用于增加蛋白产量的细胞系和方法与流程

序列表

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本技术总体上涉及用于增加各种细胞系中的重组蛋白产量的方法。在实施例中，对ulk1基因的作用进行削弱，从而使细胞系的蛋白产量增加。还提供了具有增加的蛋白产量的细胞系，以及制备此类细胞系的方法。

背景技术：

随着生物药物在医学中变得越来越重要，需要从各种细胞类型(包括真核细胞，例如哺乳动物细胞)来提供增加的治疗性蛋白的收率。这还涉及对高且稳定表达的重组细胞系，特别是哺乳动物细胞系的需求。

用于制备治疗性蛋白的重组细胞克隆的产生通常需要广泛筛选各个克隆以检测和分离高表达的克隆。然而，即使在筛选方法的过程中鉴定出高表达的克隆，这些最初高表达的克隆常常也会随着时间的推移失去其有利的表达特性，并且表达收率随着时间的推移而降低。因此，必须加以关注以便在一群成功表达的细胞中鉴定出那些在长期培养期间也具有高产生稳定性并因此不易逐渐丧失重组蛋白表达的细胞。因此，用于大规模制备治疗性蛋白和其他重组多肽的重组细胞克隆的产生通常包括对各个克隆进行过度且费时的筛选，以便鉴定高表达的细胞克隆，这些克隆也显示出大规模产生所必需的表达稳定性。

因此，需要一种从各种细胞系产生大量重组蛋白的方法，以及产生此类细胞系的方法。

技术实现要素：

鉴于前述内容，本文提供了用于削弱基因(包括ulk1基因)的作用的方法，这种削弱可转化为蛋白产量的增加。还提供了用于制备细胞系以增加蛋白产量的方法，以及用于鉴定可以被削弱并因此使蛋白产量增加的基因的方法。

本文的实施例涉及其中ulk1基因的表达产物的作用受到削弱的分离的细胞。

示例性细胞包括真核细胞，包括哺乳动物细胞，例如人胚肾(hek)细胞和中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

在实施例中，通过突变或编辑分离的细胞中的ulk1基因来削弱ulk1基因的表达产物的作用。合适地，突变或编辑消除了或削弱了ulk1基因的表达产物的一个或多个催化残基，或经翻译后修饰的ulk1基因的表达产物的一个或多个残基。在另外的实施例中，突变或编辑减少了细胞中ulk1基因的表达或敲除了ulk1基因。

在进一步的实施例中，通过转录后基因干扰来削弱ulk1基因的表达产物的作用，该转录后基因干扰可包括sirna干扰、微rna干扰、反义rna干扰或小分子干扰。

在实施例中，与其中ulk1基因的表达产物的作用未受到削弱的细胞相比，ulk1基因的表达产物的作用的削弱会导致重组蛋白产量的增加。合适地，重组蛋白的产量增加至少约30％，并且在其他实施例中，重组蛋白的产量增加约50％至约500％。

合适地，重组蛋白是分泌蛋白、膜锚定蛋白或细胞内蛋白。在实施例中，重组蛋白是抗体。

本文还提供了产生重组蛋白的方法。此类方法包括将编码重组蛋白的重组基因引入其中ulk1基因的表达产物的作用已受到削弱的分离的细胞中。在允许重组蛋白表达的条件下培养分离的细胞。然后如果重组蛋白是由分离的细胞分泌的，则从分离的细胞或从培养基中分离重组蛋白。

还提供了产生用于重组蛋白制备的分离的细胞的方法，这些方法包括削弱分离的细胞中ulk1基因的表达产物的作用，以及在允许分离的细胞扩增的条件下培养分离的细胞。

在仍另外的实施例中，本文提供了筛选基因的方法，该基因的表达产物在受到削弱时会导致重组蛋白的产量增加。这些方法包括削弱分离的细胞中基因表达产物的功能以产生受削弱的分离的细胞，以及将编码重组蛋白的重组基因引入受削弱的分离的细胞中。然后在允许重组蛋白表达的条件下培养受削弱的分离的细胞，并从受削弱的分离的细胞中分离重组蛋白。确定重组蛋白的产生体积，并将其与基因的表达产物的作用未受到削弱的细胞中的重组蛋白的产生体积进行比较。受削弱的分离的细胞中重组蛋白的产生体积增加至少约30％表示，基因、基因的表达产物在受到削弱时会导致重组蛋白的产量增加。

附图说明

本技术的前述以及其他特征和方面可以通过以下对实施例的描述而得到更好的理解并且如附图所示。并入本文中并形成本说明书的一部分的附图被另外用于说明本技术的原理。附图中的组件未必按比例绘制。

图1显示了根据本文所述的实施例的用于筛选目的基因的实验设计的流程图。

图2显示了表达三种不同的模型蛋白的expi293f细胞的流式细胞术分析。

图3a显示了expi293f细胞的流式细胞术分析，该图展示了不同水平的蛋白表达。

图3b显示了sds-page凝胶，该图展示了expi293f细胞中不同水平的cripto-fc蛋白产量。

图4显示了根据本文的实施例的在初步筛选中整个24孔的筛选数据。

图5显示了饼状图，该图展示了对表达plap和gfra2的细胞系上的criptofc细胞系有活性的初步命中的确认筛选的结果。

图6显示了使用如本文所述的重组蛋白表达测定法用各种化合物处理时的细胞活力。

图7显示了使用如本文所述的重组蛋白测定法用各种化合物处理细胞时的酶活性。

图8显示了在plap细胞测定法中产生的蛋白的体积。

图9a和图9b显示了在表达cripto-fc的hek293细胞中对ulk1基因进行基因编辑实验的结果。

图10a显示了在expi293-cripto-fc细胞中ulk1基因的sirna下调的结果。

图10b显示了用sirna实现的mrna敲低的程度。

图11显示了expi293f细胞的流式细胞术分析，该图展示了在ulk1活性的遗传削弱后不同水平的蛋白表达。

图12a-12c显示了用ulk1抑制剂处理后细胞培养参数对cho细胞系的影响。

图12d-12e显示了在用ulk1抑制剂处理后通过蛋白a分析测得的cho细胞系中ab001的体积生产率和比生产率。

具体实施方式

应该理解，本文示出和描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何方式在其他方面限制本申请的范围。

本文提及的公开的专利、专利申请、网站、公司名称和科学文献据此通过援引以其全文并入，达到如同每者都被具体地和单独地指出通过援引并入的相同程度。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体传授内容之间的任何冲突都应以有利于后者的方式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中具体传授的该单词或短语的定义之间的任何冲突都应以有利于后者的方式来解决。

如本说明书中所用，除非本内容另外明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”具体地还涵盖它们所提及的术语的复数形式。本文所用的术语“约”意指大约、在......的附近、粗略地或左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所示的数值的上限和下限来修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于修饰在所述值之上和之下具有20％变化的数值。

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属领域的技术人员通常所理解的含义。本文参考了本领域的技术人员已知的各种方法和材料。

本文所述的方法、过程、细胞和组合物基于以下令人惊讶的发现：即其中ulk1基因的表达产物的作用受到削弱的细胞(包括真核细胞，例如哺乳动物细胞)能够以大大提高的收率表达目的重组蛋白产物。

分离的细胞

在实施例中，本文提供了其中ulk1基因的表达产物的作用已受到削弱的分离的细胞。

人ulk1基因的mrna核苷酸序列在下面以seqidno：1提供。

人ulk1蛋白的氨基酸序列在下面以seqidno：2提供。

sp|o75385|ulk1_人丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶ulk1os＝智人gn＝ulk1pe＝1sv＝2

除了靶向ulk1基因的削弱之外，本文所述的方法还可以用于靶向和削弱参与重组蛋白产生的各种基因的表达产物。如本文所述，期望靶向基因以允许最大程度地实现蛋白回收、分离和最终使用以及组合物配制，这些基因的削弱(或其表达产物的削弱)不仅提供增加的蛋白表达，而且还不会对细胞存活造成负面影响。

如本文所述，在确立可被靶向以增加细胞中的蛋白产量的基因时，期望靶向在细胞的非折叠蛋白反应(upr)期间触发的过程，但该过程对通过分泌机制的输出具有有限的作用，同时保持应激反应。应激期间细胞的upr会使内质网(er)扩大几倍，从而暂时增加er的容量。er的扩大被自噬作用抵消，这种自噬作用以受控的方式降解细胞器，以便维持细胞稳态。

ulk1基因编码丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶ulk1。它参与细胞响应于饥饿的自噬作用。ulk1蛋白在磷脂酰肌醇3激酶pik3c3的上游起作用，以调节自噬泡(autophagophore)(自噬体的前体)的形成。它是自噬作用中的反馈调控回路的一部分，经由与rptor的相互作用，同时充当哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mtorc1)的下游效应子和负调节因子。还确定它与分选离开内质网(er)的囊泡有关，并与确定囊泡目的地是高尔基体还是降解性溶酶体有关。

如本文所述，基于这些活性，确定了削弱ulk1基因的表达产物的作用将增加细胞的重组蛋白产量，这最可能是通过抑制upr期间的er降解以及通过防止分泌性囊泡漏入降解途径来实现的。但是，削弱ulk1基因的表达产物的作用不会在很大程度上对细胞生长产生负面影响。

如本文所用，“ulk1基因”是指任何这样的内源性基因：该基因编码与seqidno：2所示的氨基酸序列、或由seqidno：1的核酸编码的蛋白共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的蛋白。由这样的基因编码的蛋白优选地具有与具有如seqidno：2所示的氨基酸序列的蛋白、或由seqidno：2的核酸编码的蛋白相同的功能。可以如本文所述修饰所述基因，以削弱由未修饰的细胞表达的表达产物的功能。术语“ulk1基因”涵盖ulk的编码区和非编码区，以及基因的一个或多个启动子区和5′-非翻译区。

如本文所用，术语“ulk1蛋白”或“ulk1基因的表达产物”和类似表述涵盖ulk1的同源物和直系同源物，并且特别地涵盖与seqidno：2所示的氨基酸序列、或由seqidno：1编码的蛋白共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的任何蛋白。此类ulk1蛋白合适地具有与具有如seqidno：2所示的氨基酸序列的蛋白、或由seqidno：1的核酸编码的蛋白相同的功能。可以在蛋白的整个长度上计算同源性，相应地计算同一性。

如本文所用，“蛋白的产量”或“蛋白产量”或“重组蛋白的产量”是指细胞或细胞系的体积产量或体积生产率，通常以mg蛋白/ml细胞培养物(mg/ml)来度量。

如本文所述，ulk1基因的表达产物的作用可以因多种机制或作用而受到削弱，从而通过缺失或敲除ulk1基因、或通过向ulk1基因中引入突变来降低、减少或消除内源性基因ukl1的功能性表达。另外，可以通过消除或削弱ulk1基因的表达产物的作用、或以其他方式抵消ulk1基因的表达产物的活性来削弱表达产物。

如本文所述，ulk1基因的表达产物的作用，从而ulk1蛋白的作用，可以例如在基因水平或蛋白水平上受到削弱。例如，可以通过改变ulk1蛋白的结构/序列、转录和/或翻译来削弱ulk1的作用。

例如，由于减少或消除了细胞中ulk1基因的功能性表达，因此可以削弱细胞中ulk1基因的表达产物的作用。改变ulk1基因的表达(例如，通过基因沉默或通过使所述基因缺失)是提供能够以高收率表达目的重组产物的细胞的示例性方法。当减少或消除细胞中ulk1基因的表达水平，从而相应改变的细胞产生的功能性ulk1蛋白较少或不产生功能性ulk1蛋白时，目的重组产物(蛋白)的表达收率增加。功能性ulk1表达与重组蛋白表达收率之间的这种相关性是一个出乎意料的发现。

降低、减少或消除(无功能性表达)ulk1基因的功能性表达可以例如通过降低ulk1基因的表达水平或通过破坏ulk1的表达产物的功能或通过此类方法的组合来实现。

在一个示例性实施例中，可以改变细胞，使得通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因编辑、基因沉默或任何前述方法的组合来降低、减少或消除ulk1基因的功能性表达。也就是说，突变或基因编辑减少了ulk1基因和/或ulk1基因产物(蛋白)的表达、降低了其表达或消除了(敲除了)其表达。

根据一个实施例，可以通过基因敲除来减少或消除细胞中ulk1基因的功能性表达。基因敲除是一种遗传技术，通过该技术破坏基因的功能而使基因失效。例如，可以将核酸插入编码序列，从而削弱基因功能。此外，可以使整个ulk1基因或其一部分缺失，从而相应改变的细胞不表达或减少表达功能性蛋白。另外的实施例可以将一个或多个敲除突变引入编码序列中，从而得到非功能性或低功能性表达产物，可以引入一个或多个移码突变，从而产生非功能性或低功能性蛋白。替代性地或另外地，可以将一个或多个终止密码子引入编码序列中，从而获得截短的非功能性或低功能性蛋白。因此，根据一个实施例，ulk基因包含提供非功能性或低功能性表达产物的一个或多个突变。其他选择包括但不限于启动子、5′-和/或3′非翻译区(utr)、或ulk基因的其他调控元件中的一个或多个突变。根据一个实施例，ulk1基因的启动子功能例如通过引入启动子缺失或通过在启动子与转录起点之间引入构建体而受到破坏。实现基因敲除以抑制或消除靶基因表达的方法是技术人员熟知的并且如本文所述。在另外的实施例中，可以通过靶向对ulk1基因的表达进行调控所涉及到的调控元件(例如，转录因子、启动子、增强子、utr或其他调控元件)来降低、减少或消除ulk1基因的功能性表达，或可以例如通过敲除、缺失、下调或使调控元件失活或降低该调控元件的活性的任何其他改变来靶向其他调控元件，从而防止或降低ulk1基因的功能性表达并由此削弱该基因的内源性表达产物的作用。

在实施例中，ukl1基因中的突变可通过使ukl1基因产物的活性位点或atp结合袋突变来影响表达产物的功能或激活，从而削弱ulk1基因的功能或作用。其他突变可以在例如以下列出的那些位点修饰蛋白的氨基酸序列：

表1：ulk1基因产物削弱的潜在位置

本领域的普通技术人员可以确定基因序列中削弱这些氨基酸位置的潜在核酸突变。

在另外的实施例中，显性负突变(也称为反效突变(antimorphicmutation))可用于削弱ulk-1基因。显性负突变产生改变的基因产物，该产物对野生型等位基因起拮抗作用。这些突变通常产生分子功能改变(通常是无活性的)，并以显性或半显性表型为特征。

在一个示例性实施例中，通过基因工程在功能上敲除ulk1基因。实例包括但不限于基因组编辑，例如使用工程核酸酶的基因组编辑(geen)。这是其中使用人工工程化核酸酶或“分子剪刀”来插入dna、替换dna或从基因组中移除dna的一类基因工程。核酸酶在基因组中的所需位置产生特定的双链断裂(dsb)，并利用细胞的内源性机制通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)的自然过程来修复诱导的断裂。示例性工程化核酸酶包括锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、crispr-cas9和工程化大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。

用于crispr-cas9基因编辑的示例性靶序列包括：

针对人ulk1的ulk1grnac8accgcggcggcacagagaccg(外显子1中的281-299)(seqidno：3)

针对人ulk1的ulk1grnad8accgccacggcgccttcgcgg(外显子1中的336-353)(seqidno：4)

在实施例中，存在于细胞基因组中的ulk1基因的一个或多个拷贝被改变，例如敲除或缺失，以减少或消除并因此削弱ulk1基因的表达产物在细胞中的作用。因此，根据一个实施例，在细胞的基因组中使ulk1基因的至少一个拷贝缺失或功能失活。例如，可以将一个或多个突变插入ulk1基因的一个或多个拷贝中(如果存在多于一个拷贝)，以提供非功能性或低功能性表达产物，或者完全消除或减少表达，并因此削弱ulk1在细胞中的作用。根据一个实施例，在存在多于一个拷贝的情况下，ulk1基因的所有拷贝在细胞中均被合适地改变。

在示例性实施例中，突变或基因编辑消除了或削弱了ulk1基因的表达产物的一个或多个催化残基。“催化残基”是指蛋白结构的一个或多个位点，在这种一个或多个位点中与蛋白的反应或结合发生或被催化。通过突变或编辑这些催化残基中的一个或多个，可以在细胞中产生的ulk1基因产物将无法正常发挥功能，从而导致ulk1蛋白的功能降低、减弱或完全消除。

在另外的实施例中，突变或基因编辑可以削弱经翻译后修饰的ulk1基因的表达产物的一个或多个残基。也就是说，ulk1蛋白的一个或多个残基可以被突变或被编辑，从而产生功能降低、减弱或完全消除的受削弱的ulk1蛋白产物。

如本文所用的术语“分离的细胞”是指在活生物体(例如，植物、昆虫或动物)体外的细胞。可以在本文所述的方法中制备和利用的示例性细胞包括原核细胞和真核细胞。如本文所述，细胞可以作为细胞培养物、细胞系、细胞克隆等提供。示例性原核细胞包括例如大肠杆菌(e.coli)、棒状杆菌属(corynebacterium)和荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)的细菌。真核细胞包括酵母，例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)；昆虫细胞，包括来源于草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)的细胞系，等等。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞、人类细胞和猴细胞。合适的真核细胞是啮齿动物细胞，例如来源于仓鼠或小鼠的细胞。它们可以是中国仓鼠细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、bhk细胞、nso细胞、c127细胞、小鼠3t3成纤维细胞和sp2/0细胞。cho细胞的实例是cho-k1、cho-s、cho-k1sv、cho-ssf3、cho-dg44、cho-duxb1。其他真核细胞系包括人胚肾(hek)细胞、小鼠骨髓瘤淋巴母细胞样细胞、人类胚胎视网膜细胞和人类羊水细胞等。

为了提供具有均匀并因此具有可预测的特征的生产细胞系，需要改变细胞(例如，真核细胞)的基因组以实现削弱。然后可以用表达载体或其他包含编码目的蛋白产物的多核苷酸的载剂来转染相应改变的细胞。例如，减少或消除ulk1基因在cho细胞中的表达提供了能够以显著提高的收率产生重组蛋白产物的cho细胞。在另外的实施例中，可以采用来源于人类细胞的真核细胞，例如hek293细胞、mcf-7细胞、perc6细胞、cap细胞、造血细胞和hela细胞。另一替代方案是猴细胞，包括cos细胞、cos-1、cos-7细胞和vero细胞。

如本文所述，与内源性表达ulk1的对应的未修饰的细胞相比，对细胞进行修饰以削弱ulk1基因的表达产物在细胞中的作用。通过减少或消除ulk1基因的功能性表达或通过削弱ulk1基因产物的活性或作用来实现削弱。

根据一个实施例，ulk1基因的缺失可以经由染色体断裂来进行。染色体断裂可以例如通过用促进染色体断裂的毒剂(例如mtx、阿非迪霉素或潮霉素)处理细胞来诱导。诱导染色体断裂的其他选择包括但不限于辐射、照射、诱变剂、致癌物和博来霉素。在转染(例如，电穿孔)期间，也可能自发发生染色体断裂。诱导染色体断裂后，可以通过分析细胞的dna来鉴定具有所需断裂点(该断裂点导致ulk1基因缺失)的细胞。

ulk1基因的功能性表达可能受到各种活动的影响，例如，改变ulk1基因的启动子和/或增强子从而产生较少的转录物或不产生转录物，或基因沉默技术例如转录或转录后基因沉默。根据一个实施例，分离的细胞可以在ulk1基因的启动子区域中包含一个或多个突变。例如，可以改变启动子区域以提供低功能性或非功能性启动子，该启动子也可以被完全消除。替代性地或另外地，有可能添加编码多肽的多核苷酸序列，该多核苷酸序列在ulk1基因的启动子与起始密码子之间包含终止密码子，该终止密码子停止ulk1多肽的产生。

功能性基因表达的减少可以达到使达降低、减少甚至消除的水平。转录后基因沉默可通过反义分子或介导rna干扰的分子来实现。如本文所述，转录后基因沉默可利用sirna干扰、微rna干扰、反义rna干扰或小分子干扰。

例如，可以将反义多核苷酸设计成与ulk1基因的转录的rna特异性结合，从而形成rna-dna或rna-rna杂合体，同时阻止逆转录或信使rna翻译。已经开发了许多形式的反义，它们可以被大致分为酶依赖性反义或空间位阻(stericblocking)反义。酶依赖性反义包括依赖于rna酶h活性来降解靶mrna的形式，这些形式包括单链dna、rna和硫代磷酸反义。反义多核苷酸典型地通过从反义构建体表达而在细胞内产生，这些反义构建体包含作为转录链的反义链。反式切割催化rna(核酶)是具有核糖核酸内切酶活性的rna分子。核酶可以针对特定的靶标而专门设计，并且可以被工程化为在细胞rna的背景中以位点特异性方式切割任何rna种类。切割事件使mrna不稳定并阻止蛋白表达。可以改变细胞的基因组，使得永久性地表达相应的反义分子。

可用于在转录后水平上降低ulk1基因的功能性表达的另外的实施例基于rna干扰(rnai)，从而引起细胞中重组蛋白的产量增加。通过rnai来沉默基因的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于短干扰核酸(sina)、短干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、短发夹rna(shrna)及其在细胞中加工成实际的rnai诱导化合物的前体。

例如，可将sirna用于沉默ulk1基因。sirna可以作为在每条链上具有3’突出端的双链分子提供。也可以使用钝端分子。sirna可以包含脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸，并且还可以包含经修饰的核苷酸。sirna化合物的几个实施例和变型是本领域已知的，并且可用于减少ulk1基因的表达。可以通过使用适当的计算方法，应用某些设计算法来鉴定在rna水平上靶向靶ulk1基因的区域的示例性sirna。

示例性sirna化合物包括以下列出的那些：

表2-示例性sirna化合物

为了获得针对靶转录物的sirna，可以将双链分子直接转染到细胞中。替代性地，sirna可以由dicer的加工而产生，dicer是将长dsrna或小发夹rna(shrna)转化为sirna的酶。这些前体或最终sirna分子可以外源(人工)产生，然后可以通过各种转染方法引入细胞中。根据另一个实施例，可以通过转染到细胞中的载体来表达rnai诱导的化合物。对于sirna，这可以通过在两条链之间引入环来完成，从而产生单个转录物，然后将该转录物加工成细胞中的功能性sirna。此类转录盒典型地使用rna聚合酶3启动子(例如u6或h1)，该启动子通常指导小核rna(shrna)的转录。然后，通过dicer对来自载体的所得shrna转录物进行加工，从而产生合适地具有特征性3′突出端的双链sirna分子。根据一个实施例，这种提供载体的shrna被稳定整合到细胞的基因组中。然后可以用包含编码目的产物的多核苷酸的表达载体转染包含相应的提供shrna的载体的细胞。替代性地，可以使用共转染策略，其中将生成shrna的载体与包含编码目的产物的多核苷酸的表达载体一起共转染。

转录基因沉默可以包括表观遗传修饰。根据一个实施例，通过表观遗传沉默(包括dna甲基化)来降低ulk1基因的表达。另外，可以改变ulk1基因的序列以缩短mrna的半衰期。这也在相应改变的细胞中实现了ulk1蛋白的作用的降低。

根据一个实施例，改变细胞(例如，真核细胞)的基因组以通过突变体ulk1的异源性表达来削弱ulk1的作用，该突变体ulk1与内源性表达的ulk1蛋白相比是非功能性或低功能性的。在该实施例中，分离的细胞除了包含编码目的多肽的异源性多核苷酸外，还包含编码突变体ulk1的另外的异源性多核苷酸。通过过表达ulk1的相应非功能性或低功能性突变体形式，可以产生显性负表型。削弱并因此降低ulk1在细胞中的作用的另一种选择是蛋白例如抗体的异源性表达，该表达中和ulk1并因此削弱ulk1在细胞中的作用。根据一个实施例，通过减少或消除与ulk1功能性相互作用的分子的功能性表达来削弱ulk1在细胞中的作用。

在另外的实施例中，将低分子量化合物(即小分子)用于通过特异性抑制转录因子与启动子中的调控区的结合、或通过抑制靶基因转录所需的转录激活因子、或通过直接抑制ulk1基因的表达产物的作用来抑制ulk1基因的表达。相应的抑制性化合物包括但不限于化学化合物，例如特别是小分子、蛋白和肽。另一种可能性是使用例如刺激蛋白产物降解(例如通过刺激蛋白的泛素化)的低分子量化合物之类的化合物。

小分子还可用于例如通过蛋白破坏或限制活性来削弱翻译的蛋白。在实施例中，小分子可以通过介导蛋白的降解而起作用，例如使用蛋白水解靶向嵌合体(protac)技术。胞内抗体分子(即，细胞内的抗体)也可用于结合所表达的蛋白并使它们失去功能或者指导所表达的蛋白的破坏。示例性小分子在本文和实例中进行了描述，并且包括例如ulk1抑制剂mrt68921(ulk1的ic50约为2.9nm)的化合物：

在示例性实施例中，ulk1基因的表达减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少250倍、至少500倍、至少750倍、至少1000倍、至少1250倍、至少1500倍、至少1750倍或至少2000倍等。ulk1基因表达的减少量可以通过例如使用实时rt-pcr或其他灵敏的rna检测方法来测定。可以与未修饰的参考细胞相比来测量这种减少，在未修饰的参考细胞中，ulk1基因的表达不减少。

在另外的实施例中，可以相对于细胞中的另一个天然基因来测量ulk1基因的表达，以确定减少的量。例如，ulk1基因的表达与相同细胞中18s核糖体rna的表达(设为100％)相比可以为0.05％或更少、0.0475％或更少、0.045％或更少、0.0425％或更少、0.04％或更少、0.0375％或更少、0.035％或更少、0.0325％或更少、0.03％或更少、0.0275％或更少、0.025％或更少、0.0225％或更少、0.02％或更少、0.0175％或更少、0.015％或更少。根据一个实施例，ulk1基因的表达与相同细胞中18srna的表达(设为100％)相比可以甚至更少，例如0.001％或更少、0.0001％或更少或者甚至0.00001％或更少。

使ulk1基因的功能性表达被合适地削弱，即减少、降低或消除，以使得如果用编码目的产物的表达载体转染经修饰的细胞，则与其中ulk1基因的功能性表达未削弱(即不降低、不减少或不消除)的相应细胞相比，将引起目的重组蛋白产物的表达和产量增加。根据一个实施例，相对于其中ulk1基因的功能性表达不降低、不减少或不消除的相应细胞中的表达，目的重组蛋白产物的表达增加至少约20％，更合适地至少约30％。

合适地，使用本领域已知的方法来测量重组蛋白的表达(以所产生的蛋白的体积(例如，ml)为单位)，因此产量的增加是指所产生的蛋白的体积的增加。根据另外的实施例，相对于其中ulk1基因的功能性表达不降低、不减少或不消除的相应细胞中的表达，目的重组蛋白产物的表达增加至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约100％，或增加约30％至约700％、约40％至约600％、约50％至约500％、或约100％至约500％。

本文所用的“异源性多核苷酸”或“异源性核酸”和类似表述是指已经例如通过使用重组技术(例如转染)来引入真核细胞中的多核苷酸序列。根据上下文，“多核苷酸”尤其是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接到另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，并且是指dna以及rna。术语“多核苷酸”不包括任何大小限制。

在某些实施例中，细胞不包含从所述细胞表达或分泌的编码目的产物的异源性多核苷酸、编码选择性标记的异源性多核苷酸和/或编码报告多肽的异源性多核苷酸。相应的“空”细胞可用作用于重组产生技术的克隆细胞系。然后可以例如使用适当的表达载体，用编码目的蛋白产物的异源性多核苷酸转染相应的细胞。因此，根据应该重组产生的期望的目的产物，可以用不同的表达载体来转染这样的“空”细胞：在这些细胞中ulk1基因的表达产物的作用受到削弱，并且这些细胞尚未表达并且尚未分泌重组产物。因此，这样的细胞系可以用于不同的项目，即，用于产生不同的目的产物，特别是目的分泌多肽。转染可以是瞬时的或稳定的。

如本文所述，在合适的实施例中，细胞(例如，真核细胞)包含编码目的产物的异源性多核苷酸。目的产物合适地是将由细胞大量表达的重组产物。合适地，目的产物是多肽。此外，细胞可以另外包含编码选择性标记的异源性多核苷酸和/或编码报告基因的异源性多核苷酸。这简化了对成功转染并因此表达目的产物的宿主细胞的选择。此外，细胞可包含编码不同的选择性标记和/或报告多肽的若干多核苷酸。根据一个实施例，编码目的产物的异源性多核苷酸被稳定整合到细胞的基因组中。

表达载体可用于将异源性多核苷酸引入细胞中。多核苷酸可以包含在表达盒中。编码目的产物的一种或多种多核苷酸和编码选择性标记或报告多肽的一种或多种多核苷酸可以位于相同或不同的表达载体上。可以通过将包含编码目的产物的多核苷酸的合适表达载体转染到宿主细胞中来实现向细胞中的引入。表达载体合适地整合到宿主细胞的基因组中(稳定转染)。如果未将异源性核酸插入基因组中，则当细胞进行有丝分裂时，异源性核酸可能在以后的阶段丢失(瞬时转染)。稳定转染适于产生高表达性细胞克隆，以产生目的产物，例如工业规模的目的多肽。用于将异源性核酸例如表达载体引入宿主细胞的示例性方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂质转染、基因枪及聚合物介导的基因转移等。重组介导的方法可用于将异源性多核苷酸转移到宿主细胞基因组中。

用于实现目的重组产物表达的表达载体通常包含通常作为表达盒的元件的适于驱动转录的转录控制元件，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。如果所需产物是多肽，则在载体中包含合适的翻译控制元件，例如产生适于募集核糖体的5＇帽结构的5′非翻译区和终止翻译过程的终止密码子。

在实施例中，在表达盒中合适地包含编码目的产物的一种或多种多核苷酸和编码一种或多种选择性标记和/或一种或多种报告多肽的多核苷酸。例如，所述一种或多种多核苷酸中的每种都可以包含在单独的表达盒中。在一个表达盒中包含至少两种相应的多核苷酸也在本发明的范围内。根据一个实施例，至少一个内部核糖体进入位点(ires)元件在功能上位于从相同表达盒表达的多核苷酸之间。因此，确保了单独的翻译产物从所述转录物获得。相应的基于ires的表达技术以及其他双顺反子和多顺反子系统在本领域中是熟知的。

在实施例中，表达载体可包含作为表达盒的元件的至少一个启动子和/或启动子/增强子元件。启动子可分为两类，一类是以组成型方式发挥功能的，另一类是通过诱导或抑制来调节的。两类都是适用的。在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒立即早期启动子、sv40和劳斯肉瘤病毒启动子以及鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子ef1α。根据一个实施例，启动子和/或增强子获自cmv和/或sv40。转录启动子可以选自sv40启动子、cmv启动子、ef1α启动子、rsv启动子、broad3启动子、鼠科动物rose26启动子、pcefl启动子和β-肌动蛋白启动子。

目的表达产物可以是能够由编码目的产物的多核苷酸所编码的遗传信息的转录、翻译或任何其他表达事件产生的任何生物产物。目的产物可以选自多肽和核酸(特别是rna)。该产物可以是药学或治疗活性化合物，或用于多种测定等的研究工具。合适地，目的产物是多肽，特别是重组多肽，即在宿主细胞中大量产生的多肽。任何目的多肽都可以用本文所述的方法表达。术语“多肽”是指包含通过一个或多个肽键连接在一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白(例如具有多于50个氨基酸)和肽(例如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性、功能或大小的蛋白和/或肽，并且包括分泌蛋白、膜锚定蛋白或细胞内蛋白。

示例性多肽和重组多肽包括酶(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体、转运蛋白、杀菌和/或内毒素结合蛋白、结构多肽、膜结合多肽、糖蛋白、球状蛋白、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、血液因子、疫苗等。多肽可以是肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白(包括抗体或其功能性抗体片段或变体以及fc融合蛋白)。如本文所述表达的目的多肽还可以是多肽的亚基或结构域，例如抗体的重链或轻链、或其功能片段或衍生物。

术语“目的产物”、“目的多肽”、“蛋白产物”、“多肽产物”、“重组蛋白”、“目的蛋白”和“重组多肽”可以互换使用，并且根据上下文可以指这种单独的亚基或结构域，或由相应亚基或结构域组成的最终蛋白。在实施例中，目的多肽是免疫球蛋白分子，合适地是抗体，或其亚基或结构域，例如抗体的重链或轻链。如本文所用，术语“抗体”是指包含通过二硫键连接的至少两条重链和两条轻链的蛋白。术语“抗体”包括天然存在的抗体以及所有重组形式的抗体，例如人源化抗体、完全人抗体和嵌合抗体。每条重链通常由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。每条轻链通常由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。然而，术语“抗体”还包括其他类型的抗体，例如单结构域抗体、重链抗体(即，仅由一条或多条，尤其是两条重链组成的抗体)和纳米抗体(即，仅由单个单体可变结构域组成的抗体)。如上文所讨论，编码目的多肽的多核苷酸还可以编码抗体的一个或多个亚基或结构域(例如，重链或轻链或者其功能片段或衍生物)作为目的多肽。这种亚基或结构域可以从相同的或不同的表达盒表达。抗体的“功能片段或衍生物”特别是指衍生自抗体并且能够结合与抗体相同的抗原(特别是相同的表位)的多肽。抗体的片段或衍生物的实例包括：(i)fab片段，即由重链和轻链各自的可变区和第一恒定结构域组成的单价片段；(ii)f(ab)2片段，即包含两个fab片段的二价片段，这两个fab片段在铰链区通过二硫桥连接；(iii)由重链的可变区和第一恒定结构域ch1组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂的重链和轻链可变区组成的fv片段；(v)scfv片段，即由单条多肽链组成的fv片段；(vi)由两个共价连接在一起的fv片段组成的(fv)2片段；(vii)重链可变结构域；以及(viii)由共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成的多体，这种共价连接方式使得重链可变区和轻链可变区的缔合只能在分子间发生，而不能在分子内发生。

如本文所述，在实施例中，细胞除了包含编码目的产物的异源性多核苷酸以外，还包含至少一种编码选择性标记的异源性多核苷酸和/或编码报告多肽的异源性多核苷酸。“选择性标记”允许在适当的选择性培养条件下选择表达所述选择性标记的宿主细胞。由此，可以在适当的选择条件下选择被表达载体成功转染的宿主细胞。典型地，选择性标记基因将赋予对选择剂如药物、抗生素或其他毒性剂的抗性，或者补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。它可以是正向选择性标记或负向选择性标记。在实施例中，选择性标记使宿主细胞能够在对于缺乏该选择性标记的宿主细胞的存活和/或增殖必需的化合物不存在或减少的情况下存活和增殖。通过在包含的必需化合物的浓度不足以使宿主细胞存活和/或增殖或者包含的所述必需化合物的量减少的培养基中培养宿主细胞，只有表达选择性标记的宿主细胞才能存活和/或增殖。

根据一个实施例，选择性标记是编码这样的蛋白的抗药性标记：该蛋白赋予针对涉及该药物的选择条件的抗性。已经描述了多种选择性标记基因(参见例如wo92/08796、wo94/28143、wo2004/081167、wo2009/080759、wo2010/097240)。例如，可以使用赋予针对一种或多种抗生素剂的抗性的至少一个选择性标记。根据一个实施例，选择性标记可以是可扩增的选择性标记。可扩增的选择性标记允许选择含有载体的宿主细胞，并且可以促进所述载体在宿主细胞中的基因扩增。真核细胞(例如哺乳动物细胞)常用的选择性标记基因包括针对氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、潮霉素磷酸转移酶(hyg)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，以及编码针对新霉素(g418)、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、哇巴因、杀稻瘟素、组氨醇d、博来霉素、腐草霉素和霉酚酸的抗性的基因。

可以采用“报告多肽”，该报告多肽允许根据报告特征(例如荧光)来鉴定表达报告多肽的细胞。报告基因通常不向宿主细胞提供存活优点。然而，报告多肽的表达可用于区分表达报告多肽的细胞与不表达报告多肽的细胞。因此，报告基因能够选择成功转染的宿主细胞。合适的报告多肽包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、青色荧光蛋白(cfp)和荧光素酶。正如所述，包含编码目的产物的多核苷酸的表达载体还可以包含多于一种选择性标记和/或报告基因。此外，编码一个或多个选择性标记的一种或多种多核苷酸和/或编码一种或多种报告多肽的一种或多种多核苷酸也可以提供在一种或多种不同的表达载体上，这些表达载体与包含编码目的产物的多核苷酸的表达载体一起共转染。这种共转染策略同样可以实现选择，如本领域所熟知。

细胞中包含的表达载体或至少两种表达载体的组合可另外包含其他载体元件。例如，可以利用至少一种另外的编码其他目的产物的多核苷酸。由宿主细胞产生并合适地分泌的最终多肽也可以是由几个单独的亚基或结构域组成的蛋白。相应蛋白的实例是免疫球蛋白分子，特别是包含重链和轻链的抗体。有若干选择来产生由不同的单独亚基或结构域组成的相应蛋白，并且适当的载体设计是本领域已知的。根据一个实施例，所述蛋白的两个或更多个亚基或结构域从一个表达盒表达。在该实施例中，从包含蛋白的各个亚基或结构域的编码区的相应表达盒获得一个长转录物。根据一个实施例，至少一个ires元件(内部核糖体进入位点)在功能上位于各个亚基或结构域的编码区之间，并且每个编码区之前都有分泌前导序列。因此，确保了从所述转录物获得单独的翻译产物，并且确保了可以正确组装和分泌最终蛋白。

在一些实施例中，例如抗体的表达，期望表达来自不同表达盒的各个亚基或结构域。根据一个实施例，用于表达目的产物的表达盒是单顺反子表达盒。表达载体或表达载体的组合中包含的表达盒可以是单顺反子的。根据一个实施例，被设计用于表达目的产物的每个表达盒包含编码作为目的多肽来表达的蛋白的一个亚基或结构域的多核苷酸。就抗体而言，一个表达盒可以编码抗体的轻链，另一个表达盒可以编码抗体的重链。从各个表达盒表达各个亚基或结构域之后，最终蛋白(例如抗体)从所述亚基或结构域组装，并由宿主细胞分泌。该实施例特别适合于表达免疫球蛋白分子，例如抗体。在这种情况下，编码目的产物的第一异源性多核苷酸编码例如免疫球蛋白分子的重链或轻链，并且编码目的产物的第二异源性多核苷酸编码免疫球蛋白分子的另一条链。

产生细胞和细胞系的方法

在另外的实施例中，本文提供了产生用于重组蛋白产生的分离的细胞的方法。本文所述的方法合适地用于产生可以维持和传代的细胞系，从而允许进行多个实验或蛋白产生程序。

在实施例中，本文所述的方法包括削弱ulk1基因的表达产物在分离的细胞中的作用，并在允许分离的细胞扩增的条件下培养分离的细胞。

本文描述了用于削弱ulk1基因(ulk蛋白)的表达产物的作用的方法，并且这些方法包括削弱ulk1基因以及所表达的ulk1蛋白的操作。

在一个示例性实施例中，方法包括减少或消除ulk1基因的功能性表达，从而削弱ulk1基因的表达产物在细胞中的作用。本文描述了合适的方式。根据一个实施例，可以改变细胞(例如，真核细胞)的基因组以减少或消除ulk1基因的功能性表达。例如，可以将基因敲除引入ulk1基因中。根据一个实施例，这种基因敲除被引入ulk1基因的所有拷贝中。根据另一个实施例，使ulk1基因缺失。可以使基因组中ulk1基因的所有拷贝都缺失。根据一个实施例，该方法包括使染色体的一部分缺失，其中缺失的部分包含ulk1基因。缺失的部分可以对应于端粒区。可以例如通过使用诱导染色体断裂的试剂来诱导这种缺失。这里，可以用这种试剂反复处理细胞，以便获得减少或消除了ulk1基因的功能性表达的细胞，因为所述基因的所有拷贝均由于诱导的染色体断裂而缺失。

本文描述了示例性细胞，包括真核细胞和合适的哺乳动物细胞，在这些细胞中可以进行ulk1基因的削弱。在合适的实施例中，所制备的细胞是哺乳动物细胞，例如人胚肾(hek)细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

培养分离的细胞的方法和可以扩增细胞的条件是特定细胞系所独有的，并且是本领域已知的。这样的培养方法披露于例如sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，纽约冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress，newyork)(1989)中。培养方法包括使用各种培养基和步骤，这些培养基和步骤允许扩增细胞系以产生稳定的细胞，这些稳定的细胞可以储存和传代，从而可以继续使用。可以使用本文所述的各种方法来选择适当削弱ulk1基因的细胞，这些方法包括筛选细胞群的遗传组成。

如本文所用，当提及细胞系或细胞培养物时，“稳定的”或“稳定性”是指在至少6-14周的细胞生长时间段内，体积生产率(即，蛋白体积产量(mg/ml))的降低通常小于30％。这种稳定性是本文所述的方法的出乎意料的发现：即使细胞系中的ulk1基因或基因表达受到削弱，仍允许细胞系可重复地用于增加蛋白的产量。在示例性实施例中，本文所述的细胞系表现出一定的稳定性，使得在约8-12周，合适地8-10周的时间段内，体积生产率降低小于25％、小于20％、小于10％或小于5％。

细胞可以在适当的培养基中培养。适当的或有效的培养基是指其中细胞能够生长和/或表达目的异源性多肽/蛋白的任何培养基。这种培养基典型地是包含碳、氮和磷酸盐源的水性培养基，但也可以包含适当的盐、矿物、金属和其他营养物。微生物和其他细胞可以在常规生物反应器中并通过任何方法培养，该方法包括分批、补料分批、细胞再循环和连续发酵。将培养基的ph调节至适于特定生物的生长和蛋白产生的ph。可以对生长室进行通气，以便提供生长所需的氧气并避免二氧化碳的过度积累。用于各种宿主细胞的培养基和条件是本领域已知的。

本文描述了用于突变或编辑细胞中的ulk1基因的各种方法，这些方法包括基因编辑、突变或敲除ulk1基因、以及ulk1基因的转录后基因干扰。

如本文所述，与其中ulk1基因的表达产物的作用未受到削弱的细胞相比，ulk1基因的表达产物的作用的削弱会导致重组蛋白产量的增加。相对于其中ulk1基因/蛋白产物未受到削弱的细胞，这种产量增加合适地大约为约至少约30％，更合适地约50％至约500％。

示例性重组蛋白(包括分泌蛋白、膜锚定蛋白和细胞内蛋白)可以由本文所述的细胞产生。

产生目的产物的方法

在进一步的实施例中，本文提供了产生目的产物，合适地重组蛋白的方法。这样的方法包括将编码重组蛋白的重组基因引入分离的细胞中。合适地，已经如本文所述修饰了细胞，从而削弱了ulk1基因的表达产物的作用。在允许重组蛋白表达的条件下培养分离的细胞。然后从细胞中分离重组蛋白。

本文提供的细胞(包括真核细胞)适合作为用于以重组方式产生目的产物例如目的多肽或蛋白的生产宿主细胞。本文详细描述了其中ulk1基因的表达产物在细胞中的作用被削弱(包括通过减少或消除ulk1基因的功能性表达)的细胞的合适实例，以及目的产物(重组蛋白)的实例。如本文所述，与其中ulk1基因或ulk1基因的表达产物未受削弱的细胞相比，目的产物(合适地重组蛋白)在受到削弱细胞中以更大的量产生。如本文所述，在实施例中，与不包含受到削弱的ulk1基因或ulk1基因表达产物的细胞相比，重组蛋白的产量增加至少30％，例如约50％至约500％。

如本文所述，真核细胞合适地为脊椎动物细胞，更合适地为哺乳动物细胞。根据一个实施例，方法包括将编码目的产物的多核苷酸引入真核细胞中，并选择表达目的产物的宿主细胞。可以通过如上所述的转染来实现引入。可以使用本文所述的方法进行选择，包括使用各种报告基因和选择性标记。合适地，选择这样的宿主细胞，其中编码目的产物的异源性多核苷酸被稳定地整合到宿主细胞的基因组中。示例性宿主细胞包括人胚肾(hek)细胞和中国仓鼠卵巢(cho)细胞，以及本文所述的其他真核细胞。

用于分离目的产物(例如表达的重组多肽或蛋白)的方法是本领域已知的。此类方法包括例如各种细胞裂解步骤和过滤，包括使用色谱分离等。

根据一个实施例，宿主细胞在无血清条件下培养。可以通过破坏宿主细胞然后分离产物来获得所表达的目的产物。合适地，目的产物是多肽或蛋白。多肽被合适地表达，例如分泌到培养基中，并且可以从培养基中获得。为此目的，可以在目的多肽中提供适当的前导肽。用以实现分泌的前导序列和表达盒设计是本领域熟知的。从而，能以高收率有效地产生和获得/分离多肽(例如蛋白)。

可以通过本领域已知的方法回收、进一步纯化、分离、加工和/或修饰所产生的合适地为目的多肽的目的产物。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收多肽，这些常规程序包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀。例如纯化步骤之类的进一步加工步骤可以通过本领域已知的多种程序进行，包括但不限于色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、色谱聚焦和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如制备性等电聚焦)、差别溶解(例如硫酸铵沉淀)或提取。此外，分离和纯化的目的多肽可以进一步加工并配制成组合物，例如药物组合物。

针对本文所述细胞的细胞生长条件可以包括促进目的蛋白表达的条件。如本文所用，术语“发酵”包括采用直接发酵(literalfermentation)的实施例和采用其他非发酵培养模型的实施例。在一些实施例中，发酵培养基可以选自丰富培养基、基本培养基和矿物盐培养基。

如本文所述的表达系统能以任何发酵形式培养。例如，本文可以采用分批、补料分批、半连续和连续发酵模型。如果蛋白被分泌到胞外培养基中，则连续发酵是优选的。

发酵能以任何规模进行。因此，可以使用微升规模、厘升规模和分升规模的发酵体积；并且可以使用1升规模和更大的发酵体积。在一些实施例中，发酵体积将为或大于1升。在另一个实施例中，发酵体积将为或大于5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1,000升、2,000升、5,000升、10,000升或50,000升。

用于产生目的产物的细胞的生长、培养和/或发酵在允许细胞存活的温度范围内，优选在约4℃至约55℃(包括端值)的温度范围内进行。因此，例如，如本文关于细胞所用的术语“生长”、“培养”和“发酵”固有地是指在约4℃至约55℃(包括端值)的温度范围内“生长”、“培养”和“发酵”。此外，“生长”用于指示活性细胞分裂和/或扩大的生物学状态，以及非分裂和/或非扩大细胞处于代谢维持的生物状态两者，后者对术语“生长”的使用与术语“维持”同义。

目的产物的表达可能导致细胞外多肽或蛋白的产生。方法还可以包括从周质或从胞外培养基中纯化目的多肽或蛋白的步骤。在一些实施例中，本文提供的方法允许产生目的产物，例如蛋白，然后从细胞培养物中回收该蛋白。在一些实施例中，回收蛋白包括离心以除去细胞和/或细胞碎片。在一些实施例中，回收蛋白包括过滤以除去细胞和/或细胞碎片。

可以通过本领域熟知的标准技术将目的产物(特别是蛋白和肽)分离和纯化至高纯度，这些标准技术包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、镍色谱、羟基磷灰石色谱、反相色谱、凝集素色谱、制备性电泳、洗涤剂增溶、用柱色谱等物质进行的选择性沉淀、免疫纯化方法等。例如，具有确定的分子粘附特性的蛋白可以与配体可逆地融合。使用适当的配体，可以将蛋白选择性地吸附到纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱除去。然后通过酶活性除去融合蛋白。此外，可以使用免疫亲和柱或ni-nta柱来纯化蛋白。一般技术进一步描述于例如r.scopes，proteinpurification：principlesandpractice[蛋白纯化：原理和实践]，纽约施普林格出版公司(springer-verlag：n.y.)(1982)；deutscher，guidetoproteinpurification[蛋白纯化指南]，学术出版社(academicpress)(1990)；美国专利号4,511,503；s.roe，proteinpurificationtechniques：apracticalapproach(practicalapproachseries)[蛋白纯化技术：实用方法](实用方法系列)，牛津出版社(oxfordpress)(2001)；d.bollag等人，proteinmethods[蛋白方法]，威利-丽萨出版公司(wiley-lisa，inc.)(1996)；akpatra等人，proteinexprpurif[蛋白表达与纯化]，18(2)：第182-192页(2000)；以及r.mukhija等人，gene[基因]165(2)：第303-306页(1995)中。另见例如ausubel等人(1987年和增刊)；deutscher(1990)”guidetoproteinpurification”[蛋白纯化指南]，methodsinenzymology[酶学方法]，第182卷及本系列的其他卷；coligan等人(1996年和增刊)currentprotocolsinproteinscience[最新蛋白质科学实验指南]纽约威利/格林出版社(wiley/greene，ny)；以及制造商关于使用蛋白纯化产物的文献，例如新泽西州皮斯卡特维的法玛西亚公司(pharmacia，piscataway，n.j.)或加利福尼亚州里奇蒙的伯乐公司(bio-rad，richmond，calif.)。与重组技术的组合允许融合到适当的区段，例如融合到flag序列或可通过蛋白酶可去除的序列融合的等同物。另见例如hochuli(1989)chemischeindustrie[化学工业112：69-70；hochuli(1990)″purificationofrecombinantproteinswithmetalchelateabsorbent″[用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白]，setlow(编辑)，geneticengineering，principleandmethods[基因工程、原理和方法]12：87-98，纽约普莱纽姆出版社(plenumpress，ny)；以及crowe等人(1992)qiaexpress：thehighlevelexpression&proteinpurificationsystem[qiaexpress：高水平表达和蛋白纯化系统]加利福利亚州查茨沃斯的快而精公司(quiagen，inc.，chatsworth，calif.)。

所表达的蛋白的检测也可以通过本领域已知的方法实现，并且包括例如放射免疫测定、蛋白印迹技术或免疫沉淀。

存在于细胞上清液中的所表达的重组蛋白和多肽可以通过本领域技术人员熟知的标准分离技术从宿主蛋白中分离。例如，初始盐分级分离可以将许多不期望的宿主细胞蛋白(或来源于细胞培养基的蛋白)与目的异源性多肽分离。一个这样的实例可以是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白混合物中水的量来沉淀蛋白。然后，蛋白根据其溶解度而沉淀。蛋白疏水性越强，在较低硫酸铵浓度下沉淀的可能性越大。典型的方案包括将饱和硫酸铵添加到蛋白溶液中，使得所得硫酸铵浓度在20％-30％之间。该浓度将使最疏水的蛋白发生沉淀。然后弃去沉淀物(除非目的蛋白是疏水的)并将硫酸铵添加到上清液中达到已知可使目的蛋白发生沉淀的浓度。然后将沉淀物溶解在缓冲液中，并且如果需要，通过透析或渗滤除去过量的盐。依赖于蛋白溶解度的其他方法(例如冷乙醇沉淀)是本领域技术人员熟知的，并且可用于分级分离复杂的蛋白混合物。

目的多肽或蛋白的分子量可用于使用滤过不同孔径的膜(例如，amicon或密理博(millipore)膜)的超滤来将这些目的多肽或蛋白与大小较大和较小的蛋白分离。作为第一步骤，蛋白混合物可以通过膜进行超滤，该膜的孔径具有比目的蛋白的分子量更低的分子量截留值。然后可以将超滤的滞留物针对分子截留值大于目的蛋白的分子量的膜进行超滤。目的异源性多肽将通过膜进入滤液。然后可以如下所述对滤液进行色谱分离。

目的多肽也可以基于其大小、表面净电荷、疏水性和对配体的亲和力与其他蛋白分离。另外，针对蛋白产生的抗体可以与柱基质和免疫纯化的蛋白缀合。所有这些方法都是本领域熟知的。对技术人员将显而易见的是，色谱技术能以任何规模并使用来自许多不同制造商(例如法玛西亚生物技术公司(pharmaciabiotech))的设备进行。

用于大规模产生目的产物(特别是重组多肽和蛋白)的方法是本领域已知的，并包括使用细胞培养或培养槽(vat)程序。这种大规模产生的实例包括分批、补料分批、细胞再循环和连续发酵。

筛选引起蛋白产量增加的基因的方法

在另外的实施例中，本文提供了筛选基因的方法，该基因的表达产物在受到削弱时会导致重组蛋白的产量增加。本文所述的方法可以用于检测、确定或确认某基因可参与通过细胞进行的蛋白产生，并且如果该基因受到削弱或其表达产物受到削弱，则允许细胞产生的蛋白增加。

方法包括削弱基因的表达产物在分离的细胞中的功能，以产生受到削弱的分离的细胞。本文描述了削弱基因及其表达产物的功能的各种方法，这些方法包括基因突变、编辑和基因敲除、各种转录后基因削弱方法(例如rna干扰)以及通过直接削弱所需基因的表达产物的功能或作用而对表达产物本身进行的削弱。

方法还包括将编码重组蛋白的重组基因(即核酸)引入受到削弱的分离的细胞中。本文描述了引入重组基因(包括载体等)的各种方法。

然后在允许重组蛋白表达的条件下培养受到削弱的细胞。示例性条件在本文中有所描述并且也是本领域熟知的。

如果产生重组蛋白，则将其从细胞中分离出来。用于分离重组蛋白的各种方法(包括过滤方法)是本领域已知的并且在本文中有所描述。然后确定所回收的分离的重组蛋白的体积，并在受削弱的分离的细胞之间，与基因的表达产物的作用未受到削弱的细胞中的重组蛋白的产生体积进行比较。也就是说，在受削弱的细胞和对照细胞二者中测定重组蛋白的量，并进行比较，以确定削弱基因(或基因的表达产物)是否可引起蛋白产量增加。受削弱的分离的细胞中重组蛋白的产生体积增加至少约30％表示，基因、基因的表达产物在受到削弱时会导致重组蛋白的产量增加。合适地，体积产量的增加为约50％至约500％。

如本文所述，可用于筛选此类基因的细胞合适地为真核细胞，包括哺乳动物细胞，例如hek和cho细胞。

用于削弱基因的表达产物的各种方法在本文有所描述，并包括突变、编辑或敲除基因。用于削弱基因的表达产物的功能或表达的方法(例如各种转录后修饰)可用于确定基因是否参与细胞中蛋白的产生。

涉及例如基因转录、蛋白翻译、蛋白代谢、细胞分泌能力和细胞凋亡等机制的基因是可以进行筛选以确定其对蛋白产生的作用的合适基因类别(如果受到削弱的话)。如本文所述的高通量测定法允许发现大量可以被靶向的潜在基因(和表达产物)。

实例

实例1：用于筛选与重组蛋白表达相关的基因的方法的开发

开发了以下方法来筛选在受到削弱的情况下将提高重组蛋白的表达的内源性基因。如下所述，开发了这样的高通量筛选技术：该技术能够测定调节重组蛋白表达的蛋白(从而测定基因)。

使用针对三种模型蛋白(cripto-fc、plap和hgfrα2)之一的靶向整合的载体以及表达靶向基因组中的aavs1基因座的锌指核酸酶的载体通过expifectamine来共转染人胚肾(hek)细胞(即expi293f细胞系)。如下表3所示，cripto-fc被作为高表达蛋白，plap被作为中等表达蛋白，hgfrα2被作为低表达蛋白。48小时后，施用嘌呤霉素或杀稻瘟素选择，以富集整合有载体的细胞。14天后，在96孔板中通过流式细胞术将细胞分选为单细胞。分离单集落后，扩增细胞并进行分析以确定每个克隆中重组靶基因的基因拷贝数。使用数字液滴pcr对基因拷贝数进行分析，该数字液滴pcr将重组基因的拷贝数与已知参考基因(xx)进行比较。对于每种模型蛋白，鉴定出两种细胞系，它们分别包含一个和三个(seap)或四个(gfra2和criptofc)整合的基因拷贝。重组蛋白的表达得到确认，并发现该表达与基因拷贝数相关，如图3a和图3b中针对criptofc所示。对于所有筛选实验，使用包含整合载体的单个拷贝的细胞系，并使用具有多个基因拷贝的细胞系作为增加蛋白表达的阳性对照。

表3：模型蛋白

一旦选择了针对每个蛋白模型的表达克隆，就可以进行基因编辑/突变或表达蛋白削弱(例如，通过小分子削弱)，以确定不同基因对重组蛋白表达的作用。对于每个模型蛋白，分离出两种细胞系，这两种细胞系分别包含单个或多个基因拷贝。图1显示了用于筛选目的基因的实验设计的流程图。

图2显示了表达不同模型蛋白的expi293f细胞的流式细胞术分析(facs)。正如所述，用于模型蛋白的抗体显示了每种蛋白在细胞中的表达，这证实了该模型系统可用于评估受到削弱的基因功能对重组蛋白表达的作用。除了检测到plap是内源性蛋白的一些背景表达之外，用针对模型蛋白的抗体测定的野生型细胞未显示出蛋白的表达。图3a展示了所开发的facs方法可以区分不同水平的蛋白表达(cripto-fc)，检查不同拷贝数(1、3、4)的递送的作用。图3b通过sds-page证实了cripto-fc的表达水平。这些结果说明，模型系统可用于研究削弱各种基因的基因功能和/或表达产物功能的作用，以确定它们对重组蛋白表达的作用。此外，模型已扩展到384孔系统，从而使得可以进行高通量实验和分析。

图4显示了初步筛选中整个24孔的筛选数据。x轴显示了从每个孔采样的时间。每个数据点对应于采样孔中单个细胞的荧光(y轴)。包含criptofc基因的单个基因拷贝的细胞系的dmso(空白)对照显示于图6中。还显示了阳性对照，该阳性对照是包含criptofc基因的4个拷贝的criptofc细胞系。在x轴上的110-115之间出现的样品是来自包含阳性小分子命中的孔的结果。

实例2：筛选小分子化合物以提供增加的蛋白表达

上文所述的细胞测定法被用于对小分子化合物的大文库进行对于提高重组蛋白表达的能力的筛选。测试了大约19,200种化合物。该文库由关于生物学活性的信息可用的化合物组成。每种化合物对至少一种蛋白靶标具有生物学活性，ec50＜＝100nm。hek293criptofc1b8细胞系用于初步筛选。将细胞接种于384孔板中，并用1.2μm化合物处理72小时。然后将细胞用针对缀合至荧光标记的criptofc的抗体染色，以进行荧光检测。如图4所示，通过流式细胞术在活的单细胞上测量criptofc的表达。在初步筛选中，使用z分数＞10的截止值将515种化合物鉴定为对重组蛋白表达具有积极作用。

z分数计算对板上的数据的中心和分布进行计算。在hts板中，化合物孔的中位数活性以零为中心，在零附近测得的分布由稳健标准偏差定义。然后使用以下公式，以每种单独的化合物的活性与板的中位数的远近的稳健标准偏差为单位测量每种单独的化合物：

其中x＝孔原始数据值，m＝所选的对照孔组的中位数，并且rsd是所选的孔组的稳健标准偏差(mad*1.483)。

z分数为3表示化合物的活性与板的中位数的距离为3rsd，并且是活性化合物的强指示(3sd＝99.7％置信度)。z分数的主要好处是，它在可以比较板与测定之间的化合物活性，并考虑了数据的分布(或噪音)，而活性百分比的计算则未考虑这种情况。

为了确认来自初步筛选的命中，对可用的阳性命中进行反筛选，而无需添加抗体缀合物来除去荧光化合物。平行地，确定每种化合物的最高浓度为6μm的10点浓度反应曲线。仅将缺乏固有荧光并且蛋白表达以剂量依赖性方式增加至少30％的化合物计为确认的命中。总共将98种化合物确认为增加hek293criptofc1b8细胞系中的criptofc表达的真命中。使用关于化合物的生物学活性的现有知识，将表4中的以下基因列表确定为受到削弱并最终增加重组蛋白产量的可能靶标。

对表达grfα2和plap的不同细胞进行另外的研究。对hek293criptofc1b8进行的相同测定在包含gfra2的单基因拷贝的细胞系上进行。由于hek293细胞中的内源性plap的背景略有增加(图2)，因此通过测量hek293plap细胞系分泌的酶活性来确定plap的表达。plap的活性测量基于对硝基苯磷酸至对硝基苯基的降解，这可以作为405nm处的吸光度增加来跟踪。图5显示了对表达plap和gfra2的criptofc细胞系有活性的98个初步命中的确认筛选的结果。98个命中有32个(33％)对全部三个模型蛋白的比生产率具有显著的积极作用，而37％(35+2)仅影响两个模型蛋白，最后30％仅对hek293criptofc1b8细胞系具有积极作用。

实例3：ulk1作为目的靶基因的确定

以下实例描述了将ulk1确定为其削弱会导致重组蛋白产量增加的基因所进行的实验。

用hek293plap细胞系在5ml培养物中进行了研究，以便与文献中提及的涉及重组蛋白表达的化合物进行比较。将细胞以0.2×10⁵个细胞/ml接种，并用化合物处理72小时。每种化合物的使用量为测得的ec50的10倍或最大5μm。72小时后，测定活细胞密度(图6)和plap活性(图7)。对该实验中对细胞活力和生长特性的影响最小、伴随有对plap表达的最高积极作用的10种化合物的生物学活性的注释进行分析，该分析将ulk1选为负责表型作用的最佳候选基因(表6)。

图6显示了化合物对细胞活力的作用，该作用以72小时的活细胞密度来测量。图7显示了在72小时在这些相同细胞中测量的plap基因产物的酶活性。基于这些研究，选择对酶活性具有最大作用(最高蛋白产量)而不影响细胞活力的化合物进行进一步分析。

图8显示了所选化合物的plap的体积生产率。下表5显示了每种化合物对三种不同的蛋白靶标的ac50浓度，包括化合物mrt68921。如图8所示，所有化合物都使plap的体积生产率提高约300％-600％。

表5：针对使用三种不同的蛋白靶标来改善蛋白表达的pac50

对来自该研究的最佳命中的分析表明，10个命中有8个是针对ulk1基因表达产物的。下表6显示了靶标的细分。

表6：来自表型筛选的靶标细分

为了进一步研究削弱ulk1基因的表达产物的活性如何影响蛋白产生，进行了研究以使用crispr敲除或编辑ulk1基因。如上所讨论，在hek293criptofc细胞中对ulk1基因进行修饰，并将cripto-fc用作重组蛋白产物。对于敲除实验，将hek293criptofc1b8细胞与比率为1∶1的编码cas9的载体和向导rna共转染。对于ulk1敲除实验，将两种向导rna(下面的seqidno：3和4)与cas9同时共转染。

针对人ulk1的ulk1grnac8accgcggcggcacagagaccg(外显子1中的281-299)(seqidno：3)

针对人ulk1的ulk1grnad8accgccacggcgccttcgcgg(外显子1中的336-353)(seqidno：4)

编码cas9的载体还表达绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白使得可以在转染后2天富集荧光细胞。如上所述，通过流式细胞术在转染后6天进行蛋白表达分析。结果示于图9a和图9b中。如图所示，对ulk1基因进行的crispr-cas9基因编辑导致cripto-fc酶活性增加1.6倍，这表明相对于非靶向方法而言，蛋白的产量增加。使用crispr-cas9基因编辑来编辑ulk2、ulk3或map3k7基因时，未发现明显变化。

sirna还用于下调expi293-cripto-fc细胞中的ulk1基因。如图10a所示，相对于乱序对照(scrambledcontrol)，针对ulk1基因的sirna导致蛋白产量增加1.4倍。其他被靶向的基因都不会导致蛋白产量的任何增加。在实验上，将hek293criptofc1b8细胞以1230个细胞/孔接种在384孔板中，并使用expifectamine用30nmsirna转染以制备转染复合物。在如上所述分析criptofc表达之前，将板在37℃下温育三天。图10b显示了使用各种sirna构建体实现的mrna敲除的程度(平均剩余％)，这证明了减少mrna表达的作用。

实例4：ulk1活性受到削弱的细胞系中重组蛋白产量增加的证明

如上所示，在确定ulk1负责提高重组蛋白产生能力后，分离ulk1基因受到削弱的两个克隆hek293细胞系。对于细胞系产生，将未修饰的hek293和hek293criptofc1b8细胞与比率为1∶1的编码cas9-t2a-gfp的载体和向导rna共转染。对于ulk1敲除实验，将两种向导rna(下面的seqidno：5和6)与cas9-t2a-gfp同时共转染(cas9：grna1a：grna1b的比率为1∶0.5∶0.5)。

针对人ulk1的ulk1grna1aagaccaaagcgaaggcgccg(seqidno：5)

针对人ulk1的ulk1grna1bcggcccgggatcccccgccc(seqidno：6)

通过荧光辅助细胞分选将gfp阳性单细胞分选到96孔板中来获得克隆细胞系。将细胞维持在dmem+10％胎牛血清、37℃和5％co2中。一旦获得每个克隆的足够细胞，就使它们适应回到悬浮培养物和expi293表达培养基。通过整个预期缺失位点的pcr进行的遗传分析，可以鉴定出整个ulk1等位基因的期望缺失的克隆。对于每个细胞背景，选择一个克隆进行进一步的实验，即expi293ulkko(9f6)和expi2931b8ulk1ko(1c11)。

用编码cripto-fc的质粒瞬时转染expi293和expi293ulk1ko(9f6)，该质粒用于产生hek293criptofc1b8细胞系。转染前一天，将细胞以2×10⁶个细胞/ml接种在expi293表达培养基中，然后在37℃和8％co2下以150rpm在锥形瓶中温育。第二天，用与聚乙烯亚胺复合的1微克/毫升的质粒dna转染细胞。在评估蛋白表达水平之前，将细胞在37℃和8％co2下以250rpm在tubesin50管中温育六天。将稳定表达cripto-fc的细胞系以0.5×10⁶个细胞/ml接种，并在相同条件下温育三天，然后测量criptofc表达水平。从图11中可以看出，在稳定(1.4x)和瞬时(3.2x)转染的细胞系中，其中ulk1基因已敲除的细胞系的重组criptofc表达有所增加。

通过使用amaxa核转染系统和试剂(龙沙公司(lonza))用表达质粒转染cho悬浮细胞，产生了表达人igg1ab001的中国仓鼠卵巢(cho)细胞系。除了谷氨酰胺合成酶选择性标记以外，表达质粒还编码ab001重链和轻链基因。选择转染的细胞，并将这些细胞在存在50μm甲硫氨酸砜亚胺(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))的情况下维持在专有培养基中。通过有限稀释克隆法获得克隆细胞系，并将该克隆细胞系在通风的锥形瓶(康宁公司(corning))中在5％(v/v)co2中在37℃下以140rpm振荡进行常规培养，并且每3-4天进行传代培养。使用vi-cell细胞活力分析仪(贝克曼库尔特公司(beckman-coulter))通过自动台盼蓝排除测定法来确定细胞浓度和活力。

在平行烧瓶中以7×10⁵个细胞/ml接种表达ab001的cho细胞系，最终体积为45ml。在水中稀释ulk1抑制剂。在接种后第3天，将ulk1抑制剂的等分试样添加到一式三份的培养物中达到1μm的终浓度，并与一式三份的未处理培养物进行比较。在培养期间，所有培养物均补充了五次大剂量添加的专有营养饲料，并监测和维持葡萄糖水平。在整个时间过程中采集培养物样品，并将这些样品用于采用蛋白a分析法的对ab001滴定度的定量。

单剂量的1μmulk1抑制剂足以在表达ab001的稳定细胞系中实现体积滴定度的显著增加，而对细胞生长和细胞活力的影响极小(图12a-b)。

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