模块化DNA组装系统的制作方法

本发明总的来说涉及一种被称为midas(模块化幂等dna组装系统)的用于合成生物学的模块化和层次化dna组装平台，利用这种系统使用标准化组装设计在单一反应中精确组装多个dna片段的方法，以及重建生物合成途径用于后续生产至少一种吲哚二萜的方法。
背景技术：
：：合成生物学的核心要求是将生物系统分解为基本的、可重复使用的部件或模块，并以标准化方式重新组织和重新组装这些部件，以产生新的遗传模块、相互作用的蛋白质、控制回路、代谢途径和高价值产品的能力。近年来，已出现了大量赋能技术可以在遗传水平上满足这些要求。大多数这些技术分为四大类，每类都提供了强大的特点和局限性：(i)利用位点特异性重组酶将dna分子组装在一起的技术，(ii)基于含有交叠序列的dna分子的体外组装的技术，(iii)利用细胞的基于重组的机制来组装带有同源序列的dna分子的体内技术，以及(iv)基于限制性酶的技术。位点特异性重组系统，例如基于噬菌体λ(1)或p1(2,3)或其组合(4,5)的系统，可用于多基因组装体的高效、高通量构建。然而，由于存在重组位点序列瘢痕，基于位点特异性重组的技术不容易地实现模块化设计，用于从较简单部件进行基因的组合装配。使用dna序列交叠实现体外组装的技术例如重叠延伸pcr(6)、gibson组装(7)、融入(in-fusion)(8,9)和其他不依赖于连接的克隆方法(10,11)，可以在单一反应中将多个片段高效组装在一起，并且由于它们在很大程度上是不依赖于序列的(即不依赖于特定序列例如限制性酶识别位点)，因此产生无痕(无缝)组装。然而，这些技术不容易实现模块化，因为每次在引入新的片段或改变组装顺序时都需要设计新的引物组。已为大肠杆菌(12)、芽孢杆菌属物种(13,14)和酵母(15-18)开发了利用细胞同源重组机制将带有重叠末端序列的多个dna片段组装在一起的体内组装方法。体内组装技术具有构建大型生化途径和基因组规模组装体的能力，但与交叠序列指导的体外组装方法一样，它们在本质上是量身定制的，不容易将其用于从较简单的部件进行基因的模块化组装。使用常规的(iip型)限制性酶将dna片段(例如基因)串联排列在一个载体中的传统方法苦于下述问题，即随着dna片段数目的增加，可用的限制性酶变得有限，并且克隆变得越来越复杂。使用稀有切点限制性酶(19,20)或同尾酶(21)的方法在将多个基因组装在单一载体中已取得一定成功，但不提供也(理论上)能够无限成长的真正灵活或模块化的组装系统。在克服这种限制并将组装过程标准化的尝试中，开发了被称为biobrick标准的一套设计规则(22)，其中在dna组装的背景中提出了幂等性的想法，其中对组分进行的反应产生新的结构，但该结构在其参与进一步反应的能力方面保持不变。然而，对于这些技术来说限制性位点瘢痕的存在可能构成问题，特别是在从较小片段组装基因时。更近些时候，已描述了基于金门克隆的模块化dna组装技术(23)。金门克隆利用iis型限制性酶识别非回文序列并在识别位点的一侧切割的能力，在单一(一锅)反应中将多个dna片段无缝联结在一起。诸如goldenbraid(24,25)、拓扑学等价tnt克隆(26)、moclo(27,28)和binder等人描述的质粒组装系统(29)的技术，已使用幂等性的想法来扩展金门克隆的原理，从而允许从较小片段的文库进行基因的模块化和组合装配，并随后在单个质粒中将多个基因组装在一起。在这些系统中，组装的方向由邻近片段和载体末端的iis型单链突出端的相容性决定。因此，在多基因组装(即多个基因在单一载体中的组装)的水平上，只有一个组装方向是可能的，并且所述多基因质粒的生长(即其他基因的添加)只能发生在一个方向上(即是单向的)。尽管对于某些项目而言这可能不是问题，然而在某些情况下，这些单向模块化组装系统(umas)对可产生的多基因质粒的类型或者它们可以被构建的容易性施加了限制。先前描述的umas固有的多基因组装的单向本性施加限制的情况的一个实例，是在构建多基因组装体用于试验旨在通过同源重组整合到表达宿主染色体中的基因的表达时。在这个例子中，需要将感兴趣的基因置于两侧的左和右同源臂(其介导同源重组过程)之间。在先前描述的umas中，这只能通过两种方式实现：(i)使用可选克隆技术来构建新的载体，其中介导模块化组装的iis型限制性位点和序列元件(被称为金门克隆盒)被置于两个同源臂之间。然而，这种对使用不同的克隆技术(即不使用用于多基因组装的基于金门的模块化组装系统)来构建新载体的需要，首先否定了使用模块化组装系统的原始益处。此外，每次要测试不同的染色体整合位点时，都需要构建新的载体(含有新的同源臂)，或者(ii)使用umas顺序装载第一同源臂，然后是感兴趣的基因，最后是第二同源臂。尽管这避免了(i)中描述的必须使用可选克隆技术的缺点，但它意味着染色体整合只能在已添加第二同源臂后实现。因此，在这些umas中，第二同源臂的添加有效地“封闭了”组装回路，使得任何进一步添加的基因总是位于所述同源臂之外。单向组装的缺点的另一个实例是umas固有的多基因组装的单向本性限制了许多这些位置排列可以被构建的速度和容易性。因此，尽管(单向)基于金门的模块化组装技术可用于构建某些类型的多基因组装体，但它们不提供完全灵活的组装方法。因此，在本领域中对在构建设计者多核苷酸和基因组装体中为用户提供灵活性的可选替的dna组装系统，存在着需求。因此，本发明的目的是至少以某种方式来解决现有技术在提供模块化dna组装系统中的缺陷，允许双向构建多基因组装体和/或至少为公众提供有用的选择。在本说明书中，在对专利说明书、其他外部文献或其他信息源做出引用时，这通常是出于为本发明的特点的讨论提供背景的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何管辖范围内是先有技术或形成本领域公知常识的一部分。技术实现要素：一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少两种穿梭载体v1和v2，其中v1选自v1.1(+)＝5’-a1b1m1b2c1c2a2-3’，v1.2(-)＝5’-a1c1c2b1m1b2a2-3’，v1.3(+)＝5’-a1b2m1b1c1c2a2-3’，和v1.4(-)＝5’-a1c1c2b2m1b1a2-3’，并且v2选自v2.1(+)＝5’-c1b1m1b2a1m2a2c2-3’，v2.2(-)＝5’-c1a1m2a2b1m1b2c2-3’，v2.3(+)＝5’-c1b2m1b1a1m2a2c2-3’，和v2.4(-)＝5’-c1a1m2a2b2m1b1c2-3’，其中m1是第一标记，m2是第二标记，并且a1、a2、b1、b2、c1和c2是限制性酶识别位点，其中至少a1、a2、c1和c2是iis型限制性酶的识别位点，其中a1、b1和c1是全都不同的限制性位点，并且其中a1＝a2，c1＝c2，并且b1＝b2或b1≠b2。另一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少三种穿梭载体，其中所述三种载体中的至少两种是选自下述的v1载体：v1.1(+)＝5’-a1b1m1b2c1c2a2-3’，v1.2(-)＝5’-a1c1c2b1m1b2a2-3’，v1.3(+)＝5’-a1b2m1b1c1c2a2-3’，和v1.4(-)＝5’-a1c1c2b2m1b1a2-3’，其中所述v1载体中的至少一者是(+)载体并且另一个v1载体是(-)载体，并且其中所述三种载体中的至少一种是选自下述的v2载体：v2.1(+)＝5’-c1b1m1b2a1m2a2c2-3’，v2.2(-)＝5’-c1a1m2a2b1m1b2c2-3’，v2.3(+)＝5’-c1b2m1b1a1m2a2c2-3’，和v2.4(-)＝5’-c1a1m2a2b2m1b1c2-3’，其中m1是第一标记，m2是第二标记，并且a1、a2、b1、b2、c1和c2是限制性酶识别位点，其中至少a1、a2、c1和c2是iis型限制性酶的识别位点，其中a1、b1和c1是全都不同的限制性位点，并且其中a1＝a2，c1＝c2，并且b1＝b2或b1≠b2。另一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少两种穿梭载体，其中每种穿梭载体包含第一标记(m1)和至少六个限制性位点，其中所述限制性位点中的至少四个是iis型限制性位点，其中在至少一个第一穿梭载体中，第一组四个限制性位点位于m1的3’或5’，所述四者中的至少三者是iis型限制性位点，并且第二组两个限制性位点位于m1的3’或5’，所述两者中的至少一者是iis型限制性位点，并且其中在至少一个第二穿梭载体中，第一组四个限制性位点位于m1的3’或5’，所述四者中的至少三者是iis型限制性位点，并且第二组两个限制性位点位于m1的5’或3’，所述两者中的至少一者是iis型限制性位点，其中所述至少一个第二穿梭载体包含至少一个两侧带有两个iis型限制性位点的第二标记(m2)，并且其中当在所述至少一个第一或第二载体中所述第一组四个限制性位点位于m1的3’时，所述第二组两个限制性位点位于m1的5’，并且所述载体是(+)载体，并且当在所述至少一个第一或第二载体中所述第一组四个限制性位点位于m1的5’时，所述第二组两个限制性位点位于m1的3’，并且所述载体是(-)载体。另一方面，本发明涉及一组八个穿梭载体，每个穿梭载体包含第一标记(m1)和六个限制性位点,其中每个穿梭载体包含位于m1的一侧上的第一组四个限制性位点和位于m1的另一侧上的第二组两个限制性位点，其中所述第一组限制性位点中的两个彼此相同，所述第二组中的两个限制性位点彼此不同，并且所述第二组中两个限制性位点中的至少一者与所述第一组的四个限制性位点中的一者相同，并且其中所述穿梭载体中的四者包含第二标记(m2)，其中所述载体中的四者是在m1的3’包含所述第一组限制性位点的(+)载体，并且所述载体中的四者是在m1的5’包含所述第一组限制性位点的(-)载体。另一方面，本发明涉及一种制造包含至少两种穿梭载体的载体组的方法，所述方法包括将本发明的至少一种v1穿梭载体或第一穿梭载体与本发明的至少一种v2穿梭载体或第二穿梭载体相组合。另一方面，本发明涉及一种包含至少两个转录单位(tu)的多基因构建物的制造方法，所述方法包括：(a)将包含以下述顺序排列的第一转录单位(tu1)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第一克隆盒：5’-a1-tu1-c1-c2-a2-3’，或5’-a1-c1-c2-tu1-a2-3’，克隆到在第二标记(m2)两侧包含一对限制性位点a1和a2的终载体(v3)中，以制造：包含5’-tu1-c1-c2-3’的终载体v3.1或包含5’-c1-c2-tu1-3’的终载体v3.2，(b)将包含以下述顺序排列的第二转录单位(tu2)、第二标记(m2)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第二克隆盒：5’-c1-tu2-a1-m2-a2-c2-3’，或5’-c1-a1-m2-a2-tu2-c2-3’，克隆到v3.1中，以制造包含5’-tu1-tu2-a1-m2-a2-3’的终载体v4.1或包含5’-tu1-a1-m2-a2-tu2-3’的终载体v4.2，或克隆到v3.2中，以制造包含5’-tu2-a1-m2-a2-tu1-3’的终载体v4.3或包含5’-a1-m2-a2-tu2-tu1-3’的终载体v4.4，其中a1和c1是不同的限制性位点，并且其中a1＝a2并且c1＝c2。另一方面，本发明涉及一组载体，其包含：(i)四个本发明的第一穿梭载体或v1穿梭载体，(ii)四个本发明的第二穿梭载体或v2载体，和(iii)至少一种包含一对限制性位点的终载体，其中(iii)中的所述一对限制性位点相对于彼此具有趋异取向，并且与(i)中的每个穿梭载体中的和(ii)中的每个穿梭载体中的一对限制性位点相同，其中所述(i)中的限制性位点相对于彼此具有趋同取向，并且其中所述(ii)中的限制性位点相对于彼此具有趋异取向。上面讨论的本发明的不同方面的各种不同实施方式也在下面本发明的详细描述中阐述，但本发明不限于此。从下面仅仅作为实例给出的描述并参考附图，本发明的其他方面将变得显而易见。附图说明现在将参考附图中的图来描述本发明。图1.midas1级克隆的概述。所述图说明了midas1级克隆的原理。在每张图中，对midas1级组装来说重要的元件在左侧示意示出。序列水平的详情示出在右侧。(a)源载体pml1的金门克隆盒(两侧带有趋异的bsmbi位点的laczα)。序列5’-ggtctcgtgagacg-3’＝seqidno：116；序列5’-cgtctctagacc-3’＝seqidno：117。(b)含有两侧带有趋同的bsmbi位点的启动子(proutr)模块的pcr产物。序列5’-cgtctcactcgggag-3’＝seqidno：118；序列5’-aatgtgagacagagacg-3’＝seqidno：119。4bp序列ggag和aatg代表proutr模块独有的的模块特异性特征。在pml1与所述扩增的proutr模块之间的bsmbi介导的金门反应后，获得由克隆到pml1中的proutr模块构成的质粒(c)。按照金门克隆，在产物质粒中bsmbi识别位点被消除。pml1和用于扩增所述模块的引物的互补设计产生了两侧带有趋同的bsai识别位点的克隆模块，其在消化后的单链突出端是模块特异性碱基。序列5’-ggtctcgggag-3’＝seqidno：120；序列5’-aatgtgagacc-3’＝seqidno：121。图2.midas模块地址系统。示意描绘了一种真核转录单位(tu)，其包含cds和控制其表达的周围元件(5’和3’调控区，暗灰色)。5’调控区由非转录启动子(pro)区和5’非翻译区(utr)构成，而3’调控区由3’utr和含有的多腺苷化信号非转录终止子(term)构成。出于midas的目的，这些区域中的每一者可以作为分开的转录单位模块(tum)生产。然而，在许多情况下，这种复杂度水平可能不合乎需要，并且组装tu所需的tum的最小数目可以被减少到3(proutr、cds和utrterm)。tu从克隆的1级tum的有序和定向组装通过确保每种类型的tum在两侧带有在图顶上示出的在切割后形成单链突出端的独特的一组核苷酸(模块特异性碱基)来实现。图3.midas盒的概述。示意示出了八种pml2穿梭载体中的每一者中midas盒的结构。在每个midas盒中，虚线框示出了金门克隆盒(包含两侧带有趋异的bsai位点的phes负选择标记)。在左图中示出了pml2“w”载体(由质粒名称中的“w”指明)中的midas盒，右图中示出了“b”载体(由质粒名称中的“b”指明)中的midas盒。pml2“正向”载体(由质粒名称中的“f”后缀指明)的bsai识别位点(用于tu的金门组装)相对于由质粒名称中的“r”后缀指明的pml2“反向”载体中的bsai融合位点对调。pml2(+)载体被示出在图的上半部分中，pml2(-)载体被示出在下图中。(+)或(-)载体的选择决定了在3级中新的tu(或ge)被添加到产生的生长中的多基因组装体的方向。图4.midas3级(多基因)组装的原理。midas多基因组装涉及将tu顺序添加到3级终载体pml3中，以形成多基因构建物。所述3级组装使用在“w”和“b”pml2载体中组装的tu，通过交替的金门反应来进行。因此，在每轮组装后产生的质粒变成下一轮组装的终载体。示出了三轮midas3级组装。在图的顶部示出了pml3终载体中的金门盒([catt]aari-laczα-aari[cgta])。在左侧示出了用于三个2级入门克隆的midas盒(即组装在pml2穿梭载体中的tu)。tu1和tu3两者被示出为以正向方向组装在pml2(+)wf载体中，而tu2被示出为以反向方向组装在pml2(+)br载体红。在第一轮3级组装中，通过aari介导的金门反应将tu1从tu1:pml2(+)wf移动到pml3中(相容的粘性末端用虚线示出)，并分析含有x-gal的板上的白色菌落。得到的质粒(pml3:tu1)被示出在右侧。在下一轮中，通过bsmbi介导的金门反应将tu2从质粒tu2:pml2(+)br移动到pml3:tu1中，产生含有tu1和tu2两者的质粒(pml3:tu1:tu2)，并分析蓝色菌落。在第三轮中，通过aari介导的金门组装将tu3从tu3:pml2(+)wr移动到pml3:tu1:tu2中，并分析白色菌落。由于最终的多基因质粒(pml3:tu1:tu2:tu3)含有两个趋异的bsmbi位点，因此组装回路对于其他tu的添加仍然开放。每个tu被添加到多基因组装体的顺序由最终的多基因构建物中每个tu上方的序号指明。图5.midaspml2穿梭载体允许控制在3级时产生的多基因质粒中tu的组装顺序、方向和极性。所述图示意示出了在根据每种midas格式产生的假想多基因质粒中三个tu的配置，并且表示出了用于组装每个tu的pml2质粒。(a)最简单的midas格式为了产生多基因质粒(在3级时)，在2级时仅使用两个pml2穿梭载体来组装tu——一个“w”载体(pml2(+)wf)和它的“b”对应物(pml2(+)bf)。所述tu都采取相同方向(正向)，并且所述多基因质粒只能以一个方向组装(即进一步的tu被添加到最后添加的tu的右侧)。(b)扩展的midas格式使用四个pml2穿梭载体作为产生多基因质粒的基础——“w-正向”载体(pml2(+)wf)及其“b”对应物(pml2(+)bf)，和“w-反向”载体(pml2(+)wr)及其“b”对应物(pml2(+)br)。tu可以以正向或反向中的任一方向转录，但与(a)中描述的最简单的midas格式相同，多基因组装体仍然只能以一个方向构建。(c)完全midas格式使用八个pml2穿梭载体——四个(b)中描述的“plus”(+)载体和它们的四个“minus”(-)极性对应物——允许对多基因组装的次序(通过选择“w”和“b”载体)、tu取向(通过使用正向或反向载体)和极性(通过使用(+)或(-)载体)进行完全的用户控制。图6.midas1级入门克隆的限制性消化分析。将从42个白色1级菌落(即每种模块两个菌落)制备的质粒dna用bsai消化，并将反应在用safe(thermofisherscientific)染色的0.9％(w/v)琼脂糖tae凝胶上电泳。在每块凝胶顶部示出的每个质粒名称后的后缀(-1或-2)指示每种构建物分析的两个菌落中的每一个。每个质粒带有的模块在括号中示出。预期的片段大小(bp)被列出。(a)1级proutr入门克隆的分析。psk1(paxgproutr)：2720，545；psk4(paxmproutr)：2720，1232；psk7(paxbproutr)：2720，1046；pkv28(paxcproutr)：2720，1142；psk75(paxpproutr)：2720，2388；psk76(paxqproutr)：2720，1760；psk17(trpcproutr)：2720，1289。(b)1级cds入门克隆的分析。psk2(paxgcds)：2720，1295；psk5(paxmcds)：2720，1560；psk8(paxbcds)：2720，820；psk11(paxccds)：2720，1078；psk69(paxpcds)：2720，1850；psk71(paxqcds)：2720，2088；psk16(nptiicds)：2720，797。(c)1级utrterm入门克隆的分析。psk3(paxgutrterm)：2720，511；psk6(paxmutrterm)：2250，757；psk9(paxbutrterm)：2720，425；psk12(paxcutrterm)：2720，274；psk70(paxputrterm)：2720，273；psk72(paxqutrterm)：2720，502；psk15(trpcutrterm)：2720，730。m：来自于thermofisherscientific的1kbplusdna序列梯。pml1也用bsai消化：3045。所有克隆的1级模块显示出预期的限制性消化图案。图7.在本工作中产生的midas2级转录单位(tu)。tu用它们含有的cds的名称注释。用于paxb、paxp和paxq的tu从本源启动子和终止子模块组装(分别产生2级入门克隆psk23、psk73和psk74)。使用本源启动子和终止子模块组装了两个paxmtu，尽管在不同的pml2穿梭载体中——psk22使用pml2(+)wr来组装，而prb1使用pml2(+)br来组装。组装了两个paxgtu入门克隆。第一个(被称为psk21)从本源启动子和终止子模块组装在pml2(+)br中。第二个(psk47)也使用pml2(+)br组装，但使用异源的paxbproutr模块，并且为清楚起见，这个tu被显示为ppaxb-paxg-tpaxg。组装了三个paxctu。两个使用本源启动子和终止子来组装；pkv29使用pml2(+)bf组装，psk59使用pml2(+)wf组装。第三个paxctu也组装在pml2(+)wf中，但使用异源的trpcproutr和trpcutrterm模块。得到的入门克隆被称为psk61，并且为清楚起见，所述tu被显示为ptrpc-paxc-ttrpc。nptiitu(提供对遗传霉素的抗性)在pml2(+)wf中组装，产生质粒psk26，并且所述tu结构被显示为ptrpc-nptii-ttrpc。图8.midas2级入门克隆的限制性消化分析。除非另有陈述，否则将从22个2级菌落(每种组装的质粒两个菌落)制备的质粒dna用ncoi处理，并将反应在用safe(thermofisherscientific)染色的0.9％(w/v)琼脂糖tae凝胶上电泳。在每块凝胶顶部示出的每个质粒名称后的后缀(-1或-2)指示每种构建物分析的两个菌落中的每一个。每个质粒带有的转录单位在括号中示出。给出了预期的片段大小(bp)。用ncoi+ecori处理的psk21(paxgtu)：3390，1273，591；psk22(paxmtu)：2884，1739，1314，222；psk23(paxbtu)：3642，901，651；psk59(paxctu)：3271，1447，386；psk61(ptrpc-paxccds-ttrpc)：2716，1980，1011；psk26(ptrpc-nptiicds-ttrpc)：2716，1871，839；prb1(paxmtu)：3181，1739，1310，222；pkv29(paxctu)：3568，1447，382；psk47(ppaxb-paxgcds-tpaxg)：3642，2113；用ncoi+nhei处理的psk73(paxptu)：4316，3098；psk74(paxqtu)：2827，2402，1731。m：来自于thermofisherscientific的1kbplusdna序列梯。也将2级穿梭载体用ncoi消化：pml2(+)wf：3730；pml2(+)wr：3730；pml2(+)bf：4023；pml2(+)br：4023。除了psk73-1之外，所有组装的tu克隆显示出预期的限制性消化图案(>95％)。图9.在本工作中产生的用于在蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2250(cy2)中重构蕈青霉素生物合成途径的midas3级多基因质粒。质粒通过将用于nptii、paxg、paxm、paxb、paxc、paxp和paxq的tu顺序装载到pml3终载体中来生产。每种tu被装载的次序由每个tu上方的数字示出。菌株pn2250(cy2)含有整个pax簇的缺失。图10.midas3级质粒的限制性消化分析。将从22个3级菌落(每个组装反应两个菌落)制备的质粒dna用ncoi消化，并将反应在用safe(thermofisherscientific)染色的0.9％(w/v)琼脂糖tae凝胶上电泳。在每块凝胶顶部示出的每个质粒名称后的后缀(-1或-2)指示每种构建物分析的两个菌落中的每一个。每个质粒带有的转录单位在括号中示出。给出了预期的片段大小(bp)。未切割的pml3：3041；psk33(nptii)：4725，839；psk34(nptii-paxg)：7385，839；psk36(nptii-paxg-paxm)：4893，3787，1739，839，222；psk37(nptii-paxg-paxm-paxb)：5655，3787，1739，1187，839，651，222；psk64(nptii-paxg-paxm-paxb-paxc)：5280，3787，1739，1447，1187，1129，839，651，222；psk63(nptii-paxg-paxm-paxb-paxc)：4725，3787，2723，1739，1187，1011，839，651，222；psk78(nptii-paxg-paxm-paxb-paxc-paxp)：10100，3787，1739，1447，1187，1129，839，651，222；psk79(nptii-paxg-paxm-paxb-paxc-paxp-paxq)：7590，4836，3787，1739，1731，1447，1187，1129，839，651，222；prb3(nptii-paxm)：5194，1739，1428，839，222；pkv30(nptii-paxc)：5581，1447，839，500；psk52(nptii-paxg)：5655，2231，839。m：来自于thermofisherscientific的1kbplusdna序列梯。除了psk63-2之外的所有克隆在限制性酶消化后显示出预期的条带图案(>95％)。图11.蕈青霉(p.paxilli)转化体的hplc分析。hplc分析(271nm)被用于从真菌菌丝体提取的idt的鉴定。(a)雀稗灵和蕈青霉素参比标准品的叠加的hplc迹线。(b)野生型菌株pn2013的hplc迹线，显示出雀稗灵和蕈青霉素的存在。示出了δpax突变体pn2250(cy2)的hplc迹线(ci)和该突变体用质粒psk64(cii)、psk63(ciii)、psk37(civ)或psk79(cv)转化后的hplc迹线。所述hplc迹线左侧的有色框示出了每种蕈青霉(p.paxilli)菌株的基因型和每种转化质粒的基因型，并且叉(x)指示已从ko菌株的基因组缺失的pax基因。正如预期，亲代δpaxko菌株pn2250(cy2)不存在雀稗灵和蕈青霉素，正如通过hplc(迹线ci)和eic(图17)所评估的。对于转化体psk64:pn2250和psk63:pn2250(分别为迹线cii和ciii)来说，鉴定到对应于雀稗灵的峰，尽管水平低。它们的身份通过相应的422.305±0.01m/zeic(分别为图18a和图19a)得以确认。转化体psk37:pn2250充当阴性对照，并且通过hplc(迹线civ)鉴定到没有对应于蕈青霉素或雀稗灵的峰，在eic分析中也没有鉴定到(图20)。图12.菌丝体提取物的薄层层析(tlc)分析。为了筛选用于生产idt的真菌转化体，将真菌菌丝体的2-丁酮提取物与纯化的雀稗灵参比标准品一起在正相tlc板上层析，并用ehrlich’s试剂可视化。雀稗灵参比标准品的迁移位置用箭头指示。(a)蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)的psk64转化体的分析。在用质粒psk64转化蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)后分析的13个真菌株系中，5个(株系6、7、8、10和14)在它们的提取物中显示出存在雀稗灵的证据。将用质粒psk37转化的真菌充当阴性对照(标记“psk37”的道)。(b)蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)的psk63转化体的分析。在用质粒psk63转化蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)后分析的5个真菌株系中，3个(株系5、8和11)在它们的提取物中显示出存在雀稗灵的证据。将用质粒psk37转化的真菌充当阴性对照(标记“psk37”的道)。(c)蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)的psk37转化体的分析。考虑到在(a)和(b)中描述的tlc筛选中产生雀稗灵的遗传霉素抗性转化体的比例低(44％)，筛选了较大量的psk37(阴性对照)转化体样品。正如预期，分析的10个株系在它们的提取物中均未显示出雀稗灵的证据。图13.来自于蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)的psk79转化体的菌丝体提取物的薄层层析(tlc)分析。为了筛选用于生产idt的psk79转化体，将真菌菌丝体的2-丁酮提取物与纯化的雀稗灵和蕈青霉素参比标准品一起在正相tlc板上层析，并用ehrlich’s试剂可视化。雀稗灵和蕈青霉素参比标准品的迁移位置分别用实线和虚线箭头指示。将用质粒psk37转化的真菌充当阴性对照(标记“psk37”的道)。在用质粒psk79转化蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)后分析的15个真菌株系中，9个(株系1、2、4、11、12、13、14、18和20)在它们的提取物中显示出存在蕈青霉素和雀稗灵两者的证据。株系5显示出雀稗灵的证据，但蕈青霉素表型通过tlc不太清楚。4个株系(3、6、9和10)既不产生雀稗灵也不产生蕈青霉素。株系8也不产生蕈青霉素，但产生雀稗灵和在tlc中迁移在雀稗灵上方的化合物(仍有待表征)。正如预期，用质粒psk37转化的真菌不生产雀稗灵或蕈青霉素。图14.从野生型蕈青霉(p.paxilli)(菌株pn2013)纯化的雀稗灵标准品的提取离子色谱图(17.6分钟，m/z422.305±0.01)。图15.从野生型蕈青霉(p.paxilli)(菌株pn2013)纯化的蕈青霉素标准品的提取离子色谱图(5.3分钟，m/z436.248±0.01)。图16.野生型蕈青霉(p.paxilli)(菌株pn2013)的提取离子色谱图，示出(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)和(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。图17.蕈青霉(p.paxilli)δpax突变体(菌株pn2250(cy2))的提取离子色谱图，示出了不存在(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)和(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。图18.psk64:pn2250转化体的提取离子色谱图，示出了存在(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)但不存在(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。图19.psk63:pn2250转化体的提取离子色谱图，示出了存在(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)但不存在(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。箭头标出16至18之间的雀稗灵峰的位置。图20.psk79:pn2250转化体的提取离子色谱图，示出了(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)和(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。图21.psk37:pn2250转化体的提取离子色谱图，示出了不存在(a)雀稗灵(17.6分钟，m/z422.305±0.01)和(b)蕈青霉素(5.3分钟，m/z436.248±0.01)的lc-ms峰。图22.雀稗灵的1h-nmr波谱。图23.雀稗灵的13c-nmr波谱。图24.雀稗灵的1h-1hcosy-nmr波谱。图25.雀稗灵的hmbc-nmr波谱。图26.雀稗灵的hsqc-nmr波谱。图27.蕈青霉素的1h-nmr波谱。图28.蕈青霉素的13c-nmr波谱。图29.蕈青霉素的1h-1hcosy-nmr波谱。图30.蕈青霉素的hmbc-nmr波谱。图31.蕈青霉素的hsqc-nmr波谱。图32.在本工作中产生的midas3级基于细菌人工染色体(bac)的多基因组装体。为了使用基于细菌人工染色体(bac)的3级终载体在蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2253(lm662)中重建蕈青霉素生物合成途径，通过将用于nptii、paxg、paxc、paxm、paxb、paxp和paxq的tu顺序装载到pml3-bac中，产生了多基因组装体。每种tu被装载的次序由每个tu上方的数字示出。菌株pn2253(lm662)含有整个pax簇的缺失。图33.midas3级bac组装体的限制性消化分析。将从pml3-bac和每个bac组装反应一个菌落制备的质粒dna用ncoi消化，并将反应在用safe(thermofisherscientific)染色的0.8％(w/v)琼脂糖tae凝胶上电泳。预期的片段大小(bp)列出如下，每个构建物带有的转录单位在括号中示出。pml3-bac：6767，1157；pkv101(nptii)：7542，1157，910，839；pkv102(nptii-paxg)：7542，3571，1157，839；pkv132(nptii-paxg-paxc)：7542，2860，1465，1447，1157，839；pkv134(nptii-paxg-paxc-paxm)：7542，2860，1983，1740，1447，1379，1157，839，222；pkv137(nptii-paxg-paxc-paxm-paxb)：7542，2860，1983，1740，1539，1447，1187，1157，839，652，222；pkv139(nptii-paxg-paxc-paxm-paxb-paxp)：7542，6359,2860，1983，1740，1447，1187，1157，839，652，222；pkv140(nptii-paxg-paxc-paxm-paxb-paxp-paxq)：7664，7542，2860，2156，1983，1740，1447，1187，1157，839，652，222。m：来自于newenglandbiolabsinc.的purple1kbdna序列梯。所有克隆在限制性酶消化后显示出预期的条带图案。图34.来自于蕈青霉(p.paxilli)pn2253(lm662)的pkv140转化体的菌丝体提取物的薄层层析(tlc)分析。为了筛选用于生产idt的转化体，将真菌菌丝体的2-丁酮或乙酸乙酯提取物与纯化的雀稗灵和蕈青霉素参比标准品一起在正相tlc板上层析，并用ehrlich’s试剂可视化。雀稗灵和蕈青霉素参比标准品的迁移位置分别用实线和虚线箭头指示。在用bacpkv140转化蕈青霉(p.paxilli)pn2253(lm662)后分析的5个真菌株系中，4个(株系1至4)在显示出蕈青霉素和雀稗灵生产的证据，1个(株系5)显示出既没有蕈青霉素也没有雀稗灵生产。图35.来自于用pkv140bac转化的蕈青霉(p.paxilli)pn2253(lm662)的提取物的hplc分析。hplc分析(280nm)被用于从真菌菌丝体提取的idt的鉴定。(a)蕈青霉素、雀稗灵和乙腈acn(空白)参比标准品的叠加的hplc迹线。(b)野生型菌株pn2013的hplc迹线，显示出蕈青霉素和雀稗灵的存在。示出了δpaxko突变体pn2253(lm662)的hplc迹线(迹线ci)，并示出了该突变体用pkv140bac转化后的hplc迹线(cii)。所述hplc迹线左侧的框示出了每种蕈青霉(p.paxilli)菌株的基因型和转化bac的基因型，并且叉(x)指示已从敲除菌株的基因组缺失的pax基因。正如预期，亲代δpax菌株pn2253(lm662)不存在蕈青霉素和雀稗灵，正如通过hplc(迹线ci)所评估的。对于转化体pkv140:pn2253(cii)来说，鉴定到对应于蕈青霉素和雀稗灵的峰，尤其是以相对于pn2013野生型菌株颠倒的滴度(即所述转化体产生格外高的量的雀稗灵和相对低的量的蕈青霉素)。发明详述定义当在本说明书和权利要求书中使用时，术语“包含”意味着“至少部分由……构成”；也就是说当在本说明书和权利要求书中解释包括“包含”的陈述时，在每个陈述中以该术语作为开端的特点都需要存在，但其他特点也可以存在。相关术语例如“包含”应该以相似方式解释。当在本文中使用时，术语“基本上由……构成”意味着指定的材料和步骤以及不实质性影响所宣称的发明的基本和新颖特征的材料和步骤。当在本文中使用时，术语“由……构成”意味着所宣称的发明的指定的材料或步骤，不包括所述宣称中未指定的任何要素、步骤或成分。术语“识别位点”和“限制性位点”在本文中可互换使用，并且意味着多核苷酸的一个或多个核酸序列，其定义了给定限制性酶在所述多核苷酸上的结合位点。术语“一对限制性位点”及其语法等同短语意味着所述一对中的两个限制性位点是相同的；即所述一对中的两个限制性位点是同一限制性酶的限制性位点。当在本文中使用时，一对限制性位点的“趋异取向”意味着包含所述限制性位点的多核苷酸的切割发生在定义所述一对限制性位点的核酸序列的外侧上，并且不在所述一对之间。相反，一对限制性位点的“趋同取向”及类似的语法构建物意味着包含所述限制性位点的多核苷酸的切割发生在定义所述一对限制性位点的核酸序列的内侧。当在本文中使用时，当多核苷酸或核酸序列“两侧带有”限制性位点时，该多核苷酸或核酸序列包含5’的给定限制性位点和3’的给定限制性位点，并且在所述给定位点之间没有其他限制性位点。当在本文中使用时，在提到从克隆盒或终载体移除识别或限制性位点时，短语“移除”意味着将克隆盒连接到另一个克隆盒或终载体中产生不含所述识别或限制性位点的核苷酸残基的克隆盒或终载体。术语“遗传构建物”是指已被偶联到另一个多核苷酸分子的多核苷酸分子，通常是双链dna。在一个非限制性实例中，遗传构建物通过将第一多核苷酸分子插入到第二多核苷酸分子中，例如通过本领域中已知的限制/连接来制造。在某些实施方式中，遗传构建物包含组装在单一连续多核苷酸分子(在本文中也被称为“多基因构建物”)中的单一多核苷酸模块、至少两个多核苷酸模块或一系列多个多核苷酸模块，但不限于此。遗传构建物可以含有允许多核苷酸分子的转录和任选地所述转录本翻译成多肽的必需元件。包含在所述基因构建物中和/或被其包含的多核苷酸分子可以源自于所述宿主细胞，或者可以源自于不同的细胞或生物体，和/或可以是重组多核苷酸。一旦进入所述宿主细胞内部，所述遗传构建物可能变得整合在所述宿主染色体dna中。所述遗传构建物可能被连接到载体。当在本文中使用时，术语“转录单位”(tu)是指包含为单一rna分子编码的核苷酸的序列的多核苷酸，其包括所述单一rna分子的转录所必需的所有核苷酸序列，包括启动子、rna编码序列和终止子，但不限于此。当在本文中使用时，术语“转录单位模块”(tum)是指包含编码单一rna分子或其部分，或编码蛋白质编码序列(cds)或其部分，或编码控制该rna分子的转录的序列元件或其部分，或编码控制所述cds的翻译的序列元件或其部分的核苷酸的序列的多核苷酸。这些序列元件可以包括但不限于启动子、非翻译区(utr)、终止子、多腺苷化信号、核糖体结合位点、转录增强子和翻译增强子。当在本文中使用时，术语“多基因构建物”意味着作为包含至少两个转录单位的多核苷酸的遗传构建物。当在本文中使用时，术语“标记”意味着编码选择标记或评分标记的多核苷酸中的核酸序列。当在本文中使用时，术语“选择标记”是指当引入到细胞中时为所述细胞提供至少一种性状，允许在该性状存在或不存在的基础上对所述细胞进行选择的tu。在一个实施方式中，所述细胞在杀死不包含所述至少一种选择标记的细胞的条件下存活的基础上选择。当在本文中使用时，术语“评分标记”是指当引入到细胞中时为所述细胞提供至少一种性状，允许在该性状存在或不存在的基础上对所述细胞进行评分的tu。在一个实施方式中，包含所述tu的细胞通过从多个细胞凭表型鉴定所述细胞来评分。当在本文中使用时，术语“遗传元件”是指不是tu或不形成tu的一部分的任何多核苷酸序列。这些多核苷酸序列可以包括但不限于质粒和病毒的复制原点、着丝粒、端粒、重复序列、用于同源重组的序列、位点特异性重组序列和控制生物体之间的dna转移的序列。当在本文中使用时，术语“源载体”是指感兴趣的多核苷酸序列可以被克隆到其中的载体。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列是本文中所描述的tu、tum和/或遗传元件。在某些实施方式中，源载体选自质粒、细菌人工染色体(bac)、噬菌体人工染色体(pac)、酵母人工染色体(yac)、噬菌体、噬菌粒和粘粒。在某些实施方式中，包含感兴趣的多核苷酸序列的源载体被称为入门克隆。在某些实施方式中，所述入门克隆可用作穿梭或终载体用于接受其他多核苷酸序列。当在本文中使用时，术语“穿梭载体”是指感兴趣的多核苷酸序列可以被克隆到其中并且可以从其对它们进行操作的载体。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列是本文中所描述的tu、tum和/或遗传元件。在某些实施方式中，穿梭载体选自质粒、细菌人工染色体(bac)、噬菌体p1来源的人工染色体(pac)、酵母人工染色体(yac)、噬菌体、噬菌粒和粘粒。在某些实施方式中，包含感兴趣的多核苷酸序列的穿梭载体可用作终载体用于接受其他多核苷酸序列。当在本文中使用时，术语“终载体”是指感兴趣的多核苷酸序列可以被克隆到其中的载体。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列是本文中所描述的tu、tum和/或遗传元件。在某些实施方式中，终载体选自质粒、细菌人工染色体(bac)、噬菌体p1来源的人工染色体(pac)、酵母人工染色体(yac)、噬菌体、噬菌粒和粘粒。在某些实施方式中，包含感兴趣的多核苷酸序列的终载体是入门克隆.。在某些实施方式中，所述入门克隆可用作终载体用于接受其他多核苷酸序列。当在本文中使用时，术语“载体”是指可用于操作遗传材料，使得它可以被扩增、复制、操作、部分复制、修饰和/或表达但不限于此的任何类型的多核苷酸分子。在某些实施方式中，载体可用于将包含在该载体中的多核苷酸运输到细胞或生物体中。当在本文中使用时，术语“多核苷酸”意味着任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且作为非限制性实例包括基因的编码和非编码序列、正义和反义序列、外显子、内含子、基因组dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、sirna、mirna、trna、核酶、重组多核苷酸、分离和纯化的天然存在的dna或rna序列、合成的rna和dna序列、核酸探针、引物、片段、遗传构建物、载体和修饰的多核苷酸。对核酸、核酸分子、核苷酸序列和多核苷酸序列的指称应该被同样地理解。当在本文中使用时，术语“基因”是指遗传的生物学单元，其自我复制并位于特定染色体上的确定位置(基因座)处。在一个实施方式中，所述特定染色体是真核或细菌的染色体。术语细菌染色体在本文中可以与术语细菌基因组互换使用。当在本文中使用时，术语“基因簇”是指位于同一染色体上紧密在一起的一组基因，其产物在细胞的初级或次级代谢的特定方面发挥协调作用。当用于指称酶活性时，术语“在其中……酶有活性的条件下”及其语法变化形式意味着所述酶将执行它的预期功能，例如限制性内切酶将在适合的限制性位点处切割核酸，并且dna连接酶将两个多核苷酸共价联结在一起。术语“编码区”或“开放阅读框”(orf)是指能够在适合的调控序列控制下产生转录产物和/或多肽的基因组dna序列的正义链或cdna序列。所述编码序列通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子来识别。当插入到遗传构建物或表达盒中时，“编码序列”在被可操作连接到启动子和终止子序列和/或其他调控元件时能够被表达。“可操作连接”意味着所述待表达的序列被置于调控元件的控制之下。当在本文中使用时，“调控元件”是指控制或影响多核苷酸插入片段从载体、遗传构建物或表达盒的表达的任何核酸序列元件，并且包括启动子、转录控制序列、翻译控制序列、复制原点、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、多腺苷化信号、阻遏物和终止子。调控元件与将要从本文中所描述的遗传构建物、表达盒或载体表达的多核苷酸插入片段可以是“同源的”或“异源的”。当本文中所描述的遗传构建物、表达盒或载体存在于细胞中时，调控元件相对于细胞可以是“内源的”、“外源的”、“天然存在的”和/或“非天然存在的”。术语“非编码区”是指在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列分别也被称为5’utr和3’utr。这些区域包括转录起始和终止和翻译效率调控所需的元件。终止子是终止转录的序列，并存在于被翻译序列下游基因的3’非翻译末端中。终止子是mrna稳定性的重要决定因素，并且在某些情况下被发现具有空间调控功能。术语“启动子”是指编码区上游非转录顺式调控元件，其调控多核苷酸序列的转录。启动子包含指定转录起始位点和保守框的顺式起始元件。在一个非限制性实例中，细菌的启动子可以包含“pribnow框”(也被称为-10区)和被转录因子结合并促进转录的其他基序。启动子对于待表达的多核苷酸序列来说可以是同源或异源的。当将要在细胞中表达多核苷酸序列时，启动子可以是内源或外源启动子。正如本领域中已知的，启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或调控型启动子。当在本文中用于指称多核苷酸调控元件时，“同源的”意味着多核苷酸调控元件是本源和天然存在的多核苷酸调控元件。同源的多核苷酸调控元件可以被可操作连接到感兴趣的多核苷酸，使得所述感兴趣的多核苷酸可以从根据本发明的载体、遗传构建物或表达盒表达。当在本文中用于指称多核苷酸调控元件时，“异源的”意味着多核苷酸调控元件不是本源和天然存在的多核苷酸调控元件。异源的多核苷酸调控元件通常不伴有与它可操作连接的编码序列。异源的调控元件可以被可操作连接到感兴趣的多核苷酸，使得所述感兴趣的多核苷酸可以从根据本发明的载体、遗传构建物或表达盒表达。这些启动子可以包括正常伴有其他基因、orf或编码区的启动子，和/或从任何其他细菌、病毒、真核或哺乳动物细胞分离的启动子。多肽的“功能性片段”是所述多肽的执行该多肽的生物活性或结合所需的功能和/或提供所述多肽的三维结构的子序列。所述术语可以是指多肽、多肽的聚集体例如二聚体或其他多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其能够执行所述多肽活性的功能性多肽衍生物。当在本文中用于指称多核苷酸或多肽序列时，“分离的”描述了已从其天然细胞环境取出的序列。分离的分子可以通过本领域中已知并使用的任何方法或方法的组合来获得，包括生物化学、重组和合成技术。所述多核苷酸或多肽序列可以通过至少一个纯化步骤来制备。当在本文中用于指称细胞或宿主细胞时，“分离的”描述了已从生物体或其天然环境获得或取出，并随后维持在本领域中已知的实验室环境中的细胞或宿主细胞。所述术语涵盖了单细胞本身以及包含在细胞培养物中的细胞或宿主细胞，并且可以包括单一细胞或单一宿主细胞。术语“重组的”是指从在天然背景下在其周围的序列中取出和/或与在其天然背景中不存在的序列重新组合的多核苷酸序列。“重组的”多肽序列从“重组的”多核苷酸序列通过翻译产生。当在本文中使用时，术语“变体”是指与具体指定的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、替换或添加。变体可能是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可能来自于同一物种或来自于其他物种，并且可能涵盖同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方式中，可用于本发明的多肽的变体具有与相应的野生型分子即亲代多肽或多核苷酸相同或相似的生物活性。在某些实施方式中，本文中描述的多肽的变体具有与它们相应的野生型分子相似或基本上相似的生物活性。在某些实施方式中，所述相似是相似的活性和/或结合特异性。在某些实施方式中，本文中描述的多肽的变体具有与它们相应的野生型分子不同的生物活性。在某些实施方式中，所述差异是改变的活性和/或结合特异性。对于多核苷酸和多肽来说，术语“变体”涵盖了本文中所定义的所有形式的多核苷酸和多肽。术语“调节多核苷酸或多肽的表达”打算涵盖其中对应于根据本发明待表达的多核苷酸的基因组dna被修饰，因此导致本发明的多核苷酸或多肽的表达被调节的情况。所述基因组dna的修饰可以通过遗传转化或本领域中已知的用于诱导突变的其他方法。所述“受调节的表达”可以涉及产生的信使rna和/或多肽的量的增加或减少，并且也可以导致由产生的多核苷酸和多肽的序列的变化造成的多肽活性的提高或降低。术语“调节多核苷酸或多肽的活性”打算涵盖其中对应于根据本发明待表达的多核苷酸的基因组dna被修饰，因此导致本发明的多核苷酸的表达受调节或多肽的表达或活性受调节的情况。所述基因组dna的修饰可以通过遗传转化或本领域中已知的用于诱导突变的其他方法。所述“受调节的活性”可以涉及产生的信使rna和/或多肽的量的增加或减少，并且也可以导致由产生的多核苷酸和多肽的序列的变化造成的多肽的功能性活性的提高或降低。术语“源载体”意味着本文中所描述的pml1载体。源载体在本文中也被称为1级载体。术语“穿梭载体”意味着本文中所描述的pml2载体。穿梭载体在本文中也被称为2级载体。术语“终载体”意味着本文中所描述的pml3载体。终载体在本文中也被称为3级载体。当在本文中使用时，术语“midas盒”意味着根据本发明的载体的包含至少六个限制性酶识别位点的区域：5’-1-2-3-4-5-6-3’，其中位点1和6彼此相同，位点4和5彼此相同，并且位点1和6不同于位点4和5。在一个实施方式中，位点2和3彼此相同。在一个实施方式中，位点2和3彼此不同。在某些实施方式中，所述midas盒包含位于2与3之间或4与5之间或两者的标记(m)。当在本文中使用时，术语“b”载体意味着在根据本发明的载体中，整个midas盒具有两侧的趋同限制性位点并在其中嵌套有编码两侧带有趋异限制性位点的标记的多核苷酸。当在本文中使用时，术语“w”载体意味着在根据本发明的载体中限制性位点的配置相对于“b”载体颠倒，并且不存在编码标记的多核苷酸。在“b”和“w”载体中在midas盒两侧的限制性位点不同于在所述编码标记的多核苷酸两侧的限制性位点。当在本文中使用时，术语“载体组”意味着所述载体组中的载体被设计成一起用于克隆系统中以制造多基因构建物，其中添加到所述多基因构建物中的感兴趣的核酸序列可以被添加到已存在于多核苷酸中的核酸序列的5’或3’，并采取相对于所述添加到多基因构建物中的核酸序列的转录方向正向或反向的取向。当在本文中使用时，术语“生物合成途径“及其语法变化形式意味着一组基因，其在一起表达时提供执行从底物分子向所述途径以其命名的最终产物分子的生物化学转化所需的全套基因产物。天然存在的生物合成途径是其中在生物体内发现天然存在其全套基因的生物合成途径。人工生物合成途径也含有执行所述途径的生物化学转化所需的全套基因，但所述基因从其表达的构建物可能是人工产生的，或者所述基因本身可能是来自于不同来源的基因的镶嵌体，例如其不一起天然存在于单一生物体中，并且都提供产生所述命名的途径的生物化学转化所需的全套基因产物。例如，吲哚二萜生物合成途径可以如本文中所述使用来自于单一生物体的产生吲哚二萜所需的全套基因来构建。在某些实施方式中，可以使用本文中所描述的本发明的方法将整个途径重新构建在终载体中，用于在本文中所描述的许可宿主中表达。在某些实施方式中，所述许可宿主是真菌宿主。或者，可以遵照本文中所描述的本发明的方法，如本文中所述重新构建用于在许可宿主中表达的一部分吲哚二萜生物合成途径，以产生包含至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个、优选地五个、优选地六个或更多个待表达基因的终载体。对本文公开的数字范围(例如1至10)的引用，也打算包含对该范围内所有相关数字(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何合理的数字范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的引用，并且因此本文明确公开的所有范围的所有子范围均被明确公开。这些仅是具体打算的示例，并且在所列举的最小值和最大值之间的数值的所有可能的组合均应被认为在本申请中以类似的方式明确地陈述。详细描述构建和修改代谢途径用于在异源系统中表达，需要专业技术人员能够从基本的功能性和可重复使用的部件(包括启动子、编码序列(cds)、转录终止子、标签、3’和5’非翻译区(utr)，但不限于此)组装感兴趣的基因(即转录单位(tu))。然后专业技术人员应该能够获取所述构建的感兴趣基因并将它们组装在一起以产生功能性多基因构建物，其在被引入到所选的表达宿主中时，将产生所需的蛋白质、途径和/或产物。在异源表达的情况下，使用一套简单的设计规则快速试验基本基因部件(例如启动子、编码序列(cds)、转录终止子、标签、3’和5’非翻译区(utr)，但不限于此)的不同组合和基因(例如tu)的不同组合的能力，是用于合成生物学的任何赋能技术的高度合乎需要的特点。因此，本文中公开了一种被称为midas(模块化幂等dna组装系统)的模块化dna克隆系统，其为专业技术人员提供了用于组装基因和用于产生多基因表达构建物的新的本发明的系统和方法。midas利用限制性连接克隆(23)(即使用iis型限制性酶的dna片段的高效无缝组装)，从基本的标准化部件或模块进行多基因表达构建物的有序和层次化组装。由于这些基本的标准化部件或模块是物理储存的(在pml1载体中)，因此它们形成了随时可用的文库，可以从其组装更复杂的结构(转录单位和多基因质粒)。在本文描述的工作中，本发明人使用midas从基本的转录单位模块(tum)构建了一系列多基因质粒。在本工作中产生的最复杂的质粒(psk79)从21个不同tum组装(7个基因(在本文中也被称为“转录单位”(tu)，每个tu由三个基本模块构成)。他们显示，这种质粒在被转化到没有完整pax簇的蕈青霉(p.paxilli)菌株中时，可以重建用于雀稗灵和蕈青霉素生产的代谢途径。为midas1级(模块克隆)和2级(tu组装)描述的基本原理类似于为某些基于金门的模块化组装技术所描述的原理(24-27,29)。然而，在多基因组装阶段(midas中的3级)所述技术彼此有效地分歧。本发明人的用于多基因组装的令人吃惊的方法是基于在更早级别上使用的各种不同质粒的新的本发明的设计，其为用户提供了与其他已知的模块化组装技术不同的优点。本文中描述的载体组包含一套载体，其被设计成用于为从基本的模块化部件构建转录单位(tu)提供最大的用户控制，并提供对tu的次序和取向的全用户控制和对多基因构建物中tu的组装方向的控制。这种控制水平源自于模块化格式、iis型限制性位点的相对配置和组装的层次化本质，并提供与其他类型的基因组装方案相比不同且出人意料的优点。本说明书中描述的模块化组装系统通过提供所述多基因组装体中基因添加的双向控制(即控制每个基因相对于所述组装体中其他基因的位置)以及所述多基因组装体中每个基因的添加次序的全用户控制和所述多基因组装体中每个基因的相对取向(转录方向)的全用户控制，克服了以前描述的模块化组装技术的单向限制。midas设计概述本发明人开发了本文中描述的载体组(被称为midas系统)，以利用iis型限制性酶在单一反应中将多个dna片段无缝联结在一起的能力。通过这些用户定义的单链突出端的适合选择和每个所述dna片段两侧的iis型位点的适合取向，可以使用一锅限制-连接反应将多个片段以有序(定向)方式组装在载体中。所述载体通常含有两侧带有iis型酶的两个趋异取向的识别位点的标记(通常为用于蓝/白筛选的laczα评分标记)；这些元件被合称为“克隆盒”，在组装反应期间被插入片段代替。在一个非限制性实例中，midas利用三种iis型限制性酶aari、bsai和bsmbi，它们在切割后产生用户定义的4bp单链突出端。所述使用midas的基因和多基因构建物的组装是一种层次化过程。在第一级(midas1级)时，使用bsmbi介导的限制-连接反应将功能性模块(例如启动子、cds、转录终止子、标签、非翻译区(utr)、转录增强子)克隆到1级源载体(pml1)中，在那里它们形成可重复使用的序列验证的部件的文库。所述模块和源载体的互补设计确保在克隆到pml1中后，这些模块可以通过用bsai消化从所述载体释放。在第二级(2级)时，使用bsai介导的限制/连接反应将相容的成组序列验证的1级模块从pml1释放并组装到2级穿梭载体(pml2)中，导致产生含有真核转录单位(tu)的2级质粒。同样地，设计规则确保每个组装的tu可以从所述pml2载体释放，这次是通过用aari或bsmbi消化(取决于tu被组装在其中的pml2载体)。在3级时，使用aari或bsmbi介导的限制/连接反应，将在2级时组装的tu从pml2质粒释放并在3级终载体(pml3)中顺序组装在一起，以形成功能性多基因构建物，其然后可以被转化到所需的表达宿主中。根据本发明的midas系统的下述描述作为非限制性实例提供。读者将会认识到，可以根据在本公开中体现的本发明的概念，对如下所述的系统做出修改、改变和/或改进。本文中考虑到了这些修改、改变和/或改进，并且正如本领域技术人员认识到的，它们形成本发明的一部分。1级：模块克隆在一个实施方式中，1级功能性转录单位模块(tum)作为pcr产物产生。在另一个实施方式中，1级tum通过直接多核苷酸合成来制造。在一个实施方式中，通过bsmbi介导的限制/连接将tum克隆到1级源载体(pml1)中。为了允许通过pcr产生的tum被克隆到pml1载体中，pcr引物被设计成使得每个扩增的tum两侧带有两个趋同的bsmbi限制性位点bsmbi[ctcg]和[agac]bsmbi。在限制性酶切割后，这些趋同限制性位点产生的粘性末端与pml1源载体中存在的bsmbi位点的粘性末端相容。由直接合成产生的tum被设计和生产成两侧具有趋同的bsmbi位点bsmbi[ctcg]和[agac]bsmbi，其在限制性酶切割后产生的粘性末端与pml1源载体中存在的bsmbi位点的粘性末端相容。因此，pml1中存在的克隆盒由在两侧具有两个趋异的bsmbi位点的laczα选择标记构成：5’-[ctcg]bsmbi-laczα-bsmbi[agac]-3’(图1a)。为了能够随后进行全长tu的(2级)组装，每个tum被设计成两侧带有在5’末端处的四个模块特异性核苷酸(nnnn)和在3’末端处的四个模块特异性核苷酸(nnnn)。在某些实施方式中，所述在5’和3’末端处的四个模块特异性核苷酸被包括在通过直接合成产生的tum中，而在某些实施方式中，通过被设计为pcr引物序列的一部分，它们被包括在通过pcr产生的tum中。每个tum和pml1载体的两侧区域的互补设计确保了当使用bsmbi介导的限制/连接反应将每个tum克隆到pml1中时，每个tum变得两侧具有趋同的bsai识别位点。因此，当在随后的(即2级)bsai介导的全长tu的组装期间将所述模块从pml1释放时，所述模块特异性核苷酸(nnnn和nnnn)变成bsai特异性4bp单链突出端。在一个实施方式中，pcr产物(或合成的多核苷酸)中每个模块的总体结构采取下述形式：5’-bsmbi[ctcg]nnnn-tum-nnnntg[agac]bsmbi-3’(图1b)，其在bsmbi介导的克隆后在pml1中变成5’-bsai[nnnn]-tum-[nnnn]bsai-3’(图1c)。由于每个tum被它的两侧四核苷酸限定，因此这些模块特异性碱基有效地形成了每个tum的地址系统，并且它们确定了它在组装的tu内的位置和取向。几种相关多核苷酸组装技术moclo和goldenbraid2.0的开发者已协力工作，以为广泛种类的tum开发出用于植物表达的共同的语构或一套标准地址(在moclo系统中被称为“融合位点”并且在goldenbraid2.0中被称为“条形码”)，以促进部件的可交换能力(30)。这种标准在这里也被采纳用于在丝状真菌中表达的tu的基于midas的组装(图2)，但不限于此。因此，在一个非限制性实例中，对于丝状真菌表达来说，proutr模块(包含启动子、5’非翻译区(utr)和atg起始密码子)包含作为模块特异性5’核苷酸的ggag和作为模块特异性3’核苷酸的aatg(即5’-ggag-proutr-aatg-3’)，其中翻译起始密码子被下划线。同样地，编码序列(cds)模块两侧具有aatg和gctt(即5’-aatg-cds-gctt-3’)，而utrterm模块(由3’utr和3’非转录区、包括多腺苷化信号构成)具有5’-gctt-utrterm-cgct-3’的形式。用于扩增这三种类型的tum的pcr引物的设计考虑因素示出在表5中。在pml1中tum的bsmbi介导的组装后，将反应转化到大肠杆菌菌株例如dh5α(或等同物)中并铺于增补有50μg/ml壮观霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。带有克隆的tum的质粒通过筛选白色菌落来鉴定并通过测序确认。在midas1级时，重要的是将所有内部aari、bsai和bsmbi识别位点屏蔽或从tum消除。被称为“驯化”的屏蔽或消除这些位点的过程可以通过下述方法实现：(i)在从基因合成公式订购所述序列时排除这些位点，(ii)定向突变，或(iii)使用与靶dna形成三链体的屏蔽寡核苷酸，从而阻止限制性酶切割(26)。以以前将iis型酶用于突变(31)和金门驯化目的(23,32)相同的方式，使用与内部iis型限制性位点交叠并含有破坏所述位点的单核苷酸错配的引物(被称为驯化引物)，通过pcr制备驯化了midas模块。由于所述pcr产物被设计用于在midas中使用bsmbi介导的金门反应组装在一起以在pml1中形成全长驯化tum，因此重要的是所述midas驯化引物被设计成具有在5’末端处产生相容的单链突出端的bsmbi限制性位点。2级：tu组装在2级时，使用bsai介导的限制/连接反应将相容的成组的克隆和序列验证的1级tum在pml2穿梭载体中组装，导致产生含有完整的(即全长)转录单位(tu)的2级质粒(pml2入门克隆)。在一个实施方式中，所述克隆和测序的1级tum选自proutr、cds和utrterm模块及其组合。本文中描述的模块地址标准确保tu的组装以有序、定向的方式进行，其中一个模块的3’末端与下一个模块的5’末端相容。位于proutr模块的5’末端处的模块特异性碱基ggag和位于utrterm模块的3’末端处的cgct，与由pml2穿梭载体的bsai消化产生的单链突出端相容，因此这些碱基定义了2级组装的最外侧的克隆边界。在midas的一个实施方式中，存在八种可以在其中组装tu的2级(pml2)穿梭载体，其选择取决于(i)tu组装的所需次序，(ii)tu被添加到多基因构建物的所需方向，和(iii)在3级时产生的多基因构建物中所需的tu取向。在一个实施方式中，所述八种pml2载体彼此的差异在于作为midas运行的中心的特定核酸序列零件的排列。这些被合称为midas盒的核酸序列零件(图3)定义了tu的2级组装并控制了在3级时产生的多基因构建物的组装。在某些实施方式中，每种pml2载体包含由下述特点所定义的midas盒：(i)具有两侧带有趋异的iis型限制性位点、优选为bsai识别位点的克隆盒，(ii)至少两种其他iis型限制性酶、优选为aari和bsmbi的限制性位点的不同排列，和(iii)laczα选择标记的存在或不存在。在一个实施方式中，所有八种pml2载体中的克隆盒包含可操作连接到大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶启动子的突变体大肠杆菌phes选择标记，它们在两侧具有趋异的bsai识别位点。在一个实施方式中，作为选择标记的所述突变体大肠杆菌phes基因是thr251ala/ala294gly双重突变体。这种双重突变体为在增补有苯丙氨酸类似物4-氯-苯丙氨酸4cp的lb培养基上生长的细胞提供了高致死率(33)。在tu的bsai介导的2级组装期间，所述突变体phes基因从所述pml2载体中消除。在一个实施方式中，所述突变体phes是负选择标记。在一个实施方式中，所述八种pml2载体包含四种“b”载体和四种“w”载体。载体被称为“b”还是“w”分别取决于在midas盒中存在还是不存在选择标记，优选为laczα选择标记(参见图3)。本文中描述了四种“b”pml2载体(由质粒名称中的“b”指示)和四种“w”pml2载体(由质粒名称中的“w”指示)。所述“b”和“w”载体的区别还在于它们的midas盒中aari和bsmbi限制性位点的相对配置。“b”载体包含两侧带有趋同的bsmbi位点的midas盒，并且在所述bsmbi位点之间还包含嵌套的laczα选择标记，所述laczα选择标记两侧带有趋异的aari位点。“w”载体包含两侧带有趋同的aari位点的midas盒，并且还包含两组嵌套的趋异的bsmbi位点。在“w”载体中不存在laczα选择标记。所述laczα选择标记不在tu的2级组装期间用于蓝/白筛选，而是保留以在3级时使用。然而，“b”或“w”载体的选择决定了在3级时tu被添加到基因构建物的次序，并因此必须在tu的2级组装期间做出。同样地，iis型限制性位点、优选为aari和bsmbi位点，不被用于tu的2级组装；相反，这些位点在基因构建物的3级组装期间使用。这些考虑因素在下文3级的描述下进一步讨论。每个tu的取向(转录方向)可以通过将每个tu组装在pml2“正向”载体(由质粒名称中的“f”指示)或pml2“反向”载体(由质粒名称中的“r”指示)中自由地决定。所述pml2“反向”载体的iis型限制性位点、优选为bsai识别位点，相对于pml2“正向”载体中的bsai融合位点对调。因此，pml2“正向”载体的基于phes的克隆盒取向为(使得phes的转录方向与pml2质粒中kanr基因的转录方向相同)，而pml2“反向”载体的bsai识别位点对调：(使得phes的转录方向与pml2质粒中kanr基因的转录方向相反)，其中箭头指示突变体phes选择标记的转录方向。与克隆的1级模块相反，当将用组装反应转化的大肠杆菌dh5α细胞(或等同物)铺于增补有75μg/ml卡那霉素和1.25mm4cp的lb平板上时，所述pml2穿梭载体提供了抗生素卡那霉素抗性，允许针对1级模块骨架进行高效反选择，而突变体phes选择标记提供了针对任何亲代pml2穿梭质粒的强有力的负选择。专业技术人员认识到，与突变体phes和kanr标记不同的任何适合的选择标记可用于pml2穿梭载体中。为简单起见，本文中提供的midas的描述聚焦于从基本的功能性转录单位模块(tum)例如启动子、cds和终止子组装转录单位(tu)。然而，在某些情况下，例如在人们对试验不同启动子和/或终止子组合对基因表达的影响不感兴趣的情况下，人们可能不希望从各个tum组装tu。例如，某些研究人员可能希望使用已为在它们的表达宿主中的使用充分表征的、即具有充分表征的启动子、cds和终止子的抗性标记盒(rc)。在这些情况下，可以使用含有midas系统的最外侧模块特异性碱基的引物将全长tu扩增为完整单位以备克隆到pml1中(即所述pcr产物具有下述形式：5’-bsmbi[ctcg]ggag-proutr-cds-utrterm-cgcttg[agac]bsmbi-3’)(cgcttgagac＝seqidno：1)。或者，可以通过直接合成将所述全长tu制造为完整单位以备克隆到pml1中(即所述直接合成产物具有下述形式：5’-bsmbi[ctcg]ggag-proutr-cds-utrterm-cgcttg[agac]bsmbi-3’)[seqidno：1]。通过同样的方式，可以将midas应用于不形成tu的基础的遗传元件(ge)的克隆和组装。在某些实施方式中，ge可以包括用于质粒繁殖的复制原点(例如酵母2μ复制原点)、用于植物细胞的土壤杆菌介导的转化的t-dna左侧和右侧边界和用于所需表达宿主中重组介导的基因置换的同源臂，但不限于此。与在上述抗性盒的实例中相同，感兴趣的ge可以使用含有midas系统的最外侧模块特异性碱基的引物作为完整单位来扩增或通过直接合成来制造，即具有下述形式的pcr或直接合成产物：5’-bsmbi[ctcg]ggag-ge-cgcttg[agac]bsmbi-3’[seqidno：1]。在上述两种情况下，在rc或ge被克隆到pml1载体中后，可以如本文中所述通过bsai介导的限制-连接组装，将所述rc或ge移动到2级载体中。3级：多基因构建物的组装在midas3级时，将包含在本文中所描述的pml2质粒中的tu和ge通过二元组装顺序插入到3级终载体(pml3)中以形成多基因构建物。在3级时多基因构建物的组装利用了位于“b”和“w”pml2载体中的midas盒中aari和bsmbi限制性位点的本发明的相对配置。不希望受到理论限制，本发明人相信这些限制性位点在“w”载体中与“b”载体相比的嵌套和颠倒配置，定义了所述midas多基因组装过程的至少某些新颖的发明性特点。在所述“b”载体的一个非限制性实施方式中，整个midas盒具有两侧的趋同的bsmbi位点，并且在其中嵌套了两侧带有趋异的aari位点的laczα基因。在所述“w”载体的一个非限制性实施方式中，所述酶的配置是颠倒的(整个midas盒具有两侧的趋同的aari位点并且在其中嵌套有两个趋异的bsmbi位点)，并且不存在laczα基因。正如在图4中所示，限制性位点在“b”和“w”载体中的嵌套和颠倒意味着在“w”midas盒中组装的tu(或ge)可以使用aari介导的限制/连接反应插入到“b”midas盒中，相反，在“b”midas盒中组装的tu(或ge)可以使用bsmbi介导的限制/连接反应克隆到“w”midas盒中。这种克隆循环(即在“w”与“b”pml2入门克隆之间交替)可以无限重复。专业技术人员认识到，其他iis型限制性酶识别位点可以按照本发明使用。本文中具体设想了这些其他iis型限制性酶识别位点的使用。在3级终载体pml3中存在的克隆盒由两侧带有趋异的aari位点的laczα基因构成：[catt]aari-laczα-aari[cgta]，因此所述midas3级组装使用pml3与已被组装在pml2“w”穿梭载体中的tu(或ge)之间的aari介导的限制/连接反应来启动(即添加第一tu或ge)(图4)。然后将产生的质粒与克隆到pml2“b”穿梭载体中tu一起用于bsmbi介导的限制/连接反应。遵照这种方法，通过分别在aari和bsmbi介导的限制/连接反应之间轮流使用pml2“w”和pml2“b”入门克隆来添加另外的tu。因此，通过将tu克隆到所述多基因构建物中产生的每个质粒变成了用于下一轮tu添加的终载体(图4)。在其最简单的配置中，midas可以使用仅仅两个pml2穿梭载体来实现多基因组装：一个“w”载体和一个“b”载体(图5a)。然而，全套八种pml2穿梭载体的使用能够实现对下述特点的最大用户控制：(i)每个tu被添加到所述生长中的多基因构建物的次序，(ii)每个tu的所需取向(也就是说转录方向)，和(iii)组装的极性，即输入的tu被装载在所述多基因构建物中的方向。首先并且如较早时所述，每个tu向所述生长中的多基因构建物添加的次序，由tu被组装在其中的“w”或“b”pml2穿梭载体的选择来控制。其次并且如以前在讨论2级特点时所述，tu的取向(转录方向)可以通过所述tu在其中组装的“正向”或“反向”pml2载体的选择自由地确定。将midas扩展到包括以任一取向组装tu的选项，将载体套装扩展到四种pml2质粒(参见图3和图5b)。第三，多基因组装的极性(即新的tu被添加到所述生长中的多基因组装体的方向)也可以被自由地确定，在这种情况下通过将tu组装在具有“正”(+)或“负”(-)极性的pml2穿梭载体中(图3)。将pml2(+)入门克隆用于3级组装确保了下一个添加的tu(或ge)将以与pml3中存在的specr基因的转录方向相同的方向添加，即在所述多基因构建物中下一个组装的tu(或ge)将被添加到使用pml2(+)入门克隆添加的tu(或ge)的右侧(如图5a和图5b中所示)。相反，将pml2(-)入门克隆用于3级组装迫使下一个tu(或ge)以与pml3中存在的specr基因的转录方向相反的方向添加，使得装载到所述多基因构建物中的下一个tu(或ge))将被添加到使用pml2(-)入门克隆添加的tu(或ge)的左侧。在这两种情况下(即唯一地使用(+)或(-)入门克隆)，在3级时多基因构建物的组装限于单向。然而，如果使用两种极性的入门克隆(即pml2(+)和pml2(-)两者)来建造所述多基因构建物，则midas具有控制新的tu(或ge)被添加到所述3级组装体的方向的能力(图5c))，并且3级时的多基因组装可以是双向的。这种特点在其中有益的实例包括测试旨在通过同源重组整合到表达宿主的染色体中的tu的表达，或通过土壤杆菌介导的转化评估tu在植物中的表达，但不限于此。在两种情况下，待表达的tu需要被放置在两侧的ge之间，所述ge在同源重组的情况下是左侧和右侧同源臂，或者在植物表达实例的情况下是t-dna的左侧和右侧边界。这可以使用midas，通过确保这些ge从相反极性的pml2载体装载到所述多基因构建物中容易地实现——一个ge使用pml2(+)入门克隆添加，另一个使用pml2(-)入门克隆添加。这有效地将pml3转变成适合于同源重组的载体(或在先期组装复制原点以确保质粒在土壤杆菌中繁殖之后，转变成适合于土壤杆菌介导的植物转化的载体)，同时保持所述多基因组装体开放用于添加感兴趣的tu。剩下的就是将每种感兴趣的tu顺序装载到所述载体中，在那里它们变得位于所述同源臂(或t-dna边界)之间。这种策略具有附加的灵活性，允许添加在所述同源臂(或t-dna边界)之间的第一个tu(和所有随后的tu)在每一轮tu添加到所述多基因构建物中之后进行表达的测定。本文中描述了使用大肠杆菌作为克隆宿主进行的midas克隆。然而，所述midas平台不限于此。相反，所述midas平台被设计成允许并入允许在所选的任何异源宿主中建立生物合成途径的遗传元件(ge)。作为非限制性实例，将酵母2μ复制原点并入到pml3中将允许所述多基因质粒在基于酵母的表达系统中游离体复制。在另一个非限制性实例中，为确保质粒在土壤杆菌中繁殖而并入t-dna左侧和右侧边界和复制原点，将允许使用植物组织的土壤杆菌介导的转化，而sv40复制原点的并入将允许在带有sv40大t抗原的哺乳动物细胞系中表达。因此，本发明的第一方面涉及一种载体组，其包含至少两种穿梭载体v1和v2，其中v1选自v1.1(+)＝5’-a1b1m1b2c1c2a2-3’，v1.2(-)＝5’-a1c1c2b1m1b2a2-3’，v1.3(+)＝5’-a1b2m1b1c1c2a2-3’，和v1.4(-)＝5’-a1c1c2b2m1b1a2-3’，并且v2选自v2.1(+)＝5’-c1b1m1b2a1m2a2c2-3’，v2.2(-)＝5’-c1a1m2a2b1m1b2c2-3’，v2.3(+)＝5’-c1b2m1b1a1m2a2c2-3’，和v2.4(-)＝5’-c1a1m2a2b2m1b1c2-3’，其中m1是第一标记，m2是第二标记，并且a1、a2、b1、b2、c1和c2是限制性酶识别位点，其中至少a1、a2、c1和c2是iis型限制性酶的识别位点，其中a1、b1和c1是全都不同的识别位点，并且其中a1＝a2、c1＝c2并且b1＝b2或b1≠b2。在一个实施方式中，当v1是v1.1(+)或v1.3(+)时，v2是v2.2(-)或v2.4(-)。在一个实施方式中，当v1是v1.2(-)或v1.4(-)，v2是v2.1(+)或v2.3(+)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述至少两种穿梭载体构成。在一个实施方式中，a1、a2、b1、b2、c1和c2包含至少四种、优选地至少六种iis型限制性位点。在一个实施方式中，所述iis型限制性位点选自bsai、aari、bsmbi、acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、btsi、btsimuti、cspci、eari、ecii、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboii、mlyi、mmei、mnli、nmeaiii、plei、sapi、sfani位点。在一个实施方式中，a1和a2是aari限制性位点。在一个实施方式中，b1和b2是bsai限制性位点。在一个实施方式中，c1和c2是bsmbi限制性位点。在一个实施方式中，所述载体组还包含源载体。在一个实施方式中，所述载体组还包含终载体。在一个实施方式中，所述终载体包含与a1和a2或与c1和c2相同的一对限制性位点。在一个实施方式中，所述终载体包含侧翼带有所述一对限制性位点的标记(dm)。优选地，dm与所述v2穿梭载体中的m2相同。在一个实施方式中，所述终载体不包含dm。在一个实施方式中，所述载体组包含至少四种、优选地至少五种、优选地至少六种、优选地至少七种、优选地八种不同的穿梭载体。在一个实施方式中，所述载体组基本上由至少四种、优选地至少五种、优选地至少六种、优选地至少七种、优选地八种不同的穿梭载体构成。在一个实施方式中，所述载体组包含如下的至少四种穿梭载体：(a)至少两种v1载体和至少两种v2载体，(b)至少一种v1载体和至少三种v2载体，或(c)至少三种v1载体和至少一种v2载体，其中(a)、(b)和(c)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体，优选地包含如下的至少五种穿梭载体：(d)至少两种v1载体和至少三种v2载体，(e)至少三种v1载体和至少两种v2载体，(f)四种v1载体和至少一种v2载体，或(g)至少一种v1载体和四种v2载体，其中(d)、(e)、(f)和(g)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含如下的至少六种穿梭载体：(h)至少三种v1载体和至少三种v2载体，(i)四种v1载体和至少两种v2载体，(j)至少两种v1载体和四种v2载体，其中(i)和(j)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含如下的至少七种穿梭载体：(k)至少三种v1载体和四种v2载体，(l)四种v1载体和至少三种v2载体。在一个实施方式中，所述载体组包含v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)构成。在一个实施方式中，所述穿梭载体是选自质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、福斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体和噬菌体人工染色体的载体。在一个实施方式中，所述穿梭载体是质粒。在一个实施方式中，m1是评分标记或选择标记。优选地，m1是选择标记。在一个实施方式中，所述选择标记是编码抗生素抗性的多核苷酸。在一个实施方式中，所述抗生素抗性是对选自卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、萘啶酮酸、两性霉素b、红霉素、庆大霉素、新霉素、制霉菌素的抗生素的抗性。在一个实施方式中，所述选择标记是编码为含有所述标记的细胞或生物体提供致死性的肽的基因，例如当编码所述肽的基因被转化到适合的细胞中时，或当所述细胞或生物体在适合的条件下生长时。在一个实施方式中，所述标记选自ccdb、phes、rpsl、sacb。在一个实施方式中，所述标记是突变的大肠杆菌phes选择标记，其可操作连接到启动子，优选为大肠杆菌启动子，优选为大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶启动子。在一个实施方式中，所述突变的大肠杆菌phes选择标记是thr251ala/ala294gly双重突变体。在一个实施方式中，m2编码选择标记或评分标记。在一个实施方式中，所述评分标记是选自gfp、egfp、yfp、dsred、dsred2、mcherry的荧光标记，或者是生物发光标记例如萤光素酶，或者是选自编码lacz、β-葡萄糖醛酸酶或β-葡萄糖苷酶的基因或编码crte、crtb、crti、crty和crtw(被合称为cred)的成套基因或编码萘加双氧酶的基因的产色标记。优选地，所述标记是产色标记，优选为lacz标记。在一个实施方式中，v1.1(+)是包含seqidno：122的pml2(+)wf。在一个实施方式中，pml2(+)wf基本上由seqidno：122构成。在一个实施方式中，v1.2(-)是包含seqidno：123的pml2(-)wr。在一个实施方式中，pml2(-)wr基本上由seqidno：123构成。在一个实施方式中，v1.3(+)是包含seqidno：124的pml2(+)wr。在一个实施方式中，pml2(+)wr基本上由seqidno：124构成。在一个实施方式中，v1.4(-)是包含seqidno：125的pml2(-)wf。在一个实施方式中，pml2(-)wf基本上由seqidno：125构成。在一个实施方式中，v2.1(+)是包含seqidno：126的pml2(+)bf。在一个实施方式中，pml2(+)bf基本上由seqidno：126构成。在一个实施方式中，v2.2(-)是包含seqidno：127的pml2(-)br。在一个实施方式中，pml2(-)br基本上由seqidno：127构成。在一个实施方式中，v2.3(+)是包含seqidno：128的pml2(+)br。在一个实施方式中，pml2(+)br基本上由seqidno：128构成。在一个实施方式中，v2.4(-)是包含seqidno：129的pml2(-)bf。在一个实施方式中，pml2(-)bf基本上由seqidno：129构成。在一个实施方式中，a1和a2在v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)和v1.4(-)中相对于彼此采取趋同取向。在一个实施方式中，a1和a2在v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)中相对于彼此采取趋异取向。在一个实施方式中，c1和c2在v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)和v1.4(-)中相对于彼此采取趋异取向。在一个实施方式中，c1和c2在v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)中相对于彼此采取趋同取向。在一个实施方式中，所述载体组中的载体是克隆系统中的组分。在一个实施方式中，所述克隆系统可用于制造包含至少一个转录单位(tu)的基因构建物。在一个实施方式中，所述载体组包含克隆系统的一部分。在一个实施方式中，所述克隆系统可用于制造包含至少一个tu的基因构建物。在一个实施方式中，v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)或v2.4(-)，或其包含至少两种载体的组合，一种是v1载体并且另一种是v2载体，其中至少一种载体是(+)载体并且另一种载体是(-)载体，是克隆系统中的组分。在一个实施方式中，所述克隆系统可用于制造包含至少一个tu的基因构建物。在一个实施方式中，所述基因构建物是包含至少两个tu的多基因构建物。在一个实施方式中，所述多基因构建物包含至少三个、优选地至少四个、优选地至少五个、优选地至少六个、优选地至少七个、优选地至少八个、优选地至少九个、优选地至少十个tu。在一个实施方式中，所述多基因构建物包含来自于生物合成途径的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个、优选地五个、优选地六个、优选地七个、优选地八个、优选地九个、优选地至少十个tu，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述多基因构建物包含完整的生物合成途径，基本上由其构成或由其构成。在一个实施方式中，所述生物合成途径是微生物的、优选为真菌的生物合成途径。在一个实施方式中，所述生物合成途径是吲哚二萜生物合成途径。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径包含雀稗灵的生产所需的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个基因，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述雀稗灵的生产所需的基因包含paxg、paxm、paxb和paxc中的至少一者，优选地paxg、paxm、paxb和paxc中的至少两者、优选地至少三者、优选地所有四者。优选地，所述雀稗灵的生产所需的基因来自于青霉属物种，优选为蕈青霉(p.paxilli)。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径包含蕈青霉素的生产所需的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个、优选地五个、优选地六个基因，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述蕈青霉素的生产所需的基因包含paxg、paxm、paxb、paxc、paxq和paxp中的至少一者，优选地paxg、paxm、paxb、paxc、paxq和paxp中的至少两者、优选地至少三者、优选地至少四者、优选地至少五者、优选地所有六者。优选地，所述蕈青霉素的生产所需的基因来自于青霉属物种，优选为蕈青霉(p.paxilli)。在一个实施方式中，所述生物合成途径是天然存在的生物合成途径。在一个实施方式中，所述生物合成途径是人造的生物合成途径。在一个实施方式中，所述基因构建物和/或多基因构建物通过将tu从穿梭载体克隆到所述终载体中来制造。在一个实施方式中，所述tu通过克隆到与穿梭载体上的一对限制性位点相同的一对限制性位点中，被添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述tu以相对于所述终载体中存在的另一个转录单位的两个方向中的任一方向添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述tu在所述终载体中已存在的另一个转录单位的5’位置中添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述tu在所述终载体中已存在的另一个转录单位的3’位置中添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述tu以5’至3’或3’至5’取向添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述载体组包含至少一种终载体，所述终载体包含包括两侧的限制性位点的标记，其中所述两侧的限制性位点与所述至少两种穿梭载体上的第一(a1、a2)或第三(c1、c2)对限制性位点中的一对相同。在一个实施方式中，所述两侧的限制性位点与a1和a2相同。优选地，a1和a2是一对iis型限制性位点。优选地，a1和a2是aari或bsmbi限制性位点。优选地，b1和b2是iis型限制性位点。优选地c1和c2是iis型限制性位点。优选地a1、a2、b1和b2，优选地a1、a2、c1和c2，优选地b1、b2、c1和c2，优选地a1、a2、b1、b2、c1和c2是iis型限制性位点。优选地，所述iis型限制性位点选自bsai、aari、bsmbi、acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、btsi、btsimuti、cspci、eari、ecii、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboii、mlyi、mmei、mnli、nmeaiii、plei、sapi、sfani位点。在一个实施方式中，所述载体组包含至少一种源载体，其包含编码至少一个两侧具有两个趋异限制性位点的标记的多核苷酸序列。优选地，所述趋异限制性位点是iis型限制性位点。优选地，所述iis型限制性位点选自bsai、aari、bsmbi、acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、btsi、btsimuti、cspci、eari、ecii、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboii、mlyi、mmei、mnli、nmeaiii、plei、sapi、sfani位点。优选地，所述iis型限制性位点是bsmbi位点。在一个实施方式中，所述至少一种终载体或至少一种源载体或两者中的标记是选择标记或评分标记。在一个实施方式中，所述标记是选择标记。在一个实施方式中，所述选择标记是编码抗生素抗性的多核苷酸。在一个实施方式中，所述抗生素抗性是对选自卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、萘啶酮酸、两性霉素b、红霉素、庆大霉素、新霉素和制霉菌素的抗生素的抗性。在一个实施方式中，所述选择标记是编码为含有所述标记的细胞或生物体提供致死性的肽的基因，例如当编码所述肽的基因被转化到适合的细胞中时，或当所述细胞或生物体在适合的条件下生长时。在一个实施方式中，所述标记选自ccdb、phes、rpsl、sacb。在一个实施方式中，所述标记是突变的大肠杆菌phes选择标记，其可操作连接到启动子，优选为大肠杆菌启动子，优选为大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶启动子。在一个实施方式中，所述突变的大肠杆菌phes选择标记是thr251ala/ala294gly双重突变体。在一个实施方式中，所述标记是评分标记。在一个实施方式中，所述评分标记是选自gfp、egfp、yfp、dsred、dsred2、mcherry的荧光标记，或者是生物发光标记例如萤光素酶，或者是选自编码lacz、β-葡萄糖醛酸酶或β-葡萄糖苷酶的基因或编码crte、crtb、crti、crty和crtw(被合称为cred)的成套基因或编码萘加双氧酶的基因的产色标记。优选地，所述标记是产色标记，优选为lacz标记。另一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少三种穿梭载体，其中所述三种载体中的至少两种是选自下述的v1载体：v1.1(+)＝5’-a1b1m1b2c1c2a2-3’，v1.2(-)＝5’-a1c1c2b1m1b2a2-3’，v1.3(+)＝5’-a1b2m1b1c1c2a2-3’，和v1.4(-)＝5’-a1c1c2b2m1b1a2-3’，其中所述v1载体中的至少一者是(+)载体并且另一个v1载体是(-)载体，并且其中所述三种载体中的至少一种是选自下述的v2载体：v2.1(+)＝5’-c1b1m1b2a1m2a2c2-3’，v2.2(-)＝5’-c1a1m2a2b1m1b2c2-3’，v2.3(+)＝5’-c1b2m1b1a1m2a2c2-3’，和v2.4(-)＝5’-c1a1m2a2b2m1b1c2-3’，其中m1是第一标记，m2是第二标记，并且a1、a2、b1、b2、c1和c2是限制性酶识别位点，其中至少a1、a2、c1和c2是iis型限制性酶的识别位点，其中a1、b1和c1是全都不同的限制性位点，并且其中a1＝a2，c1＝c2，并且b1＝b2或b1≠b2。在一个实施方式中，当所述v1载体是v1.1(+)和v1.2(-)，或v1.1(+)和v1.4(-)，或v1.2(-)和v1.3(+)，或v1.3(+)和v1.4(-)时，则所述v2载体选自v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)。在一个实施方式中，当所述至少两种v1载体是v1.1(+)和v1.3(+)时，则v2是v2.2(-)或v2.4(-)。在一个实施方式中，当所述至少两种v1载体是v1.2(-)和v1.4(-)时，则v2是v2.1(+)或v2.3(+)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述至少三种载体构成。对于本发明的这一方面来说，具体设想了如上文中为本发明的第一方面所述的涉及限制性位点a1、a2、b1、b2、c1和c2、源载体、穿梭载体、终载体和标记包括m1和m2的本发明的各种不同实施方式。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组包含在本文中为本发明的第一方面所述的各种不同组合(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中阐述的至少四种穿梭载体、至少五种穿梭载体、至少六种穿梭载体或至少七种穿梭载体，或基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述载体组包含v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)分别是pml2(+)wf、pml2(-)wr、pml2(+)wr、pml2(-)wf、pml2(+)bf、pml2(-)br、pml2(+)br和pml2(-)bf，其分别包含为本文中描述的本发明的第一方面所定义的seqidno：122、123、124、125、126、127、128和129，或基本上由其构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，a1、a2、c1和c2相对于彼此采取趋异或趋同取向，如本文中根据本发明的第一方面为v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组中的载体是克隆系统中的组分，或包含可用于制造基因和/或多基因构建物的克隆系统的一部分，正如为本发明的第一方面所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，基因构建物和/或多基因构建物如本文中为本发明的第一方面所述。此外，在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，如本文中为本发明的第一方面所述来制造基因构建物和/或多基因构建物，并将tu或多个tu添加到所述终载体中。另一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少三种穿梭载体，其中所述三种载体中的至少一种是选自下述的v1载体：v1.1(+)＝5’-a1b1m1b2c1c2a2-3’，v1.2(-)＝5’-a1c1c2b1m1b2a2-3’，v1.3(+)＝5’-a1b2m1b1c1c2a2-3’，和v1.4(-)＝5’-a1c1c2b2m1b1a2-3’，并且所述三种载体中的至少两种是选自下述的v2载体：v2.1(+)＝5’-c1b1m1b2a1m2a2c2-3’，v2.2(-)＝5’-c1a1m2a2b1m1b2c2-3’，v2.3(+)＝5’-c1b2m1b1a1m2a2c2-3’，和v2.4(-)＝5’-c1a1m2a2b2m1b1c2-3’，其中所述v2载体中的至少一者是(+)载体并且另一个v2载体是(-)载体，其中m1是第一标记，m2是第二标记，并且a1、a2、b1、b2、c1和c2是限制性酶识别位点，其中至少a1、a2、c1和c2是iis型限制性酶的识别位点，其中a1、b1和c1是全都不同的限制性位点，并且其中a1＝a2，c1＝c2，并且b1＝b2或b1≠b2。在一个实施方式中，当所述v2载体是v2.1(+)和v2.2(-)，或v2.1(+)和v2.4(-)，或v2.2(-)和v2.3(+)，或v2.3(+)和v2.4(-)时，则所述v1载体选自v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)和v1.4(-)。在一个实施方式中，当所述至少两种v2载体是v2.1(+)或v2.3(+)时，则v1是v1.2(-)或v1.4(-)。在一个实施方式中，当所述至少两种v2载体是v2.2(-)或v2.4(-)时，则v1是v1.1(+)或v1.3(+)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述至少三种载体构成。对于本发明的这一方面来说，具体设想了如上文中为本发明的第一方面所述的涉及限制性位点a1、a2、b1、b2、c1和c2、源载体、穿梭载体、终载体和标记包括m1和m2的本发明的各种不同实施方式。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组包含在本文中为本发明的第一方面所述的各种不同组合(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中阐述的至少四种穿梭载体、至少五种穿梭载体、至少六种穿梭载体或至少七种穿梭载体，或基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述载体组包含v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)。在一个实施方式中，所述载体组基本上由v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)分别是pml2(+)wf、pml2(-)wr、pml2(+)wr、pml2(-)wf、pml2(+)bf、pml2(-)br、pml2(+)br和pml2(-)bf，其分别包含为本文中描述的本发明的第一方面所定义的seqidno：122、123、124、125、126、127、128和129，或基本上由其构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，a1、a2、c1和c2相对于彼此采取趋异或趋同取向，如本文中根据本发明的第一方面为v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组中的载体是克隆系统中的组分，或包含可用于制造基因和/或多基因构建物的克隆系统的一部分，正如为本发明的第一方面所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，基因构建物和/或多基因构建物如本文中为本发明的第一方面所述。此外，在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，如本文中为本发明的第一方面所述来制造基因构建物和/或多基因构建物，并将tu或多个tu添加到所述终载体中。另一方面，本发明涉及一种载体组，其包含至少两种穿梭载体，其中每种穿梭载体包含第一标记(m1)和至少六个限制性位点，其中所述限制性位点中的至少四个是iis型限制性位点，其中在至少一个第一穿梭载体中，第一组四个限制性位点位于m1的3’或5’，所述四者中的至少三者是iis型限制性位点，并且第二组两个限制性位点位于m1的3’或5’，所述两者中的至少一者是iis型限制性位点，并且其中在至少一个第二穿梭载体中，第一组四个限制性位点位于m1的3’或5’，所述四者中的至少三者是iis型限制性位点，并且第二组两个限制性位点位于m1的5’或3’，所述两者中的至少一者是iis型限制性位点，其中所述至少一个第二穿梭载体包含至少一个两侧带有两个iis型限制性位点的第二标记(m2)，并且其中当在所述至少一个第一或第二载体中所述第一组四个限制性位点位于m1的3’时，所述第二组两个限制性位点位于m1的5’，并且所述载体是(+)载体，并且当在所述至少一个第一或第二载体中所述第一组四个限制性位点位于m1的5’时，所述第二组两个限制性位点位于m1的3’，并且所述载体是(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含至少三种穿梭载体其中至少两种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少一种穿梭载体是第二穿梭载体，或者其中至少一种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少两种穿梭载体是第二穿梭载体，其中所述三种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含至少四种穿梭载体其中至少两种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少两种穿梭载体是第二穿梭载体，其中所述四种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体，优选地至少两种(+)载体和至少两种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含至少五种穿梭载体其中至少两种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少三种穿梭载体是第二穿梭载体，或者其中至少三种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少两种穿梭载体是第二穿梭载体，或者其中所述五种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体，优选地至少两种(+)载体和至少两种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含至少六种穿梭载体其中至少三种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少三种穿梭载体是第二穿梭载体，其中所述六种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体，优选地至少两种(+)载体和至少两种(-)载体，优选地至少三种(+)载体和至少三种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含至少七种穿梭载体，其中至少三种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少三种穿梭载体是第二穿梭载体，或者其中四种穿梭载体是第一穿梭载体，并且至少三种穿梭载体是第二穿梭载体，其中所述七种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体，优选地至少两种(+)载体和至少两种(-)载体，优选地至少三种(+)载体和至少三种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组包含八种穿梭载体，其包含四种第一穿梭载体和四种第二穿梭载体，其中所述八种穿梭载体包含至少一种(+)载体和至少一种(-)载体，优选地至少两种(+)载体和至少两种(-)载体，优选地至少三种(+)载体和至少三种(-)载体，优选地四种(+)载体和四种(-)载体。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述八种穿梭载体构成。对于本发明的这一方面来说，具体设想了如上文中为本发明的第一方面所述的涉及限制性位点、源载体、穿梭载体、终载体和标记包括m1和m2的本发明的各种不同实施方式。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组中的第一和第二载体是克隆系统中的组分，或包含可用于制造基因和/或多基因构建物的克隆系统的一部分，正如为本发明的第一方面所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，基因构建物和/或多基因构建物如本文中为本发明的第一方面所述。此外，在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，如本文中为本发明的第一方面所述来制造基因构建物和/或多基因构建物，并将tu或多个tu添加到所述终载体中。另一方面，本发明涉及一组八个穿梭载体，每个穿梭载体包含第一标记(m1)和六个限制性位点,其中每个穿梭载体包含位于m1的一侧上的第一组四个限制性位点和位于m1的另一侧上的第二组两个限制性位点，其中所述第一组限制性位点中的至少两个彼此相同，所述第二组中的两个限制性位点彼此不同，所述第二组中两个限制性位点中的至少一者与所述第一组的限制性位点中的一者相同，并且其中所述穿梭载体中的四者包含第二标记(m2)，其中所述载体中的四者是在m1的3’包含所述第一组限制性位点的(+)载体，并且所述载体中的四者是在m1的5’包含所述第一组限制性位点的(-)载体。在一个实施方式中，m1或m2或两者是如本文中为本发明的任何其他方面所述的选择或评分标记。在一个实施方式中，m2位于第一组限制性位点之内，优选地位于一对限制性位点之间，优选地两侧带有所述一对限制性位点。在一个实施方式中，所述一对限制性位点是一对iis型限制性位点。优选地所述一对iis型限制性位点选自bsai、aari、bsmbi、acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、btsi、btsimuti、cspci、eari、ecii、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboii、mlyi、mmei、mnli、nmeaiii、plei、sapi、sfani位点。在一个实施方式中，所述六个限制性位点包含至少四个、优选地六个iis型限制性位点。在一个实施方式中，所述iis型限制性位点选自bsai、aari、bsmbi、acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、btsi、btsimuti、cspci、eari、ecii、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboii、mlyi、mmei、mnli、nmeaiii、plei、sapi、sfani位点。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述六个限制性位点包含a1、a2、b1、b2、c1和c2，其中a1、a2、b1、b2、c1和c2是如本文中为本发明的任何其他方面所描述的限制性位点。在一个实施方式中，所述穿梭载体中的至少一者、优选地至少两者、优选地至少三者、优选地至少四者、优选地至少五者、优选地至少六者、优选地至少七者、优选地所有八者中a1、a2、b1、b2、c1和c2的排列，包括相对于彼此的排列，如本文中为本发明的任何其他方面所述。在一个实施方式中，所述穿梭载体中的至少一者、优选地至少两者、优选地至少三者、优选地至少四者、优选地至少五者、优选地至少六者、优选地至少七者、优选地所有八者中a1、a2、b1、b2、c1、c2和第一标记(m1)的排列，包括相对于彼此的排列，如本文中为本发明的任何其他方面所述。在一个实施方式中，所述第一组限制性位点中彼此相同的两个限制性位点相对于彼此采取趋异取向。在一个实施方式中，所述第一组和第二组中彼此相同的一个限制性位点相对于彼此采取趋同取向。在一个实施方式中，所述六个限制性位点包含三对限制性位点，其中在两对限制性位点中所述限制性位点相对于彼此采取趋异取向，并且在一对限制性位点中所述限制性位点相对于彼此采取趋同取向。在一个实施方式中，所述采取趋同取向的一对限制性位点在所述两对具有趋异取向的限制性位点两侧。在一个实施方式中，所述载体组包含至少一种终载体，所述终载体包含两侧具有趋异限制性位点的标记或没有标记，其中所述趋异限制性位点分别是与在所述四个v1穿梭载体中相对于彼此采取趋同取向的一对限制性位点相同的限制性位点，或与所述四个v2穿梭载体中相对于彼此采取趋同取向的一对限制性位点相同的限制性位点。在一个实施方式中，所述载体组包含本文中为本发明的任何其他方面所描述的至少一种终载体。在一个实施方式中，所述载体组包含本文中为本发明的任何其他方面所描述的至少一种源载体。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组包含四种v1载体和四种v2载体或基本上由它们构成，如本文中为本发明的任何其他方面所描述。优选地，所述四种v1和四种v2载体由v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组中的载体是克隆系统中的组分，或包含可用于制造基因和/或多基因构建物的克隆系统的一部分，正如为本发明的任何其他方面所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，基因构建物和/或多基因构建物如本文中为本发明的任何其他方面所述。此外，在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，如本文中为本发明的任何其他方面所述来制造基因构建物和/或多基因构建物，并将tu或多个tu添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述八种穿梭载体和所述至少一种终载体构成。在一个实施方式中，所述载体组基本上由所述八种穿梭载体、所述至少一种终载体和至少一种源载体构成。专业技术人员将会认识到，如本文中为本发明的任何其他方面所述，本文中关于源载体、穿梭载体和终载体阐述的所有实施方式也是为本发明的这一方面具体设想的本发明的实施方式。另一方面，本发明涉及一种制造包含至少两种穿梭载体的载体组的方法，所述方法包括将本发明的至少一种v1穿梭载体或第一穿梭载体与本发明的至少一种v2穿梭载体或第二穿梭载体相组合。在一个实施方式中，是至少一种第一或v1载体是(-)载体，并且所述至少一种第二载体或v2载体是(+)载体。在一个实施方式中，所述至少一种第一或v1载体是(+)载体，并且所述至少一种第二载体或v2载体是(-)载体。在一个实施方式中，所述方法包括将本文中所描述的至少两种、优选地至少三种、优选地四种v1穿梭载体或第一穿梭载体与本文中所描述的至少两种、优选地至少三种、优选地四种v2穿梭载体或第二穿梭载体相组合。作为本发明的这一方面的实施方式，具体设想了如本文中为本发明的任何其他方面所描述的v1穿梭载体、v2穿梭载体、第一穿梭载体和第二穿梭载体，包括标记的类型和限制性位点的类型和排列方式。在一个实施方式中，所述方法包括将本文中所描述的至少一种终载体与所述穿梭载体相组合。在一个实施方式中，所述方法包括将本文中所描述的至少一种源载体与所述穿梭载体相组合。在一个实施方式中，所述方法包括将至少一种源载体和一种终载体与所述穿梭载体相结合。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述方法包括将四种v1载体与四种v2载体相组合，或基本上由其构成，正如本文中为本发明的任何其他方面所述。优选地，所述四种v1和四种v2载体由v1.1(+)、v1.2(-)、v1.3(+)、v1.4(-)、v2.1(+)、v2.2(-)、v2.3(+)和v2.4(-)构成。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，所述载体组中的载体是克隆系统中的组分，或包含可用于制造基因和/或多基因构建物的克隆系统的一部分，正如为本发明的任何其他方面所述。在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，基因构建物和/或多基因构建物如本文中为本发明的任何其他方面所述。此外，在为本发明的这一方面具体设想的各种不同实施方式中，如本文中为本发明的任何其他方面所述来制造基因构建物和/或多基因构建物，并将tu或多个tu添加到所述终载体中。在一个实施方式中，所述方法基本上由将本文中所描述的四种v1穿梭载体或第一穿梭载体、如本文中所描述的四种v2穿梭载体或第二穿梭载体和如本文中所描述的至少一种终载体相组合构成。在一个实施方式中，所述方法基本上由将本文中所描述的四种v1穿梭载体或第一穿梭载体、如本文中所描述的四种v2穿梭载体或第二穿梭载体、如本文中所描述的至少一种终载体和如本文中所描述的至少一种源载体相组合构成。在一个实施方式中，所述载体组被包含在试剂盒中。另一方面，本发明涉及一种包含至少两个转录单位(tu)的多基因构建物的制造方法，所述方法包括：(a)将包含以下述顺序排列的第一转录单位(tu1)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第一克隆盒：5’-a1-tu1-c1-c2-a2-3’，或5’-a1-c1-c2-tu1-a2-3’，克隆到在第二标记(m2)两侧包含一对限制性位点a1和a2的终载体(v3)中，以制造：包含5’-tu1-c1-c2-3’的终载体v3.1或包含5’-c1-c2-tu1-3’的终载体v3.2，(b)将包含以下述顺序排列的第二转录单位(tu2)、第二标记(m2)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第二克隆盒：5’-c1-tu2-a1-m2-a2-c2-3’，或5’-c1-a1-m2-a2-tu2-c2-3’，克隆到v3.1中，以制造包含5’-tu1-tu2-a1-m2-a2-3’的终载体v4.1或包含5’-tu1-a1-m2-a2-tu2-3’的终载体v4.2，或克隆到v3.2中，以制造包含5’-tu2-a1-m2-a2-tu1-3’的终载体v4.3或包含5’-a1-m2-a2-tu2-tu1-3’的终载体v4.4，其中a1和c1是不同的限制性位点，并且其中a1＝a2并且c1＝c2。在一个实施方式中，v3.1基本上由5’-tu1-c1-c2-3’构成。在一个实施方式中，v3.2基本上由5’-c1-c2-tu1-3’构成。在一个实施方式中，v4.1基本上由5’-tu1-tu2-a1-m2-a2-3’构成。在一个实施方式中，v4.2基本上由5’-tu1-a1-m2-a2-tu2-3’构成。在一个实施方式中，v4.3基本上由5’-tu2-a1-m2-a2-tu1-3’构成。在一个实施方式中，v4.4基本上由5’-a1-m2-a2-tu2-tu1-3’构成。在一个实施方式中，当第一克隆盒被克隆到v3中以制造v3.1或v3.2时，a1和a2从所述第一克隆盒和终载体(v3)中被移除。在一个实施方式中，当第二克隆盒被克隆到v3.1或v3.2中以分别制造v4.1或v4.2或v4.3或v4.4时，c1和c2从所述第二克隆盒和终载体(v3.1或v3.2)中被移除。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)将包含以下述顺序排列的第三转录单位(tu3)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第三克隆盒：5’-a1-tu3-c1-c2-a2-3’，或5’-a1-c1-c2-tu3-a2-3’，克隆到v4.1中，以制造包含5’-tu1-tu2-tu3-c1-c2-3’的终载体v5.1或包含5’-tu1-tu2-c1-c2-tu3-3’的终载体v5.2，或克隆到v4.2中，以制造包含5’-tu1-tu3-c1-c2-tu2-3’的终载体v5.3或包含5’-tu1-c1-c2-tu3-tu2-3’的终载体v5.4，或克隆到v4.3中，以制造包含5’-tu2-tu3-c1-c2-tu1-3’的终载体v5.5或包含5’-tu2-c1-c2-tu3-tu1-3’的终载体v5.6，或克隆到v4.4中，以制造包含5’-tu3-c1-c2-tu2-tu1-3’的终载体v5.7或包含5’-c1-c2-tu3-tu2-tu1-3’的终载体v5.8，其中a1和c1是不同的限制性位点，并且其中a1＝a2并且c1＝c2。在一个实施方式中，当第三克隆盒被克隆到v4.1、v4.2、v4.3或v4.4中时，a1和a2从所述第三克隆盒和终载体中被移除。在一个实施方式中，所述方法包括将包含以下述顺序排列的第四转录单位(tu4)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第四克隆盒：5’-c1-tu4-a1-m2-a2-c2-3’，或5’-c1-a1-m2-a2-tu4-c2-3’，克隆到v5.1中，以制造包含5’-tu1-tu2-tu3-tu4-a1-m2-a2-3’的终载体v6.1或包含5’-tu1-tu2-tu3-a1-m2-a2-tu4-3’的终载体v6.2，或克隆到v5.2中，以制造包含5’-tu1-tu2-tu4-a1-m2-a2-tu3-3’的终载体v6.3或包含5’-tu1-tu2-a1-m2-a2-tu4-tu3-3’的终载体v6.4，或克隆到v5.3中，以制造包含5’-tu1-tu3-tu4-a1-m2-a2-tu2-3’的终载体v6.5或终包含5’-tu1-tu3-a1-m2-a2-tu4-tu2-3’的载体v6.6，或克隆到v5.4中，以制造包含5’-tu1-tu4-a1-m2-a2-tu3-tu2-3’的终载体v6.7或包含5’-tu1-a1-m2-a2-tu4-tu3-tu2-3’的终载体v6.8，或克隆到v5.5中，以制造包含5’-tu2-tu3-tu4-a1-m2-a2-tu1-3’的终载体v6.9或包含5’-tu2-tu3-a1-m2-a2-tu4-tu1-3’的终载体v6.10，或克隆到v5.6中，以制造包含5’-tu2-tu4-a1-m2-a2-tu3-tu1-3’的终载体v6.11或包含5’-tu2-a1-m2-a2-tu4-tu3-tu1-3’的终载体v6.12，或克隆到v5.7中，以制造包含5’-tu3-tu4-a1-m2-a2-tu2-tu1-3’的终载体v6.13或包含5’-tu3-a1-m2-a2-tu4-tu2-tu1-3’的终载体v6.14，或克隆到v5.8中，以制造包含5’-tu4-a1-m2-a2-tu3-tu2-tu1-3’的终载体v6.15或包含5’-a1-m2-a2-tu4-tu3-tu2-tu1-3’的终载体v6.16，其中a1和c1是不同的限制性位点，并且其中a1＝a2并且c1＝c2。在一个实施方式中，当所述第四克隆盒被克隆到v5.1、v5.2、v5.3、v5.4、v5.5、v5.6、v5.7或v5.8中时，c1和c2从所述第四克隆盒和终载体中被移除。在其他实施方式中，所述方法包括向如上为v1.1–v6.15所描述的各种不同终载体添加另外的盒，其包括将在下述载体中包含以下述顺序排列的第n个转录单位(tun)和四个限制性位点a1、a2、c1和c2的第n个克隆盒：(i)在v1载体中以下述顺序：5’-a1-tun-c1-c2-a2-3’，或5’-a1-c1-c2-tun-a2-3’，克隆到具有偶数个tu和在第二标记(m2)两侧带有一对限制性位点a1和a2的终载体中，以制造具有奇数个tu的终载体。在一个实施方式中，当使用a1和a2将所述第n个克隆盒克隆到终载体中以制造含有所述第n个tu的新的终载体时，(i)中的a1和a2从所述第n个克隆盒和所述终载体中被移除。或(ii)在v2载体中以下述顺序：5’-c1-tun-a1-m2-a2-c2-3’，或5’-c1-a1-m2-a2-tun-c2-3’，克隆到具有奇数个tu和一对限制性位点c1和c2的终载体中，以制造具有偶数个tu的终载体。在一个实施方式中，当使用c1和c2将所述第n个克隆盒克隆到终载体中以制造含有所述第n个tu的新的终载体时，(ii)中的c1和c2从所述第n个克隆盒和所述终载体中被移除。在一个实施方式中，a1、a2、c1和c2是iis型限制性位点。在一个实施方式中，所述iis型限制性位点选自bsai、aari和bsmbi位点。在一个实施方式中，a1和a2是aari限制性位点。在一个实施方式中，c1和c2是bsmbi限制性位点。在一个实施方式中，所述终载体是选自质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、福斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体和噬菌体人工染色体或其组合的载体。在一个实施方式中，所述终载体是质粒。在一个实施方式中，m2编码选择标记或评分标记。在一个实施方式中，m2是评分标记。在一个实施方式中，所述评分标记是产色标记，优选为lacz标记。在一个实施方式中，m2是选择标记。在一个实施方式中，所述选择标记是编码抗生素抗性的多核苷酸。在一个实施方式中，所述抗生素抗性是对选自卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、萘啶酮酸、两性霉素b、红霉素、庆大霉素、新霉素和制霉菌素的抗生素的抗性。在一个实施方式中，m1是选择标记。在一个实施方式中，所述选择标记是编码为含有所述标记的细胞或生物体提供致死性的肽的基因，例如当编码所述肽的基因被转化到适合的细胞中时，或当所述细胞或生物体在适合的条件下生长时。在一个实施方式中，所述标记选自ccdb、phes、rpsl、sacb。在一个实施方式中，所述标记是突变的大肠杆菌phes选择标记，其可操作连接到启动子，优选为大肠杆菌启动子，优选为大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶启动子。在一个实施方式中，所述突变的大肠杆菌phes选择标记是thr251ala/ala294gly双重突变体。在一个实施方式中，所述多基因构建物包含来自于生物合成途径的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个、优选地五个、优选地六个、优选地七个、优选地八个、优选地九个、优选地至少十个tu，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述多基因构建物包含完整的生物合成途径、基本上由其构成或由其构成。在一个实施方式中，所述生物合成途径是微生物的、优选为真菌的生物合成途径。在一个实施方式中，所述生物合成途径是吲哚二萜生物合成途径。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径是penitremane途径，优选为青霉震颤素a途径。在一个实施方式中，所述途径来自于真菌，优选为青霉属物种(peniciliumspp.)，优选为皮壳青霉(p.crustosum)。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径是janthitremane途径，优选为微紫青霉震颤素b途径。在一个实施方式中，所述途径来自于真菌，优选为青霉属物种(peniciliumspp.)，优选为微紫青霉(p.janthinellum)。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径是lolitremane途径，优选为黑麦震颤素b生物合成途径，优选地来自于真菌，优选为香柱霉属物种优选为羊茅香柱霉(e.festucae)。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径包含雀稗灵的生产所需的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个基因，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述雀稗灵的生产所需的基因包含paxg、paxm、paxb和paxc中的至少一者，优选地paxg、paxm、paxb和paxc中的至少两者，优选地至少三者，优选地所有四者。优选地，所述雀稗灵的生产所需的基因来自于青霉属物种(peniciliumspp.)，优选为蕈青霉(p.paxilli)。在一个实施方式中，所述吲哚二萜生物合成途径包含蕈青霉素的生产所需的至少一个、优选地两个、优选地三个、优选地四个、优选地五个、优选地六个基因，基本上由它们构成或由它们构成。在一个实施方式中，所述蕈青霉素的生产所需的基因包含paxg、paxm、paxb、paxc、paxq和paxp中的至少一者，优选地至少两者，优选地至少三者，优选地至少四者，优选地至少五者，优选地所有六者。优选地，所述蕈青霉素的生产所需的基因来自于青霉属物种(peniciliumspp.)，优选为蕈青霉(p.paxilli)。在一个实施方式中，所述生物合成途径是天然存在的生物合成途径。在一个实施方式中，所述生物合成途径是人工生物合成途径。另一方面，本发明涉及一组载体，其包含：(i)本发明的四种第一穿梭载体或v1穿梭载体，(ii)本发明的四种第二穿梭载体或v2载体，和(iii)至少一种终载体，所述至少一种终载体包含一对限制性位点，其中(iii)中的所述一对限制性位点相对于彼此具有趋异取向，并且与(i)中的每一种穿梭载体和(ii)中的每一种穿梭载体中的一对限制性位点相同，其中所述(i)中的限制性位点相对于彼此具有趋同取向，并且其中所述(ii)中的限制性位点相对于彼此具有趋异取向。在一个实施方式中，所述载体组基本上由(i)和(ii)构成。在一个实施方式中，在(i)中的任一载体中限制性位点的限制产生至少一个核苷酸、优选地至少两个、优选地至少三个、优选地至少四个核苷酸的核苷酸单链突出端。在一个实施方式中，在(iii)中的终载体中限制性位点的限制产生至少一个核苷酸、优选地至少两个、优选地至少三个、优选地至少四个核苷酸的核苷酸单链突出端。在一个实施方式中，(iii)中的所述一对限制性位点是iis型限制性位点。在一个实施方式中，所述iis型限制性位点选自bsai、aari和bsmbi位点。在一个实施方式中，a1和a2是aari限制性位点。在一个实施方式中，c1和c2是bsmbi限制性位点。在本说明书中，在对专利说明书、其他外部文献或其他信息源做出引用时，这通常是出于为本发明的特点的讨论提供背景的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何管辖范围内是先有技术或形成本领域公知常识的一部分。现在将参考下述实施例，以非限制性方式来说明本发明。实施例材料和方法分子生物学限制性内切酶购自newenglandbiolabs(neb,ipswich,ma,usa)，例外的是aari，其购自thermoscientific(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)。t4dna连接酶、10×t4dna连接酶缓冲液和10mmatp；来自于neb(ipswich,ma,usa)。引物和gblock由integrateddnatechnologies(idt,coralville,ia,usa)合成。其他合成的多核苷酸由epochlifescience,inc(missouricity,tx,usa)合成。使用离心柱方案纯化质粒dna和pcr产物的试剂盒购自macherey-nagel(düren,germany)。来自于蕈青霉(penicilliumpaxilli)的基因组dna使用来自于zymoresearch(irvine,ca,usa)的zr真菌/细菌dnamicropreptm试剂盒分离。用于midas源、穿梭和终载体的构建和用于midas模块的扩增的所有pcr使用phusion高保真pcr主混合物和hf缓冲液(neb,ipswich,ma,usa)进行。异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)购自calbiochem(sandiego,ca,usa)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(x-gal)购自panreacapplichem(darmstadt,germany)，4-氯-dl-苯丙氨酸(4cp)购自sigma(stlouis,mo,usa)。在本工作中使用的抗生素是：遗传(g418，来自于sigma)、卡那霉素(panreacapplichem,darmstadt,germany)和壮观霉素(goldbiotechnology,olivette,mo,usa)。细菌和真菌菌株大肠杆菌的常规生长在37℃下在lb肉汤中进行。将化学感受态大肠杆菌xl10-goldultracompetent细胞(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)用于在3级时组装的质粒的转化和维护。将化学感受态大肠杆菌hst08stellar细胞(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)用于所有其他质粒(包括所有源、穿梭和终载体以及在1级和2级时组装的所有质粒)的常规转化和维护。在本研究中使用的蕈青霉(penicilliumpaxilli)菌株示出在表15中。midas载体的构建与midas模块一样，所有midas源、穿梭和终载体需要被驯化(即被制造成无aari、bsai和bsmbi的识别位点)。为了实现这一点，通过对应于特定功能性质粒结构(例如复制原点、抗性标记等)的pcr片段的bsai介导的组装，以模块化方式组装midas载体构建中的初始质粒；其中pcr片段的数目取决于将要移除的内部iis型位点的数目和将要作为独立的有功能的片段维持的质粒结构的数目两者。通过pcr产生的含有末端趋同bsai识别位点的dna片段的bsai介导的金门组装，以模块化方式构建midas前体质粒(参见表1、2和3)。通常，将1–2μl每种纯化的pcr片段、1μlbsai(20u/μl)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μl10×t4dna连接酶缓冲液在20μl总反应体积中在37℃温育过夜。1级源载体(pml1)的构建pml1前体质粒使用pcr片段cv-161、cv-162、cv-74和cv-152之间的四路bsai介导的金门反应来产生(表1)。在金门组装后，将每种反应的等分试样通过热冲击转化到大肠杆菌hst08stellar感受态细胞(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)中，并铺于增补有50μg/ml壮观霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。蓝色菌落通过纯化的质粒dna的限制性酶消化来筛选，并通过测序确认。将pml1前体中的329bpncoi-xhoi片段通过限制性酶消化和连接，用含有基于laczα的金门克隆盒([ctcg]bsmbi-laczα-bsmbi[agac])的pcrcv-81的346bpncoi-xhoi片段替换。得到的质粒是1级源载体pml1。2级穿梭载体(pml2载体)的构建pml2穿梭载体的前体使用pcr片段cv-153、cv-154、cv-77和cv-152之间的四路bsai介导的金门反应来产生(表2)。在金门组装后，将每种反应的等分试样通过热冲击转化到大肠杆菌hst08stellar感受态细胞(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)中，并铺于增补有75μg/ml卡那霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。蓝色菌落通过纯化的质粒dna的限制性酶消化来筛选，并通过测序确认。将所述pml2前体用ncoi+xhoi消化并连接到用相同酶消化的gblocks。8个gblocks(表4)可以被分成两组，一组包含四个“w”gblocks(ml2(+)wf、ml2(+)wr、ml2(-)wf和ml2(-)wr)，第二组包含4个“b”gblocks(ml2(+)bf、ml2(+)br、ml2(-)bf或ml2(-)br)。将连接液转化到大肠杆菌stellar细胞中，并铺于增补有75μg/ml卡那霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。白色菌落通过纯化的质粒dna的限制性酶消化来筛选，并通过测序确认。得到的8个质粒被命名为“gblock前体质粒”，包含四个“w”gblock前体质粒和四个“b”gblock前体质粒、编码如miyazaki(33)所描述的大肠杆菌phes的thr251ala/ala294gly双重突变体的合成的多核苷酸序列由epochlifescience,inc(missouricity,tx,usa)提供。将phes基因的编码序列扩增(pcrcv-141)并通过与pcrcv-129的bsai介导的金门组装置于氯霉素乙酰转移酶(cat)启动子的控制之下。将bsai热失活，然后将组装的phes基因连接到在前一步中产生的也已用bsai处理的八个gblock前体质粒中的每一者。将连接液通过热冲击转化到大肠杆菌hst08stellar感受态细胞(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)中，铺于增补有75μg/ml卡那霉素的lb平板上，通过限制性酶分析和测序来分析菌落。对于四个“w”gblock前体质粒来说，组装的phes基因的连接产生四个“w”2级穿梭载体：pml2(+)wf，pml2(+)wr，pml2(-)wf和pml2(-)wr。为了产生四个“b”2级穿梭载体，将来自于前一步的带有组装的phes基因的四个““b”gblock前体质粒用aari消化并连接到bsai消化的pcrcv-78，产生四个“b”2级穿梭载体：pml2(+)bf，pml2(+)br，pml2(-)bf和pml2(-)br。将连接液转化到大肠杆菌hst08stellar细胞中(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)，铺于增补有75μg/ml卡那霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。通过限制性消化和测序来分析蓝色菌落。在所述八个pml2穿梭载体中的每一者中突变体phes基因的功能，通过将0.1μg每种质粒转化到hst08stellar感受态细胞中，并将转化混合物铺于增补有1.25mm4cp和75μg/ml卡那霉素的lb平板上和只增补有75μg/ml卡那霉素(无4cp)的平板上来确认。在每种情况下，当将未稀释的转化混合物铺于含有4cp的平板上时没有观察到菌落(给出了<3.25×104kanrcfu/μg的计算效率)，而在不含4cp的板上生长后为每种载体计算的效率>1.3×106kanrcfu/μg质粒dna，指示了高的反选择效率。3级终载体(pml3)的构建质粒pml3使用pcr片段cv-161、cv-162、cv-79和cv-152的四路bsai介导的金门反应来产生(表3)。在金门组装后，将每个反应的等分试样通过热冲击转化到hst08stellar感受态细胞中(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)，并铺于增补有50μg/ml壮观霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb平板上。蓝色菌落通过纯化的质粒dna的限制性酶消化来筛选，并通过测序来确认。用于midas1级模块克隆的方案pcr扩增的模块使用离心柱方案来纯化，并通过bsmbi介导的金门组装克隆到midas1级质粒pml1中。通常，将1–2μl(大约50–200ng)来自于微量制备的pml1质粒dna与1–2μl每种纯化的pcr片段、1μlbsmbi(10u/μl)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μl10×t4dna连接酶缓冲液在20μl的总反应体积中混合。将反应在37℃温育1至3小时，并通过热冲击将等分试样(通常2–3μl)转化到30μl大肠杆菌hst08stellar感受态细胞(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)中。在恢复期(添加250μlsoc培养基并在37℃温育1小时)后，将转化混合物的等分试样铺于增补有50μg/ml壮观霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb琼脂平板上。将板在37℃温育过夜，并选择白色菌落用于分析。用于midas2级tu组装的方案使用在1级时克隆的模块，通过bsai介导的金门组装将全长tu组装到midas2级质粒中。通常，将40fmolpml2质粒dna与每种1级入门克隆的40fmol质粒dna、1μlbsai-hf(20u/μl)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μl10×t4dna连接酶缓冲液在20μl的总反应体积中混合。将反应在dnaengineptc-200peltier热循环仪(bio-rad,hercules,ca,usa)中，使用下述参数进行温育：45个(37℃下2分钟和16℃下5分钟)的循环，然后在50℃下5分钟并在80℃下10分钟。如在用于midas1级模块克隆的方案下所述将反应转化到大肠杆菌hst08stellar感受态细胞中，并铺于含有75μg/ml卡那霉素和1.25mm4cp的lb琼脂平板上。在37℃下过夜温育后，挑取菌落用于分析。用于midas3级多基因组装的方案将在2级时组装的全长tu，通过使用aari(用于克隆在pml2“w”载体中的tu)或bsmbi(用于克隆在pml2“b”载体中的tu)的交替金门组装，用于在3级终载体中产生多基因组装体。通常，将40fmol3级终载体质粒dna与40fmol2级入门克隆质粒dna混合。对于bsmbi介导的组装来说，将1μlbsmbi(10u/μl)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μl10×t4dna连接酶缓冲液添加到质粒dna，最终反应体积为20μl。正如在正文中讨论的，为aari介导的组装试验了两种不同的反应条件：(i)在t4dna连接酶缓冲液中进行的常规金门反应，和(ii)在增补有atp的aari限制性酶缓冲液中进行的反应。对于在t4dna连接酶缓冲液中进行的aari介导的反应来说，将1μlaari(2u/μl)、0.4μl50×寡核苷酸(25μm，随着酶供应)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μlt4dna连接酶缓冲液添加到质粒dna，最终反应体积为20μl。对于在限制性酶缓冲液中进行的aari介导的反应来说，将1μlaari(2u/μl)、0.4μl50×寡核苷酸(25μm，随着酶供应)、2μl10×缓冲液aari(随着酶供应)、1μlt4dna连接酶(400u/μl)和2μl10mmatp添加到质粒dna，最终反应体积为20μl。所有3级反应(bsmbi和aari介导的)在dnaengineptc-200peltier热循环仪(bio-rad)中，使用下述参数来温育：45个(37℃下2分钟和16℃下5分钟)的循环，然后在50℃下5分钟并在80℃下10分钟。如在用于midas1级模块克隆的方案下所述将反应转化到大肠杆菌xl10-gold感受态细胞中，并铺于含有50μg/ml壮观霉素、1mmiptg和50μg/mlx-gal的lb琼脂平板上。将平板在37℃下温育过夜。对于aari介导的组装反应来说，选择白色菌落用于分析，而对于bsmbi介导的组装反应来说，筛选蓝色菌落。用于真菌工作的培养基和试剂含有微量元素的cdye(czapex-dox/酵母提取物)培养基使用去离子水制备，并含有3.34％(w/v)czapex-dox(oxoidltd.,hampshire,england)、0.5％(w/v)酵母提取物(oxoidltd.,hampshire,england)和0.5％(v/v)微量元素溶液。对于琼脂平板来说，添加select琼脂(invitrogen,california,usa)至1.5％(w/v)。微量元素溶液在去离子水中制备，并含有0.004％(w/v)六水氯化钴(ii)(ajaxfinechem,auckland,newzealand)、0.005％(w/v)无水硫酸铜(ii)(scharlau,barcelona,spain)、0.05％(w/v)七水硫酸亚铁(ii)(merck,darmstadt,germany)、0.014％(w/v)四水硫酸锰(ii)和0.05％(w/v)七水硫酸锌(merck,darmstadt,germany)。所述溶液用1滴12m盐酸防腐。再生(rg)培养基使用去离子水制备，并含有2％(w/v)麦芽提取物(oxoidltd.,hampshire,england)、2％(w/v)无水d(+)-葡萄糖(vwrinternationalbvba,leuven,belgium)、1％(w/v)真菌蛋白胨(oxoidltd.,hampshire,england)和27.6％蔗糖(ecpltd.birkenhead,auckland,newzealand)。取决于所述培养基是用于平板(1.5％rga)还是覆盖(0.8％rga)，分别添加select琼脂(invitrogen,carlsbad,ca,usa)至1.5％或0.8％(w/v)。真菌方案–原生质体制备用于转化的真菌原生质体的制备按照yelton等(34)并作出修改。将五个在100ml锥形摇瓶中的25ml含有微量元素的cdye培养基的等分试样用5×106个孢子接种，并在28℃下振摇(200rpm)温育28小时。将来自于所有5个摇瓶的发酵液通过无菌尿布衬巾过滤，并将合并的菌丝体用无菌水清洗三次并用om缓冲液(10mmna2hpo4和1.2mmgso4.7h2o，用100mmnah2po4.2h2o调整到ph5.8)清洗一次。将菌丝体称重，每克菌丝体重悬浮在10ml过滤除菌的裂解酶类溶液(通过将来自于哈茨木霉(trichodermaharzianum)的裂解酶类(sigma,stlouis,mo,usa)以10mg/ml重悬浮在om缓冲液中来制备)中，并在30℃下以80rpm振摇温育16小时。将原生质体通过无菌尿布衬巾过滤到250ml锥形摇瓶中。将过滤过的原生质体的等分试样(5ml)转移到无菌15ml离心管中，并用2mlst缓冲液(0.6m山梨糖醇和0.1mph8.0的tris-hcl)覆盖。将管在4℃下以2600xg离心15分钟。将在每个管中在om与st缓冲液之间形成的白色原生质体层转移(以2ml的等分试样)到无菌15ml离心管中，通过用移液器重悬浮在5mlstc缓冲液(1m山梨糖醇，50mmph8.0的tris-hci和50mmcacl2)中轻柔清洗，并在4℃下以2600xg离心5分钟。倾析出上清液，并将来自于多个管的沉积的原生质体通过重悬浮合并在5mlstc缓冲液的等分试样中。所述stc缓冲液清洗被重复三次，直至将原生质体合并在单个15ml离心管中。将最终的原生质体沉积物重悬浮在500μlstc缓冲液中，并用血细胞计数器估算原生质体浓度。将所述原生质体储用物稀释，以给出每mlstc缓冲液1.25×108个原生质体的终浓度。将原生质体的等分试样(100μl)立即用于真菌转化，将过量的原生质体保存在1.7ml微量离心管中的8％peg溶液(将80μl原生质体添加到20μl40％(w/v)peg4000在stc缓冲液中的溶液)中，并在-80℃下储存。真菌方案–蕈青霉(p.paxilli)的转化从vollmer和yanosfsky(35)以及oliver等(36)修改的真菌转化在含有新鲜制备在stc缓冲液中或储存在8％peg溶液(如上所述)中的100μl(1.25×107)原生质体的1.7ml微量离心管中进行。向所述原生质体添加含有2μl亚精胺(50mm，在h2o中)、5μl肝素(5mg/ml，在stc缓冲液中)和5μg质粒dna(250μg/ml)的溶液，并在冰上温育30分钟后，添加900μl40％peg溶液(40％(w/v)peg4000在stc缓冲液中的溶液)。将所述转化混合物在冰上继续温育15–20分钟，转移到无菌50ml管中的17.5ml0.8％rga培养基(预加温到50℃)，颠倒混合，并将3.5ml等分试样分发到1.5％rga平板上。在25℃下温育过夜后，将5ml0.8％rga(含有足够的遗传霉素以获得每ml固体培养基150μg的终浓度)覆盖在每个平板上。将平板在25℃下继续温育4天，从各个菌落挑取孢子并在增补有150μg/ml遗传霉素的cdye琼脂平板上划线。将划线的平板在25℃下继续温育4天。将来自于各个菌落的孢子悬浮在50μl0.01％(v/v)tritonx-100中，并将所述孢子悬液的5×5μl等分试样转移到新的增补有150μg/ml遗传霉素的cdye琼脂平板上。将孢子形成平板在25℃下温育4天，并如下所述制备孢子储用液。将来自于孢子形成平板的菌落塞悬浮在2ml0.01％(v/v)tritonx-100中，并将800μl悬浮的孢子与200μl50％(w/v)甘油在1.7ml微量离心管中混合。使用孢子储用液接种50mlcdye培养基，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。用于nmr分析的大规模吲哚二萜纯化如“吲哚二萜生产和提取”下所描述，将生产高水平的新的吲哚二萜的真菌转化体生长在≥1升含有微量元素的cdye培养基中。将菌丝体合并在含有搅拌棒的1升schott瓶中。添加2-丁酮并在搅拌(≥700rpm)下提取吲哚二萜过夜。将提取物通过545(j.t.thermofisherscientific,waltham,ma,usa)过滤并干燥装载在具有旋转蒸发的硅胶上，通过硅胶柱进行粗品纯化，然后通过半制备hplc进行最终纯化。将粗提液的1ml等分试样进样到附连到3000标准lc柱(dionex,thermofisherscientific,waltham,ma,usa)的半制备反相phenomenex5μmc18(2)(250×15mm)柱中，以8.00ml/分钟的流速运行。对多步梯度方法进行优化，用于不同组吲哚二萜的纯化。每种吲哚二萜的纯度通过lc-ms来评估，并且结构通过nmr来鉴定。nmr在氘化氯仿中制备nmr样品。化合物通过标准的一维质子和碳-13nmr、二维相关光谱(cosy)、异核单量子相关(hsqc)光谱和异核多键相关(hmbc)光谱来分析。吲哚二萜生产和提取将真菌转化体在塞有棉绒的250ml锥形摇瓶中，在50ml含有微量元素的cdye培养基中，在振摇培养(≥200rpm)中在28℃生长7天。通过经尿布衬巾过滤从发酵液分离菌丝体，转移到50ml离心管(labthermofisherscientific,waltham,ma,usa)，并通过将菌丝体在2-丁酮中剧烈振摇(≥200rpm)≥45分钟来提取idt。薄层层析将2-丁酮上清液(含有提取的idt)用于在固相硅胶60铝板(merck,darmstadt,germany)上进行薄层层析(tlc)分析。idt使用9:1的氯仿：乙腈或9:1的二氯甲烷：乙腈进行层析，并用艾氏试剂(1％(w/v)对二甲氨基苯甲醛在24％(v/v)hcl和50％乙醇中)可视化。液相层析-质谱从通过tlc测试为阳性的那些转化体制备用于液相层析-质谱(lc-ms)的样品。因此，将1ml2-丁酮上清液(含有提取的idt)的样品转移到1.7ml微量离心管，并将2-丁酮蒸发过夜。将内含物重悬浮在100％乙腈中，并通过0.2μm膜过滤到lc-ms小瓶中。将lc-ms样品在附连到3000标准lc系统(dionex,thermofisherscientific,waltham,ma,usa)的反相thermoscientificaccucore2.6μmc18(50×2.1mm)柱上进行层析，以0.200ml/分钟的流速运行，并使用多步梯度方法(表13)，用含有0.01％甲酸的乙腈水溶液洗脱。质谱图在maxistmii四级杆飞行时间质谱仪(bruker,billerica,ma,usa)上通过在线分析来捕获。结果代谢途径工程使用具有整个pax基因座的缺失的蕈青霉(penicilliumpaxilli)菌株pn2250(cy2)的基因重建实验显示，为了生产蕈青霉(p.paxilli)用于蕈青霉素和其他环状idt的生物合成途径中的关键中间体即雀稗灵，需要四个基因(paxg、paxc、paxm和paxb)(37)，为了蕈青霉素的生物合成需要另外的两个基因(paxp和paxq)(38)。为了演示midas在合成生物学应用中的用途，我们决定试验所述系统在这种pax缺陷型菌株中恢复蕈青霉(p.paxilli)的雀稗灵和蕈青霉素生物合成途径的能力。因此，我们试验了midas的下述能力：(i)从基本模块组装这六个pax基因tu中的每一者，(ii)组装含有至多六个paxtu的多基因质粒(其中每个tu具有与本源pax簇中存在的相同的相对位置和取向)，并且(iii)在一系列互补实验中，确定这些质粒是否可以在所述pax缺陷型菌株中重建雀稗灵和/或蕈青霉素生产。1级组装使用来自于蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2013的基因组dna作为模板，为所述六个pax基因中的每一者扩增了转录单位模块(proutr、cds和utrterm)(表7)。由于目的是生产用于蕈青霉(p.paxilli)菌株的转化的多基因质粒，因此为这个工作选择适合的选择标记(nptii，其赋予对遗传的抗性)。因此，扩增了用于nptii基因的cds模块，并且为了驱动这个基因的表达，也从构巢曲霉(aspergillusnidulans)trpc基因扩增了proutr和utrterm模块(参见表7)。每个pax基因的外显子/内含子结构保持不变，并且在必要时设计了用于驯化目的(即移除aari、bsai和bsmbi的内部识别位点)的pcr引物来扩增模块片段。驯化引物被列于表7中。然后将扩增的全长模块(和相容的成套的驯化的模块片段)通过bsmbi介导的金门组装克隆到pml1中。将反应转化到大肠杆菌hst08stellar细胞中，并铺于增补有壮观霉素、iptg和x-gal的lb平板上。菌落的总数和白色：蓝色菌落的比率两者显示出与组装在一起以形成功能性模块所需的pcr片段的数目总体成反比，其中pcr片段的数目进而由驯化要求决定(表8)。通常，从仅仅一个pcr片段组装的模块(例如paxgproutr模块)产生较高的cfu数目和较高的白色菌落比例(86–98％)，而对于从2、3或4个pcr片段组装的模块来说，cfu数目和白色菌落的比例(76–95％)倾向于较低。通过使用bsai的限制性酶消化来分析来自于每种组装的两个白色菌落的质粒dna，所述消化释放出所述克隆的模块。被选择用于限制性分析的所有42个1级克隆含有预期大小的插入片段(图6)，并且在被测序的28个克隆的子集中，所有bsmbi组装接合部都是正确的，证实了所述组装反应的忠实性。在这里为midas1级报告的白色：蓝色比率和克隆效率，与文献中为其他基于金门的组装技术所报告的多片段克隆效率相符。产生的tum的文库示出在表9中。2级组装在2级时，通过将每个paxcds模块与其同源(即本源)proutr和utrterm模块bsai组装在pml2穿梭载体中，构建了用于paxg、paxc、paxm、paxb、paxp和paxq的tu(参见图7和表10)，并且所述组装的tu用它们含有的cds的名称注释。例如，含有paxbtu的2级入门克隆psk23，通过将paxbcds模块(来自于质粒psk8)与paxb启动子(即psk7中的paxbproutr模块)和paxb终止子(psk9中的paxbutrterm模块)组装在pml2(+)br中来产生。同样地，paxptu(psk73)从paxpproutr(psk75)、paxpcds(psk69)和paxputrterm(psk70)模块组装在pml2(+)br中，而paxqtu(psk74)从paxqproutr(psk76)、paxqcds(psk71)和paxqutrterm(psk72)模块组装在pml2(+)wr。某些tu被组装在超过一个pml2穿梭载体中。例如，paxmtu被组装在pml2(+)wr和pml2(+)br两者中。两种paxm2级入门质粒(psk22和prb1)都从相同的1级入门克隆(psk4、psk5和psk6)组装。组装了两种paxgtu；在一种情况下(质粒psk21)，paxgtu通过将paxgcds模块(来自于质粒psk2)与其本源启动子(即psk1中的paxgproutr模块)和终止子(paxgutrterm，psk3)组装在pml2(+)br中来产生。为了演示midas用于组合装配的通用性，也使用相同的paxgcds(paxgcds，psk2)和终止子(paxgutrterm，psk3)，但使用由异源paxb启动子(paxbproutr，psk7)驱动的表达，在pml2(+)br中组装了第二种paxgtu(质粒psk47)，并且所述psk47中的tu结构被示出为ppaxb-paxg-tpaxg。组装了三种paxctu；在两种情况下(质粒psk59和pkv29)，paxctu从相同的1级质粒，通过将paxccds(psk11)与其本源启动子(pkv28)和终止子(psk12)组合来组装，尽管是在不同的pml2穿梭载体中，在psk59的情况下是pml2(+)wf，并且在pkv29的情况下是pml2(+)bf。再次为了演示midas用于组合装配的通用性，使用相同的paxccds但是用异源启动子(psk17中的trpcproutr)和终止子(trpcutrterm，psk15)模块，在pml2(+)wf中组装了第三种paxctu(psk61)。为了将这种paxctu与从本源启动子和终止子组装的其他paxctu区分开，psk61中的paxctu结构被示出为ptrpc-paxc-ttrpc。nptiitu(提供对遗传的抗性)通过将nptiicds模块(psk16)与trpcproutr(psk17)和trpcutrterm(psk15)模块组装在pml2(+)wf中来制备，得到2级入门克隆psk26(并且所述tu结构被示出为ptrpc-nptii-ttrpc)。在bsai介导的组装后，将反应转化到大肠杆菌hst08stellar细胞中并铺于增补有卡那霉素和4cp的lb平板上。对于这些4路组装(即三个入门克隆和一个pml2穿梭载体)来说，每个金门反应获得平均约6700个卡那霉素抗性菌落(表10)。通过限制性酶消化分析了来自于每个组装反应的两个菌落的质粒dna，并且在分析的22个菌落中，21个菌落产生与预期大小相符的限制性消化图案(图8)。为了评估克隆忠实性，将一部分具有正确的限制性酶消化图案的质粒跨越bsai组装接合部测序。结果显示100％(11/11)的具有正确限制性图案的质粒也具有正确的组装接合部，证实了这些bsai介导的多部件组装的忠实性。3级组装在2级时组装的tu被用于在3级时产生各种不同的多基因质粒(参见图9和表11)。在产生适合于蕈青霉(p.paxilli)菌株的转化的多基因质粒中的第一步是克隆真菌选择标记基因。因此，在2级组装后，使用aari介导的金门反应将nptiitu(被pml2入门克隆psk26带有)装载到pml3中。得到的质粒(psk33)随后充当终载体，用于顺序组装带有多达六个pax基因的多基因质粒。在每个3级金门反应转化到大肠杆菌xl10-gold中之后获得的壮观霉素抗性菌落的数目对质粒的大小具有总体依赖性，较大的质粒产生较少的菌落(表12)。bsmbi介导的组装非常高效，>99％的得到的聚落具有所需的(蓝色)颜色(表12)。选择来自于每个bsmbi介导的反应的两个蓝色菌落用于质粒dna纯化和限制性分析，并且在分析的12个质粒中，所有质粒都显示出预期的限制性消化图案(图10)。对于aari介导的组装来说，试验了两种不同的限制/连接条件。在第一组实验中，aari介导的金门反应如常在t4dna连接酶缓冲液中进行。获得的所需颜色(白色)的菌落的比例相当可变，其范围取决于组装反应在64–96％之间(表12)。高的蓝色菌落背景表明在连接酶缓冲液中aari具有降低的切割效率；事实上，即使在标准的反应条件下许多位点也未被aari完全切割(39)。因此，作为可选方法，也在随aari限制性酶提供的反应缓冲液中进行了aari组装，并另外增补有atp。在这些条件下，组装显示出效率的显著改进(>96％的白色菌落)，并且当选择来自于每个反应的两个白色菌落用于质粒dna纯化和限制性分析时，高比例(9/10)显示出预期的限制性消化图案(图10)。真菌转化和idt表型的分析在一系列互补实验中，将所选的在本工作中产生的3级质粒转化到具有适合的遗传背景的蕈青霉(p.paxilli)菌株中。遗传霉素抗性真菌转化体的雀稗灵和/或蕈青霉素表型通过菌丝体提取物的初始薄层层析(tlc)筛选来确定，并通过lc-ms来确认。为此目的，通过半制备hplc从野生型蕈青霉(p.paxilli)(菌株pn2013)的提取物制备了雀稗灵和蕈青霉素参比标准品。将所述hplc峰通过高分辨率质谱进行分析，其鉴定到17.6分钟处的[m+h]+质量为422.3055m/z并且5.3分钟处为436.2485m/z，分别对应于雀稗灵(计算[m+h]+422.3054m/z)和蕈青霉素(计算[m+h]+436.2482m/z)的质量(分别为图14和图15)。使用nmr证实了所述纯化的参比标准品的结构(参见表14和图22至31)。在δpax缺陷突变体中雀稗灵生产的恢复由于遗传重建实验已显示使用仅仅四个基因(paxg、paxm、paxb和paxc)的互补可以在具有整个pax基因座的缺失(37)的蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2250(cy2)中恢复雀稗灵生产，因此我们决定试验具有这四个核心基因的midas组装的多基因质粒是否也可以在这种δpax菌株中恢复这种idt的生产。因此，将各自在其本源启动子和终止子控制之下的paxg(psk21)、paxm(psk22)和paxb(psk23)的tu顺序装载到psk33中，然后装载来自于psk59(本源启动子)或psk61(异源trpc启动子)的paxctu，以分别产生psk64和psk63(参见图9和表11)。由于psk64与psk63的区别仅在于最后添加的tu，因此它们能够从相同的前体质粒psk37构建。当将质粒psk64或psk63转化到蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2250(cy2)中时，通过薄层层析(tlc)筛选的8/18(约44％)的遗传霉素抗性菌落显示出在它们的提取物中存在雀稗灵(图12)。转化体psk64:pn2250#14的lc-ms分析鉴定到保留时间(参见图11，迹线cii)和提取离子层析图(eic)质量(图18a)与雀稗灵相对应的峰。在转化体psk63:pn2250#8的情况下，在hplc迹线中具有雀稗灵的保留时间的峰勉强可检测(图11，迹线ciii)，但eic422.305±0.01m/z(图19a)证实了雀稗灵的存在。这些结果证实当将四个核心pax基因(paxgmbc)在这些midas组装的多基因质粒上引入时，这种ko突变体中雀稗灵生物合成途径的成功恢复。由于亲代菌株pn2250(cy2)中包括paxp和paxq的pax簇的大范围缺失，正如预期的，在这些转化体的lc-ms分析中没有鉴定到蕈青霉素(参见图18b和19b)。也正如预期的，亲代菌株pn2250(cy2)和用质粒psk37(其带有paxgmb，但没有paxc)转化的pn2250(cy2)在它们的提取物中均未显示出雀稗灵或蕈青霉素的证据，正如通过hplc(参见图11，分别为迹线ci和civ)和eic分析(分别为图17和图21)所评估的。这与野生型菌株(pn2013)相反，后者显示出雀稗灵(17.6min，422.3055m/z)和蕈青霉素(5.3min，436.2485m/z)(参见图11，迹线b和图16)两者的lc-ms峰。在δpax缺失突变体中蕈青霉素生产的恢复由于基因破坏和化学互补实验已显示paxp和paxq为雀稗灵向蕈青霉素的生物合成转化所需(40)，因此我们还试验了除了四个核心基因(paxgmbc)之外还带有paxp和paxq的midas组装的多基因质粒是否可以在蕈青霉(p.paxilli)菌株pn2250(cy2)中恢复蕈青霉素的生产。因此，将质粒psk64(带有全在其本源启动子控制之下的参与雀稗灵生物合成的四个核心pax基因)顺序地用paxptu(来自于psk73)装载以产生psk78，然后用paxqtu(来自于psk74)装载以产生质粒psk79，其带有总共6个pax基因。将质粒psk79转化到蕈青霉(p.paxilli)pn2250(cy2)中，并且在通过tlc筛选的15个遗传霉素抗性株系中，9个显示出在它们的提取物中存在雀稗灵和蕈青霉素两者(图13)。转化体psk79:pn2250#14的lc-ms分析鉴定到具有与雀稗灵和蕈青霉素相对应的保留时间(图11，迹线cv)和eic质量(图20)的峰，从而证实了蕈青霉素生物合成途径在这种ko菌株中的成功恢复。使用细菌人工染色体(bac)的蕈青霉素生产为了演示midas的原理，到目前为止在本工作中使用的3级终载体(即pml3)被设计成具有高拷贝数的pmb1复制子(来自于puc19)以易于操作(即高的质粒产量以用于限制性消化和序列分析)。尽管理论上能够无限生长，但这种高拷贝数的基于pmb1的载体毫无疑问在某些时候遇到与特定克隆序列的稳定性和/或插入片段的大小有关的限制。为了改善这些潜在问题，基于细菌人工染色体(bac)的3级终质粒可能允许非常大的组装体的克隆和稳定维持。带有可诱导的复制元件用于拷贝数的按需控制的bac载体，为建造可以在大肠杆菌中稳定维持的大的代谢阵列提供了一种特别有吸引力的方式。为了证实基于bac的多基因组装体的可行性，也在bacv2.0(lucigen,usa)的基础上构建了3级终载体(被命名为pml3-bac)。将所述pml3-bac终载体和克隆在pml3-bac中的衍生的多基因组装体在大肠杆菌bac-optimizedreplicatorv2.0细胞(lucigen,usa)中，在12.5μg/ml氯霉素存在下繁殖。为了诱导高拷贝数，将0.01％l-阿拉伯糖包含在培养基中。midas3级(多基因)组装体在pml3-bac中的构建以与多基因组装体在pml3中的构建完全相同的方式进行，即分别使用克隆在“白色”和“蓝色”pml2穿梭载体中的tu通过交替的aari和bsmbi介导的金门反应。通过顺序装载nptii、paxg、paxc、paxm、paxb、paxp和paxq的tu在pml3-bac中组装了蕈青霉素生物合成途径(图32)，最终质粒(pkv140)带有所有七个tu。选择源自于每个组装反应的菌落用于质粒dna纯化和限制性消化分析，并且显示出每种正确组装的质粒的代表性的限制性消化分析呈现在图33中。将质粒pkv140转化到含有整个pax簇的缺失的蕈青霉(p.paxilli)δpax敲除菌株pn2253(lm662)中，并且在通过tlc筛选的5个遗传霉素抗性株系中，4个显示出在它们的提取物中存在雀稗灵和蕈青霉素两者(图34)。tlc阳性转化体之一的hplc分析鉴定到具有与雀稗灵和蕈青霉素相对应的保留时间的峰(图35，迹线cii)，从而证实了使用基于bac的3级终载体pml3-bac在这种ko菌株中成功恢复了蕈青霉素生物合成途径。在本说明书中引用的表1-15阐述如下：表13.用于真菌提取物的lc-ms分析的多步乙腈梯度。图14.在cdcl3中记录的雀稗灵和蕈青霉素的1h和13cnmr数据。工业实用性本发明的载体组和方法在分子生物学中具有工业实用性，因为它提供了一种操作多核苷酸序列以形成用于生产各种不同的生物化学分子的体外和异源体内表达系统的手段。参考文献1.d.l.cheo等，多个dna区段使用体外位点特异性重组的协调组装和克隆：多区段表达克隆的功能分析(concertedassemblyandcloningofmultiplednasegmentsusinginvitrosite-specificrecombination:functionalanalysisofmulti-segmentexpressionclones)，genomeresearch14,2111-2120(2004)。2.a.kriz等，用于哺乳动物细胞的基于质粒的多基因表达系统(aplasmid-basedmultigeneexpressionsystemformammaliancells)，naturecommunications1,120(2010)。3.c.bieniossek等，用于多蛋白复合体生产的自动无限制多基因重组工程(automatedunrestrictedmultigenerecombineeringformultiproteincomplexproduction)，naturemethods6,447-450(2009)。4.q.j.chen等，missa是用于植物多基因转化的高效体内dna组装方法(missaisahighlyefficientinvivodnaassemblymethodforplantmultiple-genetransformation)，plantphysiology153,41-51(2010)。5.b.s.moriarity等，使用recway组装的转座子可整合多基因载体的模块化组装(modularassemblyoftransposonintegratablemultigenevectorsusingrecwayassembly)，nucleicacidsres41,e92(2013)。6.r.m.horton,h.d.hunt,s.n.ho,j.k.pullen,l.r.pease，在不使用限制性酶的情况下工程化杂合基因——通过重叠延伸的基因剪接(engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes-gene-splicingbyoverlapextension)，gene77,61-68(1989)。7.d.g.gibson等，高达几百个千碱基的dna分子的酶法组装(enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases)，natmethods6,343-345(2009)。8.融合hd克隆试剂盒使用手册(in-fusionhdcloningkitusermanual)，clontechlaboratories,inc.,(2014)。9.b.g.zhu,g.f.cai,e.o.hall,g.j.freeman，融合组装：多结构域融合蛋白、模块化载体和突变的无缝工程(in-fusion(tm)assembly:seamlessengineeringofmultidomainfusionproteins,modularvectors,andmutations)，biotechniques43,356-359(2007)。10.a.rashtchian,g.w.buchman,d.m.schuster,m.s.berninger，聚合酶链反应扩增的dna的尿嘧啶dna糖基化酶介导的克隆——应用于基因组和cdna克隆(uracildnaglycosylase-mediatedcloningofpolymerasechainreaction-amplifieddna-applicationtogenomicandcdnacloning)，analbiochem206,91-97(1992)。11.c.aslanidis,p.j.dejong，pcr产物的不依赖于连接的克隆(lic-pcr)(ligation-independentcloningofpcrproducts(lic-pcr))，nucleicacidsres18,6069-6074(1990)。12.j.garcia-nafria,j.f.watson,i.h.greger，iva克隆：利用细菌体内组装的单管通用克隆系统(ivacloning:asingle-tubeuniversalcloningsystemexploitingbacterialinvivoassembly)，scientificreports6,27459(2016)。13.k.tsuge,k.matsui,m.itaya，多个dna片段以设计的次序和取向在枯草芽孢杆菌质粒中的一步组装(onestepassemblyofmultiplednafragmentswithadesignedorderandorientationinbacillussubtilisplasmid)，nucleicacidsres31,e133(2003)。14.m.itaya,k.fujita,a.kuroki,k.tsuge，使用枯草芽孢杆菌基因组载体的由下至上的基因组组装(bottom-upgenomeassemblyusingthebacillussubtilisgenomevector)，naturemethods5,41-43(2008)。15.z.y.shao,h.zhao,h.m.zhao，dna组装器，一种用于生物化学途径的快速构建的体内遗传方法(dnaassembler,aninvivogeneticmethodforrapidconstructionofbiochemicalpathways)，nucleicacidsres37(2009)。16.h.ma,s.kunes,p.j.schatz,d.botstein，酵母中通过同源重组进行的质粒构建(plasmidconstructionbyhomologousrecombinationinyeast)，gene58,201-216(1987)。17.d.g.gibson等，25个交叠dna片段在酵母中的一步组装以形成完整的合成的生殖支原体基因组(one-stepassemblyinyeastof25overlappingdnafragmentstoformacompletesyntheticmycoplasmagenitaliumgenome)，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica105,20404-20409(2008)。18.v.larionov,n.kouprina,j.graves,m.a.resnick，通过与转化相关的重组克隆从啮齿动物-人类杂合细胞高度选择性分离作为环状酵母人工染色体的人类dna(highlyselectiveisolationofhumand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