案中，用于诱导的鼠李糖(例如，l-鼠李糖)的浓度为至少大约0.0004％(w/v)、至少大约0.005％(w/v)、至少大约0.01％(w/v)或至少大约0.1％(w/v)。在一些实施方案中，用于诱导的鼠李糖(例如，l-鼠李糖)的浓度为大约0.0004％至大约1％(w/v)、大约0.005％至大约0.5％(w/v)、大约0.01％至大约0.2％(w/v)或大约0.01％至大约1％(w/v)，例如大约0.05％(w/v)。在一个实施方案中，所述步骤(b)的长度为至少大约2小时、至少大约3小时、至少大约4小时、至少大约5小时或至少大约6小时。在进一步的实施方案中，所述步骤(b)的长度为大约4小时或大约5小时至大约7小时或大约8小时，例如大约6小时。在一个实施方案中，存在于所述步骤(b)的进料溶液中的碳源包含或是不干扰鼠李糖诱导的碳源(例如，甘油)。在另一个实施方案中，存在于所述步骤(b)的进料溶液中的碳源(例如，甘油)的浓度为至少大约100g/l、至少大约200g/l、至少大约300g/l或至少大约400g/l，例如，大约200g/l、大约300g/l或大约400g/l至大约700g/l、大约800g/l或大约900g/l。在一个实施方案中，存在于所述步骤(b)的进料溶液中的碳源的浓度为大约600g/l至大约700g/l，例如大约665g/l。在所述步骤(b)中的进料流速可以是恒定的或随时间变化。在一个实施方案中，在所述步骤(b)中的进料流速是恒定的。在一个实施方案中，在所述步骤(b)中的进料流速为至少大约1ml/l/h、至少大约2ml/l/h、至少大约3ml/l/h、至少大约4ml/l/h或至少大约5ml/l/h。在一个实施方案中，在所述步骤(b)中的进料流速为大约1ml/l/h、大约2ml/l/h、大约3ml/l/h、大约4ml/l/h或大约5ml/l/h至大约30ml/l/h、大约40ml/l/h、大约50ml/l/h、大约60ml/l/h、大约80ml/l/h或大约100ml/l/h，例如，大约2ml/l/h至大约30ml/l/h或者大约5ml/l/h或10ml/l/h至大约20ml/l/h，例如大约14ml/l/h。
大肠杆菌宿主细胞的生长、培养和/或发酵在允许存活的温度范围内进行，并且在一个实施方案中为大约20℃至大约30℃、大约35℃或大约40℃、大约22℃至大约30℃、大约24℃至大约28℃、大约25℃至大约27℃，例如大约26℃。在一个实施方案中，所述步骤(a)在大约20℃至大约30℃、大约35℃或大约40℃、大约22℃至大约30℃、大约24℃至大约28℃、大约25℃至大约27℃(例如，大约26℃)的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(b)在大约20℃至大约30℃、大约35℃或大约40℃、大约22℃至大约30℃、大约24℃至大约28℃、大约25℃至大约27℃(例如，大约26℃)的温度下进行。
在一个实施方案中，所述方法包括在大约37℃的温度下进行预培养(例如，大约8小时至大约16小时、大约10小时至大约14小时或大约12小时)，并且随后在用鼠李糖诱导之前和之后在上述温度下生长。在其他实施方案中，培养包括在用鼠李糖诱导之前和之后在大约26℃下生长。
在一些实施方案中，将所述培养物的ph维持在大约6.5至大约7.5、大约6.5至大约7.0或大约6.7至大约6.9，例如大约6.8。
应当理解，可以改变诱导时的细胞密度、诱导物的浓度、ph和温度，以确定表达的最佳条件。
在一些实施方案中，每升培养物获得的可溶性白喉毒素多肽或其突变形式的产率为至少大约2.0g/l、至少大约2.5g/l、至少大约3.0g/l、至少大约3.5g/l、至少大约4.0g/l、至少大约4.5g/l、至少大约5g/l、至少大约5.5g/l、至少大约6.0g/l，或至少大约7.0g/l。在其它实施方案中，所获得的可溶性白喉毒素多肽的产率为大约2.0g/l至大约12.0g/l、大约2.0g/l至大约10.0g/l、大约2.0g/l至大约9.0g/l、大约2.0g/l至大约8.0g/l、大约3.0g/l至大约10.0g/l、大约3.0g/l至大约9.0g/l、大约3.0g/l至大约8.0g/l、大约4.0g/l至大约10.0g/l、大约4.0g/l至大约9.0g/l、大约4.0g/l至大约8.0g/l、大约5.0g/l至大约10.0g/l、大约5.0g/l至大约9.0g/l、大约5.0g/l至大约8.0g/l或大约5.0g/l至大约7.0g/l。如本文所使用的“可溶性白喉毒素多肽或其突变形式的产率”意指由所述大肠杆菌以可溶性形式产生的白喉毒素多肽或其突变形式的产率。“可溶性白喉毒素多肽或其突变形式的产率”不意图包括由所述大肠杆菌以不溶性形式产生并随后进行增溶处理(例如，用增溶剂例如盐酸胍、尿素或sarkosyl将蛋白质转化为可溶性形式的处理)的蛋白质。
白喉毒素多肽或其突变形式可以通过本领域已知的方法进行纯化，参见例如在wo2011/123139；us6689871和rappuoli等人,journalofchromatography,268,1983,pp543-548中所描述的方法。在一个实施方案中，所述纯化包括离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱和/或混合模式色谱。在一个实施方案中，所述纯化包括亲和色谱。亲和色谱对于从如上所述经修饰以包括亲和标签的制剂中去除蛋白质污染物特别有用。亲和色谱的一个示例是与包含his-标签的蛋白质结合的固定化金属亲和色谱(imac)，或者是使用与包含生物素标签的蛋白质结合的包含亲和素或链霉亲和素的树脂的亲和色谱。
已经很好地建立了表征产率、纯度、稳定性、切口程度、毒性、内毒素含量的方法，并定义了用于疫苗中的白喉毒素多肽或其突变形式的质量。白喉毒素多肽或其突变形式的分析可以通过以下方式进行，例如，高效尺寸排阻色谱法、等电聚焦、elisa、bradford测定、sds-page和westernblot，通过质谱法确定分子量、n-末端测序、氨基酸分析、反相液相色谱、电喷雾质谱和胰蛋白酶消化后通过质谱进行的肽图分析。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步详细说明本发明。
实施例1：不同周质分泌信号肽的评估
比较了不同的周质分泌信号肽。在烧瓶中检测了以下信号序列：mglb、tort、ompc、ompt(突变形式)、omptr(ompt的原始形式)、omptch(ompt的突变形式，更疏水)、omptcinv(ompt的另一种突变形式)、ompa、ompf、lamb、piii、sufi、tora、sfmc、azu、ibp、1834。在发酵罐中检测了以下信号序列：azu、ibp、1834、ompt(突变形式)、omptr、omptcinv、ompc、ompf。
在鼠李糖诱导型启动子的控制下，使用crm197构建体，使用不同的信号序列在烧瓶中进行了进一步的检测。结果如图3a所示。ompc、ompt(突变形式)、omptr和omptch在烧瓶中得到了相似的结果，然后在反应器中进行评估。如图3b和3c所示，使用ompc信号序列实现了更好的生产。
实施例2：进料期间的碳源
在鼠李糖诱导型启动子的控制下，使用包含ompt信号序列(突变形式)的crm197构建体，比较了包含两种不同碳源(葡萄糖和甘油)的进料溶液。准时添加鼠李糖用于诱导所述培养物。调节碳源浓度，使得通过进料递送相同摩尔量的碳。在生长方面，葡萄糖和甘油之间没有太大差异(图4a)，但是在葡萄糖上生长44h的培养物产量要高得多(大约2-3倍)(图4b)。
实施例3：诱导时间
在分批阶段使用葡萄糖(参见图4b)，只有当葡萄糖因分解代谢抑制而耗尽时才能出现生产。表达的诱导可以在补料分批阶段(在24h时)进行，因为在该阶段葡萄糖是有限的，但是所进行的检测表明，后期诱导(28h)更有效(更高的生物量、更高的产量)，如图5a和5b所示。诱导似乎阻止了生长，因此使用后期诱导将生长和生产解偶联得到了更高的产量。这些检测使用在鼠李糖诱导型启动子控制下的包含ompt信号序列(突变形式)的crm197构建体完成。
实施例4：诱导后进料
接下来检测了诱导后添加第二次进料是否改善产量。选择甘油以避免葡萄糖对鼠李糖启动子的负反向控制，并调节进料速率(每升起始体积14ml/h)以满足细菌的需要，同时限制副产物形成(乙酸)。图6a和6b所示的结果表明，使用甘油的诱导后进料可以增加生物量和蛋白质产量。这些检测使用在鼠李糖诱导型启动子控制下的包含ompt信号序列(突变形式)的crm197构建体完成。
实施例5：诱导条件
然后，在培养28h时，在dasgip反应器(2.2l)中准时添加各种浓度(0.05％、0.1％和0.2％)的鼠李糖。在所有浓度下均获得了良好的产量，其中0.05％得到的产量略高。在微反应器中于不同温度(26℃、28℃或30℃)下准时添加0.1％l-鼠李糖的其他检测表明，在12h(左柱)或24h(右柱)后，26℃的温度使蛋白质产量更好(图7)。
实施例6：用于生产crm197的优化方法
1-细菌菌株和构建体
所使用的细菌菌株是带有质粒pd861-ompc-crm197的大肠杆菌bl21δrhab，其大肠杆菌优化的crm197基因在rhapbad启动子的控制下，并具有卡那霉素抗性。在优化的crm197基因序列的5'末端添加了编码ompc信号序列(mkvkvlsllvpallvagaana，seqidno：1)的核苷酸序列，从而允许在细胞的周质中产生crm197。ompc-crm197构建体的氨基酸和核苷酸序列分别在图2a和2b中示出。
通过在编码允许鼠李糖分解代谢的第二种酶(l-鼠李树胶糖激酶(rhab))的鼠李糖基因的位置221处插入两个核苷酸而使该基因突变(失活)，从而在序列(图11，seqidno:8)中产生有害的移码。
这种突变阻止了细胞利用鼠李糖作为碳源。
2-培养基和溶液
a)预培养：
sb或lb培养基+50mg/l卡那霉素
b)发酵培养基rie+
发酵培养基的配方是基于riesenberg(highcelldensitycultivationofescherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate.jbiotechnol.1991年8月；20(1):17-27)中所描述的培养基，并有一些改动。培养基中富含10g/l的酵母提取物以制成半合成形式，从而允许高细胞密度发酵，并且已增加铁浓度。将l-鼠李糖一水合物用作诱导物，并将抗生素硫酸卡那霉素添加至所述培养基。
c)用于生长的进料溶液
使用的进料溶液不同于riesenberg(同上)中公开的进料溶液。在补料分批期间使用基于葡萄糖的进料(650g/l的葡萄糖)以增加生物量。用于生长的进料溶液还包含(nh4)2so4、nh4cl和mgso4-7h2o。
d)用于诱导后的进料溶液
在诱导后补料分批期间使用基于进料的碳源(665g/l的甘油)，以避免生产期间的碳限制。诱导后的进料溶液还包含(nh4)2so4、nh4cl和mgso4-7h2o。
e)使用的其他溶液/试剂
酸：5m磷酸
碱：28-30％氢氧化铵
消泡剂：消泡剂2041/3
3-预培养
通过在含有25ml的lb或sb培养基+50mg/l卡那霉素的250-ml的烧瓶中接种从bl21δrhab/pd861-ompc-crm197冷冻培养物中刮取的一环材料来制备预培养物。在37℃下孵育12小时，以250rpm振荡。第二天，通过湿涂片观察检查纯度。在含有1.0lrie+培养基的2.2l反应器中以经计算可使600nm的初始od达到大约0.1的体积进行接种。
4-发酵
发酵过程分为两个阶段。培养的第一阶段目标是生长以产生生物量，并且包括一个关于葡萄糖的分批阶段和具有线性进料速率(也含葡萄糖)的补料分批阶段，直到生物量达到最大。然后实施第二阶段，该阶段的目标是重组crm197生产而非生长。它包括葡萄糖进料的结束、添加鼠李糖进行诱导以及在甘油上建立恒定的诱导后进料。
每个含有1lrie+培养基(此时未添加鼠李糖)、20g/l葡萄糖+卡那霉素(50mg/l)的玻璃发酵容器(使用来自
当所述葡萄糖进料结束时，在培养28h时(此时，od600nm通常为140至190，平均为大约164–参见图9)用0.05％(w/v)l-鼠李糖诱导细胞。立即开始诱导后进料(进料速率为14ml/h)，持续6h，并收集蛋白质(培养34h被确定为收获具有最高产量的最佳时间)。还评估了所使用的进料速率避免甘油积累和副产物产生的能力。从所述容器定期采样以测定od600nm、ph、有机酸和蛋白量(总蛋白和重组蛋白)。
将2.2l
5-细胞裂解和周质级分分离
所述crm197蛋白在细胞的周质中产生。将收获的相当于3od600nm培养物的细胞沉淀重悬浮于1ml冷的tes溶液(0.5m蔗糖、0.2mtrisph8.0、0.5mmedta)中，在4℃温和搅拌下孵育5分钟，并以13000rpm离心3分钟。弃去上清液；将所述沉淀用0.5ml冷的
实施例7：经纯化的crm197制剂中主要蛋白质污染物的鉴定
从所述周质提取物中纯化crm197的过程涉及三个步骤，阴离子交换柱、疏水柱和混合模式柱。在该过程结束时，确定了crm197的纯度为97-98％。在～40kda的sds-page凝胶上略微可见一条污染条带。从所述凝胶中提取在第一个纯化步骤后看到的污染条带(图12)，并通过液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)进行分析。所测序的肽与两种大肠杆菌蛋白即麦芽糖转运蛋白亚基(male)和支链氨基酸abc转运蛋白周质结合蛋白(livk)相匹配。从所述制剂中除去这两种蛋白质或其中任一种将导致更纯的crm197。
实施例8：使用sula敲除来改善bl21中通过同源重组进行基因编辑的效率
概述
在bl21大肠杆菌中难以通过同源重组进行基因编辑。本发明人通过尝试使用crispr-λred系统对bl21中的lacz报道基因进行基因编辑来举例说明，如在zhao,d.等人,microbialcellfactories.15:205(2016)和在li,y.等人.metabolicengineering.31:13-21(2015)中所描述的。重组效率非常低，但是获得了一些lacz突变体。在确认存在正确的突变后，对一个克隆进行全基因组测序以鉴定任何脱靶突变。在所述sula基因中鉴定到一个移码突变。
sula是一种高度不稳定的蛋白质，当sos反应被双链dna断裂激活时，它会阻止细胞分裂(ishii,y和amano,f.,biochemj.358:473-80(2001))。一旦dna修复完成，sula很快就会被所述lon蛋白酶清除。但是，该蛋白酶在bl21大肠杆菌中是不存在的，使得sula存在和阻止细胞分裂的时间远远长于在包含所述lon蛋白酶的大肠杆菌菌株中的时间。
为了确定由crispr-λred基因靶向产生的任何其他lacz突变体中是否存在sula突变，然后在所获得的七个克隆中对所述sula基因进行测序。所有七个克隆在sula的启动子/操纵子区都具有突变或破坏所述sula编码序列的突变。
1-使用crispr-λred基因靶向系统靶向lacz
使用pgrb质粒作为模板(addgene#71539)，通过pcr和goldengateassembly方法，构建了产生靶向所述lacz基因的向导rna的质粒。得到的质粒(pgrb-lacz)将使用非常强的合成启动子表达grna。
同时，将含有酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9基因以及λ-red重组酶基因和额外拷贝reca的质粒predcas9(图16)转化至w3110(用作k-12对照菌株)和bl21菌株中。按照标准实验方案制备用于携带predcas9的这些菌株的感受态细胞，但是在存在(或不存在)iptg的情况下诱导λ-red重组酶基因表达。
然后在0.1nmol的ssdna和100ng制备的pgrb-lacz质粒存在的情况下对感受态细胞进行电穿孔。所述ssdna由包含9个待改变的核苷酸(产生2个终止密码子)的寡核苷酸组成，两侧各有40个同源核苷酸。为了防止寡核苷酸的核酸酶消化，四个第一核苷酸具有硫代磷酸酯键而不是磷酸二酯键，其用硫原子取代了磷酸主链中的非桥连氧。在30℃恢复3小时或24小时后，将所述细胞接种在含有壮观霉素、氨苄青霉素和x-gal的琼脂板上，并在30℃孵育长达48小时。
为了确认该敲除方法的有效性，首先使用k-12w3110菌株敲除lacz基因。使用电穿孔后3小时的恢复时间，以及在琼脂板上孵育24小时后，获得>900cfu/pmol的ssdna(所有白色菌落，2个蓝色菌落除外)。对五个w3110克隆进行了测序，所有克隆均具有预期的lacz基因突变。
然后，使用bl21菌株进行相同的实验。如图17所示，在存在或不存在λ-red重组酶的情况下，使用ssdna作为供体dna的标准同源重组实验方案没有产生任何克隆。ssdna的序列提供为seqidno：9。但是，当表达靶向lacz的grna的质粒pgrb-lacz存在时，获得了少量菌落(＜3cfu/pmolssdna)。这些菌落仅在琼脂板上孵育48小时后才出现，并且所述菌落异常小。
扩增并测序lacz基因中预期突变周围的500bp区域。当噬菌体重组酶基因表达时，所有bl21克隆均显示由所述ssdna引入的突变，而在噬菌体重组酶表达不存在的情况下，5个克隆中只有2个包含预期的突变。
通过crispr-λred方法创建的bl21δlacz突变体克隆中的一个的基因组被完全测序，以检测任何脱靶突变。当将其与亲本菌株(bl21)的基因组进行比较时，在突变体基因组中仅观察到两个差异。首先，mcrb和可移动元件insb-30之间的缺失已完全去除了基因syme。该基因的产物是由sos反应调节的毒素-抗毒素系统的一部分。
当细菌的基因组dna破坏时(此处是通过cas9)，所述sos反应会抑制symrrna(一种抑制syme翻译的非编码rna)的转录。毒素syme将抑制细胞内的转录并切割所有mrna，直到基因组dna被修复。在所检测的7个突变体中有2个检测到了这种缺失。
在所检测的全部7个克隆中，在所述sula基因(或其启动子/调控区)中也鉴定出突变。表1提供了所鉴定的sula突变的总结。
表1：在bl21δlacz突变体克隆中sula基因座中鉴定出的突变。
如图18所示，sula将与ftsz结合，抑制细胞分裂，以便使细胞有时间响应于双链断裂而修复其基因组dna。一旦dna修复完成，sula就会被所述lon蛋白酶快速清除，但是对于不表达lon的bl21菌株，sula抑制细胞分裂的时间更长。
sos反应的一部分是低保真度的dna聚合酶的转录，它会在基因组中产生突变，例如我们观察到的sula突变。本发明人相信，这些sula突变允许细胞分裂，因此生长可以重新开始，从而导致在恢复48小时后观察到的少数菌落。
2-检测sula突变对bl21中crispr-cas9基因编辑效率的影响
为了证实由cas9的dna损伤引起的sos反应结合lon蛋白酶的缺乏是bl21中重组效率低的原因，我们使用上面所描述的方法在bl21δsula突变体中重复了lacz敲除。
如图19所示，与先前使用具有野生型sula基因的bl21菌株(<3cfu/pmol的ssdna)的实验相比，当在bl21sula基因敲除菌株(～375cfu/pmol的ssdna)中使用crispr-λred方法时，重组效率提高了约300倍。检测的所有白色克隆(10/10)均显示出预期的lacz突变。
已经使用crispr-cas9进行了进一步的实验以靶向bl21δsula背景中的其他基因。利用这种背景，本发明人已经成功地敲除了degp、elad、rhat和male；将精确突变引入必需基因(secy)，并在基因组中复制基因(dsba、dsbc)。
实施例9：去除经纯化的crm197制剂中的主要蛋白质污染物如在实施例8中所描述的，bl21中sula突变的存在极大地提高了crispr-cas9进行基因编辑的效率。本发明人希望通过基因编辑靶向male和livk，以从所述crm197蛋白制剂中去除male和livk蛋白污染物。因此，为了改善基因靶向过程的效率，将δsula包括在背景中，并在bl21δrhabδsula菌株中靶向这些基因。所采用的sula突变的序列如图20所示(seqidno：10)。
为了确定male是否是crm197制剂的主要～40kda污染物，通过crispr/λred方法，使用predcas9和pgrb质粒创建了male敲除菌株(zhao等人,microbialcellfactories.15:205(2016)；li,y.etal.metabolicengineering.31:13-21(2015))。靶向male基因开始的ssdna用于改变79-86位核苷酸并产生3个终止密码子的插入。在通过测序验证了预期的突变和去除crispr质粒后，将表达crm197的质粒插入所得菌株中(b0023＝bl21δrhabδsulaδmale)。使用自诱导实验方案从所述突变菌株表达crm197。简而言之，将0.1％(w/v)l-鼠李糖和0.05％(w/v)葡萄糖添加至25mllb培养基中，并接种预培养物b0023/pd861-ompc-crm197。将烧瓶在26℃下孵育5小时。通过渗透压休克从20ml培养物中提取周质蛋白，将其施加在阴离子交换柱上，并在sds-page凝胶上显现。同时，将相同的过程应用于表达crm197的bl21δrhab克隆。在δmale突变体中仍可见污染的～40kda蛋白，证明了～40kda的主要蛋白质污染物是livk。
livk是一种氨基酸转运蛋白，如果被删除可能会影响细胞的健康。为了容易地从所述crm197制剂中除去污染蛋白质，将使用与所描述的用于敲除male的crispr/λred方法相同的方法将亲和标签(例如，组氨酸标签(his标签))添加至蛋白质的c末端。突变将在所述b0023菌株(bl21δrhabδsulaδmale)中完成。为了检测该方法的效率，将按照如上所述对培养物进行自动诱导，并首先通过结合所述his标签的固定化金属亲和色谱(imac)色谱柱进行周质蛋白提取，然后将其施加至阴离子交换柱。洗脱级分将在sds-page凝胶上显现，以观察所述污染蛋白质的减少或消失。
实施例10：鼠李糖转运蛋白缺陷型大肠杆菌菌株的制备
本文所描述的用于在大肠杆菌中产生crm197的系统依赖于鼠李糖诱导。为避免细胞消耗所述诱导物，删除了l-鼠李糖利用途径中的第二种酶(rhab)，从而允许所述细胞使用固定量的诱导物来表达crm197。为了改善表达的可调性，除了所述rhab缺失外，还引入了鼠李糖转运蛋白(rhat)突变。在缺乏rhab和rhat的大肠杆菌中，重组蛋白的表达速率可以以l-鼠李糖浓度依赖性的方式进行调节(hjelm,a.等人.acssyntheticbiology.6:985-994(2017))。在蛋白质分泌至周质的情况中，例如对于crm197，降低所述l-鼠李糖浓度并因此降低表达速率可以减少在sec转运体(在膜中的孔，crm197通过其穿过膜进入周质空间)饱和时经常发生的聚集。因此，降低表达速率可以防止包涵体(不溶性crm197)的形成。将平衡从不溶性crm197偏向可溶性crm197可导致过程更稳健，并且通常导致有用(可溶性)crm197更多。使用crispr/λred方法，在rhat基因的前39个碱基后插入5个核苷酸产生2个终止密码子来破坏rhat基因，从而产生了rhat缺陷型bl21菌株。通过所述rhat基因的扩增和测序证实了预期突变的存在。
实施例11：经纯化的crm197的分析
对如实施例6中所描述的制备并通过标准方法纯化的crm197进行分析性表征，并与商用crm197(pfenexcrm-reagentproteins,sandiego,ca)进行比较，以评估由本文所描述的方法制备的crm197的结构完整性、溶解度、活性和构象稳定性。
通过完整的质量分析验证了经纯化的crm197的分子量和不存在信号序列。crm197的预测分子量为58413da，通过完整质量分析计算的分子量为58407da。完整质量分析的结果如图13所示。此外，通过在ltqorbitrap上的nlc-ms/ms分析验证了crm197序列。
经纯化的crm197的二级和三级结构使用圆二色性进行了验证，如在analyticalbiochemistryvolume1994；222(1):176-184和natureprotocols2006；1(6):2876-2890中所描述的。该分析证实了经纯化的crm197具有与商用crm197相同的二级和三级结构。
通过在反应缓冲液(10mmtris-hclph7.6,2.5mmcacl2,2.5mmmgcl2)中将2.5μg经纯化的crm197与500ngλdna(λdna，#n3011s，newenglandbiolabs)以10μl的最终体积在37℃下孵育30min、1h、4h、8h和24h来确定经纯化的crm197的核酸酶活性。通过添加2μl含有10mmedta(purple6x,#b7024s,newenglandbiolabs)的凝胶负载染料停止反应，并使用琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)进行分析。在相同的反应缓冲液中进行含有λdna的阴性对照反应，并在不存在crm197的情况下暴露于相同的反应条件。24h后，在测试反应中λdna几乎被完全消化，但在阴性对照中保持完整。
通过将半纯化的crm197的等分试样在不同温度下储存在溶液中或以干燥样品的形式储存，然后在sdspage凝胶上显现以观察降解是否明显，来评估纯化的crm197的稳定性。通过周质提取，然后进行阴离子交换色谱来制备半纯化的crm197。所述溶液样品在室温、4℃、-20℃和-80℃下储存多达634天。所述干燥样品在4℃下储存多达634天。在-20℃或-80℃下储存634天后，在所述溶液中的crm197没有明显的降解迹象。仅在随后的三个冻融循环之后，储存在-20℃的溶液样品才开始显示出明显的降解迹象。同样，在4℃下储存634天的干燥样品也没有显示出明显的降解迹象。
在4℃或室温下储存在溶液中的cmr197等分试样在储存194天后明显完好无损。储存634天后，在4℃下储存的溶液样品部分降解，在室温下储存的溶液样品似乎完全降解。图14显示了在-80℃、-20℃、4℃和室温下储存634天后在sds-page凝胶上跑胶的经纯化crmr197的溶液样品。
对经纯化的crm197的分析证实，根据本文所描述的方法制备的crm197等同于可商购获得的crm197。
实施例12：在w3110中crm197的产生
1-细菌菌株和构建体
所使用的细菌菌株是具有质粒pd861-ompt(突变形式)-crm197的大肠杆菌w3110δrhab，大肠杆菌优化的crm197基因受rhapbad启动子的控制，并具有卡那霉素抗性。
如上面对大肠杆菌bl21菌株δrhab所描述的，编码允许鼠李糖分解代谢的第二种酶l-鼠李树胶糖激酶(rhab)的鼠李糖基因通过在该基因的位置221处插入两个核苷酸，从而在序列(图11，seqidno：8)中产生有害的移码而发生突变(失活)。
这种突变阻止了细胞利用鼠李糖作为碳源。
2-发酵、细胞裂解和周质级分分离
如实施例6中所描述的，将w3110δrhab菌株用于在dasgip发酵罐中进行的发酵实验(除了没有诱导后进料之外)，随后也如实施例6中所描述的进行细胞裂解和周质级分分离。
将所述周质级分在sds-page凝胶(bolt8％bis-tris，mops缓冲液)上跑胶，以确认crm197的产生(图15，右泳道)。存在crm197，但在相同条件下表达水平低于bl21δrhab菌株。
尽管本发明已通过其具体实施方案在上文中进行了描述，但是在不偏离如所附权利要求限定的本发明的精神和实质的情况下，可以对其进行修改。
序列表
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