抗肺炎克雷伯菌的疫苗的制作方法

发明领域本发明涉及与肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)血清型o3、o3b和/或o5脂多寡糖特别是o抗原有关的通式(i)的合成寡糖及其缀合物。所述的合成寡糖、所述的缀合物和包含所述合成寡糖或所述缀合物的药物组合物可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌相关的疾病，更具体地用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5有关的疾病。此外，通式(i)的合成寡糖可用作免疫测定法中的标记物用于检测抗肺炎克雷伯菌的抗体。发明背景肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的、杆状细菌，其主要建群于呼吸道和泌尿道并引起肺炎克雷伯菌感染(kpi)。kpi是医院性感染的主要原因，主要影响免疫功能低下的患者。在过去的十年中，由于出现了对几乎所有可用的微生物剂都耐药的菌株以及它们在全球范围内传播，肺炎克雷伯菌引起的感染正成为医疗保健领域的一个重要挑战。肺炎克雷伯菌引起的感染导致较高的发病率和死亡率。因此，非常需要预防由肺炎克雷伯菌引起的感染，而对危险群体进行疫苗接种是最有成本效益和最有力的方式。肺炎克雷伯菌典型地在其细胞表面表达两种类型的抗原。第一种，o抗原，为脂多寡糖(lps)的成分，其中存在9个血清型。第二种为k抗原，一种具有超过80个血清型的荚膜多糖/寡糖。o抗原为lps中最可变的部分，并且提供血清学特异性，其与k抗原一起用于血清分型。两种抗原均由细菌表面的复合多糖/寡糖组成，它们具有高度的免疫原性和无毒性。与蛋白质相比，碳水化合物在进化上更稳定。当与载体蛋白共价连接时，寡糖抗原可引起持久的t细胞依赖性保护(microbiolrev1995，591)。对于有关碳水化合物疫苗的最新研发，参见chem.&biol.2014，21，38–50。有关自动化碳水化合物合成及其在基于碳水化合物的疫苗研发中的应用的综述，参见carbohydr.res.2008，343，1889–1896。wo2016/156338a1公开了用于治疗由肺炎克雷伯菌导致的疾病的合成的耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌寡糖及其缀合物。论文vaccine1986，4，15报道了包括k2、k3、k10、k21、k30和k55血清型衍生的荚膜多糖的六价克雷伯菌属(klebsiella)疫苗。发现所测试的疫苗对致命性实验性克雷伯菌属k2烧伤创面脓毒症具有高度预防作用，由此表明在接种疫苗后引发了该功能性抗体。肺炎克雷伯菌的o抗原，即o-多糖的重复单元已被阐明(thejournalofbiologicalchemistry，2002，277(28)、25070-25081)(参见图1)。肺炎克雷伯菌血清型o3的o-多糖的重复单元由：→2)-α-d-man-(1,2)-α-d-man-(1,2)-α-d-man-(1,3)-α-d-man-(1,3)-α-d-man-(1→]m组成。肺炎克雷伯菌血清型o3b的o-多糖的重复单元由：→2)-α-d-man-(1,3)-α-d-man-(1,3)-α-d-man-(1→]m组成。肺炎克雷伯菌血清型o5的o-多糖的重复单元由：→3)-β-d-man-(1,2)-α-d-man-(1,2)-α-d-man-(1→组成。本发明的目的是提供一种明确定义的通式(i)的合成寡糖，其与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和o5脂多糖有关，并包含保护性免疫原性o抗原表位，即引发抗体的o抗原表位，该抗体保护免受肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和血清型o5引起的疾病。所述的寡糖可与免疫原性载体缀合，得到缀合物及其药物组合物，它们可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和血清型o5有关的疾病。此外，通式(i)的合成寡糖可用作免疫测定法中的标记物用于检测抗肺炎克雷伯菌细菌的抗体。通过独立权利要求的教导解决了上述本发明的目的。从本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例中明显可见本发明的其他有利特征、方面和细节。本发明的描述定义本申请中所用的术语“连接基”包括能够任选地通过结合至少一种互连分子而使寡糖的还原端单糖与免疫原性载体或固相支持体连接的分子片段。因此，连接基本身或与互连分子一起的功能是在还原端单糖与免疫原性载体或固相支持体之间建立、保持和/或桥接特定的距离。通过在寡糖与免疫原性载体之间保持一定距离，避免了免疫原性载体的结构(例如，载体蛋白的二级结构)对免疫原性寡糖表位的屏蔽。另外，连接基通过减少反应性基团的位阻而提供了与寡糖偶联的更高效率(methodsinmolecularmedicine2003，87，153-174)。更具体地，连接基的一个末端与还原端单糖的异头中心的环外氧原子连接，而另一个末端通过氮原子与互连分子连接或直接与免疫原性载体或固相支持体连接。在本发明中可以使用本领域中已知的任何寡糖缀合物(例如多糖和寡糖-载体蛋白缀合物，抗体-药物缀合物)的连接基。从大量涉及多糖和寡糖载体蛋白缀合物的出版物中，本领域技术人员可以容易地想到用于本申请中公开的寡糖和缀合物的适合连接基(参见"antimicrobialglycoconjugatevaccines：anoverviewofclassicandmodernapproachesforproteinmodification"inchemsocrev.2018，advancearticle，doi：10.1039/c8cs00495a；accchemres2017，50，1270-1279)，因为使用的连接基，即其长度和键类型，不会显著影响寡糖缀合物的免疫原性(参见plosone2017，12(12)：e0189100，j.immun.meth.1996，191，1-10)。此类适合的连接基是无害的(即无毒性的)和非免疫原性的(即在用缀合物免疫接种时不会导致形成非保护性抗体)并且包括，但不限于可商购的双功能聚乙二醇(journalofcontrolledrelease2013，172，382-389，j.immun.meth.1996，191，1-10)、戊二酸衍生物(j.org.chem.2005，70(18)、7123-7132)、己二酸衍生物、方酸酯衍生物、炔烃、n-羟基琥珀酰亚胺，例如可商购的mfco-nhs(单氟取代的环辛炔n-羟基琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚胺(如accchemres2017，50，1270-1279中所公开的)或亲水性膦酸烷基酯和磺酰类化合物(如wo2014080251a1中所述)。本申请中所用的术语“互连分子”是指包含官能团x和官能团y的双官能分子，其中官能团x能够与连接基l上的末端氨基反应，并且官能团y能够与存在于免疫原性载体或固相支持物上的官能团反应。图3显示了可商购的互连分子的实例，但不将根据本发明可以使用的互连分子限于本申请中所显示的实例。本申请中所用的术语“佐剂”是指免疫佐剂，即疫苗组合物中使用的材料，其通过在抗原上与其不相关的情况下增强对疫苗中所含给定抗原的免疫应答而改进或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，传统上公认的佐剂实例包括：-含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙。铝盐包括氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等，盐采用任意适合的形式(例如凝胶，结晶，无定形等)。优选对这些盐的吸附。也可以将含矿物质的组合物配制成金属盐的颗粒。也可以使用称作氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。本发明可以使用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称作“氢氧化铝”的佐剂典型地为羟基氧化铝，其通常至少部分是结晶。称作“磷酸铝”的佐剂典型地为羟基磷酸铝，通常还含有少量的硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可以通过沉淀获得，且沉淀过程中的反应条件和浓度影响磷酸盐取代盐中羟基的程度。在本发明的制剂中可以使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物；-皂苷，其为一组异源广泛多种植物物种的树皮、叶、茎、根和甚至花中发现的固醇糖苷和三萜糖苷。来自皂树(quillaiasaponaria)的树皮的皂苷已被广泛作为佐剂研究。皂苷也可以从墨西哥菝葜(smilaxornata)(洋菝葜)、锥花丝石竹(gypsophillapaniculata)(bridesveil)和肥皂草(saponariaoficianalis)(皂根)商购。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如qs21，以及脂质制剂，例如iscom。皂苷组合物已使用hplc和rp-hplc纯化。已经鉴定出使用这些技术的特定纯化级分，包括qs7、qs17、qs18、qs21、qh-a、qh-b和qh-c。皂苷制剂还可包含固醇，例如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成被称作免疫刺激复合物(iscom)的独特颗粒。iscom通常包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于iscom。优选地，iscom包括quila、qha&qhc的一种或多种；-由可生物降解且无毒性的材料形成的微粒(即直径为100nm-150pm，更优选直径为200nm-30pm或直径为500nm-10pm的颗粒)。这类无毒性且可生物降解的材料包括，但不限于聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯；-cd1d配体，例如α-糖基神经酰胺、包含植物鞘氨醇的糖基神经酰胺、och、krn7000[(2s,3s,4r)-1-o-(α-d-吡喃半乳糖基)-2-(n-二十六烷酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、crony-101、3"-磺基-半乳糖基-神经酰胺；7dw8-5(funakoshico.，ltd.)-免疫刺激性寡核苷酸，例如包含cpg基元的免疫刺激性寡核苷酸(包含通过磷酸键连接至鸟苷残基的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)，或包含cpi基元的免疫刺激性寡核苷酸(包含与肌苷相连的胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链rna，或包含回文序列的寡核苷酸，或包含聚(dg)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修饰物/类似物，例如硫代磷酸修饰物，并且可以是双链或(rna除外)单链的；-包含与含磷酸酯的无环骨架连接的脂质的化合物，例如tlr4拮抗剂e5564；-油乳剂(例如弗氏(freund)佐剂)，外膜囊泡(omv)。理论上，每种能够在免疫事件的级联中有利于或放大特定情况最终导致更明显的免疫应答的分子或物质都可以被定义为佐剂。通常，通过在疫苗制剂中使用佐剂，人们可以：-指导和优化适合于疫苗或符合疫苗需要的免疫应答；-能够进行疫苗粘膜递送，即导致疫苗与粘膜表面，例如颊或胃或肺上皮以及相关的淋巴组织接触的施用；-促进细胞介导的免疫应答；-增强较弱免疫原的免疫原性，例如高纯化或重组抗原；-减少提供保护性免疫所需的抗原量或免疫接种频率；以及-提高疫苗在免疫应答降低或减弱的个体(例如新生儿、老年人和免疫受损的疫苗接种者)中的效力。尽管对其作用模式知之甚少，但目前认为佐剂可通过以下机制之一增强免疫应答：-增加抗原的生物学或免疫学半衰期；-改善抗原向抗原呈递细胞(apc)的递送以及由apc进行的抗原处理和呈递，例如通过使抗原在apc摄取抗原-佐剂复合物后穿过内体膜进入胞质溶胶；-模拟来自应激或受损细胞的危险诱导信号，这些信号用于引发免疫应答；-诱导免疫调节细胞因子的产生；-使免疫应答偏向免疫系统的特定亚组；以及-阻断抗原攻击的快速扩散。如果它们不是两性离子，本领域技术人员将多糖和寡糖称作ti-2(t细胞非依赖性-2)抗原和差免疫原。因此，为了生产基于多糖、寡糖的疫苗，将所述多糖、寡糖与免疫原性载体缀合以得到缀合物，该缀合物与多糖或寡糖相比具有增加的免疫原性。在本申请的上下文中，将术语“免疫原性载体”定义为与多糖、寡糖缀合以形成缀合物的结构，与所述多糖、寡糖本身相比该缀合物提供增加的免疫性。因此，寡糖与免疫原性载体，优选蛋白质载体的缀合具有刺激针对所述寡糖的免疫应答的作用，而不诱导针对所述免疫原性载体的免疫应答。因此，本发明涉及通式(i)的寡糖t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-t-o-l-e(i)其中m为选自0和1的整数；x为选自1至2×m+3的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；–t–表示价键、–(ux+4)m–(vx+2)1-m–、–(ux+4–ux+3)m–(vx+2–vx+1)1-m–，–(ux+4–ux+3–ux+2)m–或–(ux+4–ux+3–ux+2–ux+1)m–；t*–表示h–、h–(ux)m–(vx)1-m–、h–(ux+1–ux)m–(vx+1–vx)1-m–、h–(ux+2–ux+1–ux)m–或h–(ux+3–ux+2–ux+1–ux)m–；l表示连接基；e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；或其非对映异构体或药学上可接受的盐。连接基l优选包含2-40个碳原子(包括任选侧链的碳原子)，更优选2-30，更优选2-20，更优选2-14，更优选2-12且还更优选2-10个碳原子。氧原子(即–o–l–e的氧)与e基团之间的最短原子链优选由2-14个原子，更优选为2-12个原子，更优选为2-10个原子，更优选2-8个原子组成。如果最短的链(其为异头中心的氧与nh2基团之间的最短可能连接)由2-6个原子组成，则它们优选为碳原子。如果最短链由4-8个原子组成，则该链可以包含1或2个选自o、n和s的杂原子。如果最短链由9-14个原子组成，则该链可以包含1、2、3或4个选自o、n和s的杂原子。还优选的是，连接基–l–或最短的链是完全或部分氟化的。连接基–l–可以包含3元或4元或5元或6元饱和碳环，或5元部分不饱和(而不是芳香族)碳环，或4元或5元或6元饱和氧杂环，或4元或5元或6元饱和氮杂环，或6元芳族碳环。连接基–l–还可以包含酰胺(–nh–co–，–co–nh–)和/或脲(–nh–co–nh–)残基，且优选仅一个酰胺或脲残基。连接基还可以包含取代基，且优选2个取代基，例如r10和r11；或4个取代基，例如r10、r11、r15和r14，其具有本申请中所定义的含义，并且优选选自：–f、–cl、–ch3、–c2h5、–c3h7、–c5h9、–c6h13、–och3、–oc2h5、–ch2f、–chf2、–cf3、–c(o)–nh2、–sch3、–sc2h5、–nhc(o)ch3、–n(ch3)2和–n(c2h5)2。在连接基–l–被氟化的情况中，优选超过2个取代基–f。优选地，连接基–l–选自：–ch2–、–(ch2)2–、–(ch2)3–、–(ch2)4–、–(ch2)5–、–(ch2)6–、–(ch2)7–、–(ch2)8–、–(ch2)9–、–(ch2)10–、–cf2–、–(cf2)2–、–(cf2)3–、–(cf2)4–、–(cf2)5–、–(cf2)6–、–(cf2)7–、–(cf2)8–、–(cf2)9–、–(cf2)10–、–(ch2)2–o–(ch2)2–、–ch2–o–(ch2)3–、–(ch2)3–o–ch2–、–ch2–o–(ch2)2–、–(ch2)2–o–ch2–、–(ch2)3–o–(ch2)2–、–(ch2)2–o–(ch2)3–、–(ch2)4–o–ch2–、–ch2–o–(ch2)4–、–la–、–la–le–、–la–lb–le–、–la–lb–ld–lc–le–、–la–ld–le–；其中–la–选自：–(ch2)o–、–(cf2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–、–(ch2–ch2–o)o–ch2–、–(cr10r11)o–、–lb–和–lc–彼此独立地选自：–o–、–nh–c(o)–nh–、–nh–c(s)–nh–、–nh–c(o)–、–c(o)–nh–、–nh–c(o)–o–、–nr9–、–nr18–、–so2–、–nh–co–ch2–nh–、–ld–表示–(ch2)q–、–(cf2)q–、–(cr12r13)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–、–(ch2–ch2–o)q–ch2–、–le–选自：–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–、–(ch2)p1–o–(ch2)p2–、–(cr14r15)p1–、–(cr14r15)p1–o–(cr21r22)p2–、r9和r18彼此独立地选自：–ch3、–c2h5、–c3h7和–c(o)ch3；r10、r11、r12、r13、r14、r15、r16、r17、r19、r20、r21和r22彼此独立地选自：–h、–f、–cl、–ch3、–c2h5、–c3h7、–c5h9、–c6h13、–och3、–oc2h5、–ch2f、–chf2、–cf3、–c(o)–nh2、–sch3、–sc2h5、–nhc(o)ch3、–n(ch3)2和–n(c2h5)2；o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数。更优选的，–l–表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1-o-(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。最优选的，通式(i)的寡糖具有基团–o-l-e，其选自：其中r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或-(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；x表示-br、-cl、-i、-co2h或-sac。因此，优选的是通式(i)的寡糖t*-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-t-o-l-e(i)其中m为选自0和1的整数；x为选自1至2×m+3的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；优选n为选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数；更优选n为选自1、2、3、4、5和6的整数；还更优选n为选自1、2、3和4的整数；还更优选n为选自1、2和3的整数；还更优选n为选自1和2的整数；–t–表示价键、–(ux+4)m–(vx+2)1-m–、–(ux+4–ux+3)m–(vx+2–vx+1)1-m–、–(ux+4–ux+3–ux+2)m–或–(ux+4–ux+3–ux+2–ux+1)m–；t*–表示h–、h–(ux)m–(vx)1-m–、h–(ux+1–ux)m–(vx+1–vx)1-m–、h–(ux+2–ux+1–ux)m–或h–(ux+3–ux+2–ux+1–ux)m–；l表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；或其非对映异构体或药学上可接受的盐。本发明的寡糖的异头物意指与基团–o-l-e结合的c-1位上的α/β异头物。对于碳水化合物化学领域的普通技术人员清楚的是，糖苷键的立体化学由针对通式(i)中糖片段u1、u2、u3、u4、u5、u6、u7、u8、u9、v1、v2、v3、v4和v5的异头中心所显示的立体化学定义。本发明的寡糖可以是吸湿性的，且由此可以构建其各种水合物。优选的，水分子与寡糖的摩尔比在1-20的范围内，更优选的，在1-10的范围内，最优选的，在5-10的范围内。本发明的寡糖可以带有碱性和/或酸性取代基，并且它们可以与有机或无机酸或碱形成盐。用于这种酸加成盐形成的适合的酸的实例为盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，对氨基水杨酸，苹果酸，富马酸，琥珀酸酸，抗坏血酸，马来酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡糖酸，乳酸，酒石酸，羟基马来酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，对氨基苯甲酸酸，对羟基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亚硝酸，羟基乙磺酸，乙烯磺酸，对甲苯磺酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，樟脑磺酸，瓷器(china)酸，扁桃酸，邻甲基扁桃酸，氢苯磺酸酸，苦味酸，己二酸，d-邻甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(邻、间、对)-甲基苯甲酸，萘胺磺酸和本领域技术人员熟知的其他无机酸或羧酸。通过使游离碱形式与足量的期望的酸接触以常规方式产生盐，制备所述的盐。合适的无机或有机碱的实例是，例如，naoh、koh、nh4oh、氢氧化四烷基铵、赖氨酸或精氨酸等。可以使用本领域中公知的方法以常规方式，例如通过用选自上述组的碱的溶液处理通式(i)的化合物的溶液，制备盐。对于碳水化合物化学领域的技术人员清楚的是，通式(i)的寡糖不包含–o–o–键和或糖片段(ux、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2)，其通过它们的异头碳或c-1碳相互连接或结合。令人惊奇地，发现通式(i)的寡糖包含免疫原性保护表位，并能够诱导针对人和/或动物宿主中肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5细菌的保护性免疫应答。通式(i)的寡糖引发抗体，该抗体与脂多糖的天然肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5抗原交叉反应，特异性识别肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o细菌并调理它们以被吞噬细胞杀灭，因此提供对肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5细菌的防护作用。本发明的寡糖克服了与从细菌来源生产的多糖、寡糖及其缀合物在纯度和生产简便性方面的所有问题。熟知的是，从致病菌的脂多糖的o抗原中分离和纯化确定长度和结构的纯寡糖是一个繁琐且有时不可行的过程。首先，脂多糖o抗原的生产需要优化生长条件。其次，需要找到维持构成单糖的结构完整性的解聚条件。最终，需要确定能够分离出确定长度和结构的纯多糖、寡糖的纯化条件。除常见的污染物，例如细胞多糖、核酸、脂质和蛋白质以外，还必须排除通过解聚过程获得的不需要的寡糖。因此，从细菌来源生产确定结构和长度的纯寡糖是一个繁琐、几乎不可能的过程。优选的是通式(ii)的合成寡糖t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-o-l-e(ii)其中m、n、x、l、e、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2和t*具有本申请中所定义的含义。优选的是通式(ia)和(iia)，t＊-[(vx+2-vx+1-vx)]n-t-o-l-e(ia)t＊-[(vx+2-vx+1-vx)]n-o-l-e(iia)其中x为选自1、2和3的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；优选n为选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数；更优选n为选自1、2、3、4、5和6的整数；还更优选n为选自1、2、3和4的整数；还更优选n为选自1、2和3的整数；还更优选n为选自1和2的整数；–t–表示价键、–(ux+4)m–(vx+2)1-m–、–(ux+4–ux+3)m–(vx+2–vx+1)1-m–、–(ux+4–ux+3–ux+2)m–或–(ux+4–ux+3–ux+2–ux+1)m–；t*–表示h–、h–(ux)m–(vx)1-m–、h–(ux+1–ux)m–(vx+1–vx)1-m–、h–(ux+2–ux+1–ux)m–orh–(ux+3–ux+2–ux+1–ux)m–；l表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；或其非对映异构体或药学上可接受的盐。还优选的是通式(ib)和(iib)，t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)]n-t-o-l-e(iib)t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)]n-o-l-e(iib)其中x为选自1、2、3、4和5的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；优选n为选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数；更优选n为选自1、2、3、4、5和6的整数；还更优选n为选自1、2、3和4的整数；还更优选n为选自1、2和3的整数；还更优选n为选自1和2的整数；–t–表示价键、–(ux+4)m–(vx+2)1-m–、–(ux+4–ux+3)m–(vx+2–vx+1)1-m–、–(ux+4–ux+3–ux+2)m–或–(ux+4–ux+3–ux+2–ux+1)m–；t＊–表示h–、h–(ux)m–(vx)1-m–、h–(ux+1–ux)m–(vx+1-vx)1-m–、h–(ux+2-ux+1-ux)m–或h–(ux+3–ux+2–ux+1–ux)m–；l表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2-ch2–o)o-c2h4–或-(ch2–ch2–o)o-ch2；-lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q-c2h4–或-(ch2–ch2–o)q–ch2-；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；或其非对映异构体或药学上可接受的盐。还优选的是通式(ic)的寡糖h-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-o-l-e(ic)其中m为选自0和1的整数；x为选自1至2×m+3的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；优选n为选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数；更优选n为选自1、2、3、4、5和6的整数；还更优选n为选自1、2、3和4的整数；还更优选n为选自1、2和3的整数；还更优选n为选自1和2的整数；l表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；或其非对映异构体或药学上可接受的盐。因此，尤其优选通式(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)或(ii-k)的寡糖，其中n、l、e和t*具有本申请中所定义的含义。还优选的是通式(iii)的合成寡糖t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-(ux+4)m-(vx+2)1-m-o-l-e(iii)其中m、n、x、l、e、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2和t*具有本申请中所定义的含义。因此，尤其优选通式(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)和(iii-k)的寡糖，其中n、l、e和t*具有本申请中所定义的含义。其中n、l和e具有本申请中所定义的含义。优选地，整数x表示1，因此，尤其优选通式(i)、(ii)或(iii)的化合物，其中x表示1。甚至更优选的是通式(i)、(ii)或(iii)的化合物，其中x表示1，且t*表示h–。还优选通式(i)、(ii)或(iii)的化合物，其中t*表示h–。优选地，n表示选自2-10的整数，优选选自1-8，更优选选自1-6，还更优选选自1-4，还更优选选自1-3，还更优选为1或2。因此，尤其优选通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖，其中n表示选自2-10的整数。在一个可替代性选择的实施方案中，所述的整数优选1。因此，还优选通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖，其中n表示1。优选地，连接基–l–表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。因此，尤其优选通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)中任意一个的寡糖，其中–l–表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数，且优选选自1、2、3和4的整数。还优选通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)中任意一个的寡糖，其中–l–选自：–la–、–la–le–、–la–lb–le–和–la–ld–le–；–la–选自：–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–、–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–选自：–(ch2)q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–和–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–选自：–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–和–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选选自1、2、3和4的整数；且n表示1。甚至更优选的是通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖，其中–l–表示–(ch2)o–且o为选自2、3、4、5和6的整数。还优选的是通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖，其中–l–表示–(ch2)o–，o为选自2、3、4、5和6的整数，且n表示1。在一个更优选的实施方案中，–o-l-e选自：其中r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；x表示–br、–cl、–i、–co2h或–sac。特别优选的，–o-l-e选自：特别优选的是通式(ii-a)的寡糖，其中t*表示–h，且–o-l-e选自：特别优选的是通式(ii-f)的寡糖，其中t*表示–h，且–o-l-e选自：另外优选的是通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖，其中–l–表示–(ch2)o–，o为选自2、3、4、5和6的整数e表示氨基。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的寡糖选自：化学合成本发明的另一方面涉及合成通式(i)的寡糖的方法：t＊-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-t-o-l-e(i)其中m为1；x为选自1至2×m+3的整数；n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；–t–表示价键；t*–表示h；l表示连接基；e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–cor′、–conh–nh2、–sh或–sac；r′表示–h、–me、–et、4-硝基苯基、五氟苯基、–n-羟基琥珀酰亚氨基、–(3-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)或–(二苯并环辛炔-磺基-n-羟基琥珀酰亚氨基)；该方法包括下列步骤：a1)提供单糖1其中p1、p2和p4表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；a2)用结构单元2在活化剂存在下处理单糖1其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；a3)进行除去保护基p3；a4)在活化剂存在下用结构单元3处理步骤a3)的产物其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；a5)进行除去保护基p6；a6)重复步骤a4)和a5)两次，得到中间体化合物4a；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；a7)任选地按照以下次序a2)→a3)→a2)→a3)→a4)→a5)→a6)重复步骤a2)–a6)n-1次，得到式5a的中间体化合物，其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；a8)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：b1)提供单糖1其中p1、p2和p4表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；b2)用结构单元3在活化剂存在下处理单糖1其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；b3)进行除去保护基p6；b4)重复步骤b2)和b3)两次；b5)在活化剂存在下用结构单元2处理步骤b4)的产物其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；b6)进行除去保护基p3，得到中间体化合物4b；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；b7)任选地按照以下次序b5)→b6)→b2)→b3)→b4)→b5)→b6)重复步骤b2)–b6)n-1次，得到式的中间体化合物5b其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；b8)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：c1)提供单糖6其中p1、p2和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；c2)在活化剂存在下用结构单元3处理单糖6其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；c3)进行除去保护基p6；c4)在活化剂存在下用结构单元2处理步骤c3)的产物其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；c5)进行除去保护基p3；c6)重复步骤c4)和c5)；c7)重复步骤c2)和c3)，得到中间体化合物4d；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；c8)任选地按照以下次序c2)→c3)→c2)→c3)→c4)→c5)→c6)→c7)重复步骤c2)–c7)n-1次，得到式5d的中间体化合物其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；c9)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：d1)提供单糖6其中p1、p2和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；d2)在活化剂存在下用结构单元3处理单糖6其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；d3)进行除去保护基p6；d4)重复步骤d2)和d3)；d5)在活化剂存在下用结构单元2处理步骤d4)的产物其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；d6)进行除去保护基p3；d7)重复步骤d5)和d6)，得到中间体化合物4c；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；d8)任选地按照以下次序d2)→d3)→d4)→d4)→d5)→d6)→d7)重复步骤d2)–d7)n-1次，得到式5c的中间体化合物，其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；d9)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：e1)提供单糖6其中p1、p2和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；e2)在活化剂存在下用结构单元2处理单糖6其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；e3)进行除去保护基p3；e4)重复步骤e2)和e3)；e5)在活化剂存在下用结构单元3处理步骤e4)的产物其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；e6)进行除去保护基p6；e7)重复步骤e5)和e6)，得到中间体化合物4e；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；e8)任选地按照以下次序e5)→e6)→e2)→e3)→e4)→e5)→e6)重复步骤e2)–e6)n-1次，得到式5e的中间体化合物，其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n，e和l具有本申请中所定义的含义；e8)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：f1)提供单糖7其中p7、p8和p9表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；f2)在活化剂存在下用结构单元8处理单糖7其中p7–p10表示保护基，且lg3表示离去基；f3)进行除去保护基p10；f4)在活化剂存在下用结构单元9处理步骤f3)的产物其中p7、p8、p11和p12表示保护基，且lg4表示离去基；f5)进行除去保护基p11，得到中间体化合物4f；其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；f6)任选地按照以下次序f2)→f3)→f2)→f4)→f5)重复步骤f2)–f5)n-1次，得到式5f的中间体化合物，其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；f7)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：g1)提供单糖7其中p7、p8和p9表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；g2)在活化剂存在下用结构单元9处理单糖7其中p7、p8、p11和p12表示保护基，且lg4表示离去基；g3)进行除去保护基p11；g4)在活化剂存在下用结构单元8处理步骤g3)的产物其中p7–p10表示保护基，且lg3表示离去基；g5)进行除去保护基p10，得到中间体化合物4g；其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；g6)任选地按照以下次序g4)→g5)→g2)→g3)→g4)→g5)重复步骤g2)–g5)n-1次，得到式5g的中间体化合物，其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；g7)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：h1)提供单糖10其中p7、p8和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；h2)在活化剂存在下用结构单元8处理单糖10其中p7–p10表示保护基，且lg3表示离去基；h3)进行除去保护基p10；h4)重复步骤h2)和h3)，得到中间体化合物4h；其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；h5)任选地在活化剂存在下用结构单元9处理化合物4h其中p7、p8、p11和p12表示保护基，且lg4表示离去基，进行除去保护基p11和进行步骤h2)–h4)n-1次，得到式5h的中间体化合物其中p7–p9和p12表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；h6)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：i1)提供单糖1其中p1、p2和p4表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；i2)用结构单元2在活化剂存在下处理单糖1其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；i3)进行除去保护基p3；i4)在活化剂存在下用结构单元3处理步骤i3)的产物其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；i5)进行除去保护基p6，得到中间体化合物4i；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；i6)任选地按照以下次序i2)→i3)→i2)→i3)→i4)→i5)重复步骤i2)–i5)n-1次，得到式5i的中间体化合物其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；i7)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：j1)提供单糖1其中p1、p2和p4表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；j2)在活化剂存在下用结构单元3处理单糖1其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基；j3)进行除去保护基p6j4)在活化剂存在下用结构单元2处理步骤j3)的产物其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；j5)进行除去保护基p3，得到中间体化合物4j；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；j6)任选地按照以下次序j4)→j5)→j2)→j3)→j4)→j5)重复步骤j2)–j5)n-1次，得到式5j的中间体化合物其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；j7)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。合成通式(i)的寡糖的另一种方法包括下列步骤：k1)提供单糖6其中p1、p2和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；k2)在活化剂存在下用结构单元2处理单糖6其中p1–p4表示保护基，且lg1表示离去基；k3)进行除去保护基p3；k4)重复步骤k2)和k3)，得到中间体化合物4k；其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中e和l具有本申请中所定义的含义；k5)任选地在活化剂存在下用结构单元3处理化合物4k其中p1、p2、p5和p6表示保护基，且lg2表示离去基，进行除去保护基p6和重复步骤k2)–k4)n-1次，得到式5k的中间体化合物其中p1、p2、p4和p5表示保护基，且c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，其中n、e和l具有本申请中所定义的含义；k7)进行除去全部保护基，得到通式(i)的寡糖。ep表示固相支持体或被保护的末端基团。e表示–nh2、–n3、–cn、–o–nh2、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–conhnh2、–sh或–sac；且相应的被保护的末端基团ep表示-n(p13)(p14)、–n3、–cn、–o–n(p13)(p14)、–ch＝ch2、–c≡ch、–br、–cl、–i、–co2r′、–conhn(p13)(p14)、–sps或–sac。p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10、p11、p12、p13和p14表示保护基。本申请中所用的术语“保护基”是指有机合成中通常使用的常用基团，优选用于保护羟基和巯基。更优选地，p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10、p11和p12为适合的羟基保护基，更优选羟基的不同适合的保护基，其在随后通过适合的脱保护反应顺序一个接一个地被除去。优选的羟基保护基为乙酰基、苯基、苄基、亚异丙基、亚苄基、苯甲酰基、对-甲氧基苄基、对-甲氧基亚苄基、对-甲氧基苯基、对-溴亚苄基、对-硝基苯基、烯丙基、乙酰基、异丙基、对-溴苄基、二甲氧基三苯甲基、2-萘基甲基、新戊基、(2-硝基苯基)乙酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基、甲氧基甲基、叔丁氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙酰丙酰基。保护基可以区分为永久保护基和临时保护基。永久保护基是在整个合成过程中稳定并且可以在合成后期被有效地除去的保护基。在这种情况下，永久保护基包括p1、p2、p4p5、p7、p8、p9、p12、p13和p14。p1、p2、p4、p5、p7、p8、p9和p12在整个合成过程中掩蔽羟基，而保护基p13和p14掩蔽存在于末端基团ep上的末端氨基。优选保护基p1、p2、p5、p7、p8和p9为苄基，保护基p4为苯甲酰基，保护基p12为苄基，保护基p13为苄基，且保护基p14为苄氧羰基(cbz)。临时保护基通常是正交保护基团，其可以在合成的不同水平上选择性地被除去以游离羟基，用于随后引入不同的取代基，包括单寡糖、其他保护基或存在于分子上的其他残基。在这种情况下，临时保护基包括p3、p6、p10和p11。保护基的巧妙选择能够便利得到通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖库，其被末端基团官能化，用于随后与免疫原性载体或固相支持体缀合。此外，离去基的选择影响步骤a2)、a4)、b2)、b5)、c2)、c4)、d2)、d5)、e2)、e5)、f2)、f4)、h2)、h5)、j2)、j4)、i2)、i4)、k2)和k5)中的糖基化反应的立体化学结果。从现有技术中本领域技术人员选择保护基和反应条件以获得期望的通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的甘露糖寡糖是明显可见的(参见j.chem.soc.、perkintrans.1，2000，1471–1491和eur.j.org.chem.2009，870–888)。临时保护基p3、p6、p10和p11优选选自，但不限于：烯丙基、对甲氧基苄基、2-萘基甲基、三-异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基和乙酰丙酰基。优选地，保护基p3、p6、p10和p11可以在保护基p1、p2、p4p5、p7、p8、p9、p12、p13和p14存在下选择性地被除去。优选地，p3、p6、p10和p11为9-芴基甲氧基羰基或乙酰丙酰基，且更优选p3和p11相同，且p6和p10相同。在一个优选的实施方案中，保护基p6和p10表示9-芴基甲氧基羰基，且保护基p3和p11表示-芴基甲氧基羰基或乙酰丙酰基。结构单元2、3、8和9为糖基化剂。本申请中所用的术语糖基化剂是指在异头位置被离去基官能化的单糖，所述的离去基在活化时与适合的活化剂一起得到能够与亲核体例如羟基反应的氧碳鎓中间体。因此，糖基化剂2、3、8和9在异头位置上被离去基lg1、lg2、lg3和lg4官能化。适合于本发明合成的离去基的实例是碳水化合物化学领域的技术人员熟知的，并且包括卤化物，硫醚，亚氨酸酯，乙酸酯，亚砜，戊烯基和磷酸酯。优选地，离去基lg1、lg2、lg3和lg4选自由如下各项组成的离去基组：如上所述，氧碳鎓中间体的提供依赖于用适合的或适宜的活化剂活化在糖基化剂的异头位置安装的离去基。本领域技术人员公知，磷酸酯的适合活化剂(即磷酸酯活化剂)和亚氨酸酯的适合活化剂(即亚氨酸酯活化剂)是路易斯酸，例如三氟甲磺酸甲硅烷基酯或三氟甲磺酸银，而硫醚的适合活化剂即硫醚活化剂包括，但不限于：nis/tfoh、nis/tmsotf、nis/bf3.et2o、nis/agotf、dmtst/tf2o、idpc、bsp/tf2o、ph2so/tf2o。三氟甲磺酸甲硅烷基酯的实例包括，但不限于三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯、三氟甲磺酸三异丙酯。优选地，lg1、lg2、lg3和lg4为硫醚且甚至更优选是在lg1、lg2、lg3和lg4选自由如下各项组成的组时：优选步骤a2)、a4)、b2)、b5)、c2)、c4)、d2)、d5)、e2)、e5)、f2)、f4)、g2)、g4)、h2)、h5)、j2)、j4)、i2)、i4)、k2)和k5)中寡糖之间的偶联反应通过在非极性溶剂和极性疏质子溶剂的混合物中用nis/tfoh或tmsotf活化来进行，温度在-78℃或-50℃至0℃之间或–10℃和+10℃之间。甚至更优选的是所述反应在非极性溶剂和极性疏质子溶剂的混合物中通过用nis/tfoh处理在约0℃的温度下进行。优选的极性疏质子溶剂是四氢呋喃、乙醚和二噁烷。优选的非极性溶剂是甲苯、卤代溶剂，例如氯仿和二氯甲烷。非极性和极性疏质子溶剂的优选混合物为：二氯甲烷/四氢呋喃，二氯甲烷/乙醚，甲苯/乙醚，甲苯/四氢呋喃。在步骤a8)、b8)、c9)、d9)、e8)、f7)、f4)、g7)、h8)、i7)、j7)和k7)进行的除去保护基p1、p2、p4p5、p7、p8、p9、p12、p13和p14包括：-通过任选地在过氧化氢存在下在溶剂混合物中用碱处理首先裂解对碱不稳定的保护基。优选地，所述的碱为naome或lioh；并且-通过使化合物在钯催化剂存在下于溶剂混合物中经接触第二次裂解对氢化敏感的保护基。本发明的另一方面涉及用于制备通式(i)、(ii)、(ii-a)、(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f)、(ii-g)、(ii-h)、(ii-i)、(ii-j)、(ii-k)、(iii)、(iii-a)、(iii-b)、(iii-c)、(iii-d)、(iii-e)、(iii-f)、(iii-g)、(iii-h)、(iii-i)、(iii-j)或(iii-k)的寡糖的中间体化合物，其中该中间体化合物具有通式(i2a)、(i2b)、(i2c)、(i2d)、(i2e)、(i2f)、(i2g)、(i2h)、(i3a)、(i3b)、(i3c)、(i3d)、(i3e)、(i3f)、(i3g)、(i3h)、(i3i)、(i3j)、(i3k)、(i3l)、(i3m)、(i3n)、(i4a)、(i4b)、(i4c)、(i4d)、(i4e)、(i4f)、(i4g)、(i4h)、(i4i)、(i4j)、(i5a)、(i5b)、(i5c)、(i5d)、(i5e)、(i5f)、(i5g)、(i5h)、(i5i)或(i5j)中的任意一个：其中c表示–l–ep，ep为固相支持体或被保护的末端基团e，p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10、p11和p12表示保护基，且e和l具有如上所定义的相同含义。在式(i2a)、(i2b)、(i2c)、(i2d)、(i2e)、(i2f)、(i2g)、(i2h)、(i3a)、(i3b)、(i3c)、(i3d)、(i3e)、(i3f)、(i3g)、(i3h)、(i3i)、(i3j)、(i3k)、(i3l)、(i3m)、(i3n)、(i4a)、(i4b)、(i4c)、(i4d)、(i4e)、(i4f)、(i4g)、(i4h)、(i4i)、(i4j)、(i5a)、(i5b)、(i5c)、(i5d)、(i5e)、(i5f)、(i5g)、(i5h)、(i5i)或(i5j)中，优选地，连接基–l–表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–或–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；以及o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。尤其优选的中间体为式(i2a)、(i2b)、(i2c)、(i2d)、(i2e)、(i2f)、(i2g)、(i2h)、(i3a)、(i3b)、(i3c)、(i3d)、(i3e)、(i3f)、(i3g)、(i3h)、(i3i)、(i3j)、(i3k)、(i3l)、(i3m)、(i3n)、(i4a)、(i4b)、(i4c)、(i4d)、(i4e)、(i4f)、(i4g)、(i4h)、(i4i)、(i4j)、(i5a)、(i5b)、(i5c)、(i5d)、(i5e)、(i5f)、(i5g)、(i5h)、(i5i)或(i5j)的中间体，其中–l–表示–(ch2)o–，且o为选自2、5和6的整数。p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10、p11和p12为羟基的适合保护基，更优选羟基的不同适合保护基，其在随后能够通过适合的脱保护反应顺序一个接一个被除去。优选的羟基保护基为乙酰基、苯基、苄基、亚异丙基、亚苄基、苯甲酰基、对-甲氧基苄基、对-甲氧基亚苄基、对-甲氧基苯基、对-溴亚苄基、对-硝基苯基、烯丙基、乙酰基、异丙基、对-溴苄基、二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊基、(2-硝基苯基)乙酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基、甲氧基甲基、叔丁氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙酰丙酰基。因此，当保护基p1、p2、p5、p7、p8和p9为苄基、保护基p3、p6、p10和p11为9-芴基甲氧基羰基或乙酰丙酰基、p4和p12为苯甲酰基、保护基p13为苄基且保护基p14为苄氧基羰基(cbz)时，尤其优选中间体(i2a)、(i2b)、(i2c)、(i2d)、(i2e)、(i2f)、(i2g)、(i2h)、(i3a)、(i3b)、(i3c)、(i3d)、(i3e)、(i3f)、(i3g)、(i3h)、(i3i)、(i3j)、(i3k)、(i3l)、(i3m)、(i3n)、(i4a)、(i4b)、(i4c)、(i4d)、(i4e)、(i4f)、(i4g)、(i4h)、(i4i)、(i4j)、(i5a)、(i5b)、(i5c)、(i5d)、(i5e)、(i5f)、(i5g)、(i5h)、(i5i)或(i5j)。糖缀合物本发明的另一方面涉及包含通式(i)的寡糖的缀合物，所述的寡糖通过–o–l–e基团的末端基团e共价结合或共价连接至免疫原性载体。换句话说，本发明的另一方面涉及通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)中任意一个的寡糖，其通过–o–l–e基团的末端基团e与免疫原性载体缀合。还将包含通过–o–l–e基团的末端基团e共价结合或共价连接至免疫原性载体的通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)的合成寡糖的缀合物定义为通过使通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)中任意一个的寡糖与免疫原性载体反应得到的缀合物。令人惊奇地，该缀合物作为对抗与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5细菌相关的疾病的免疫接种用疫苗被证实有效。寡糖被本领域技术人员公知为一般ti-2(t细胞不依赖性-2)抗原和差免疫原性。ti-2抗原为抗原，其仅被成熟的b细胞通过表面暴露的免疫球蛋白受体的交联识别。没有t细胞的帮助，就不会产生免疫记忆，既不会发生从igm到其他igg亚类的同种型转换，也不会发生b细胞亲和力成熟。此外，由于与人糖脂和糖蛋白的结构同源性，已知寡糖在人体内的免疫原性较差。由于它们的免疫原性差，所以寡糖表现出产生b细胞产生的抗体以及形成记忆细胞的能力差，这是生产有效疫苗必不可少的特征。因此，为了生产一种有效的基于寡糖的疫苗，使通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)的寡糖与免疫原性载体缀合，提供与寡糖相比免疫原性增加的缀合物。因此，在本申请的范围内还涵盖了包含如下寡糖片段的缀合物。t*-[(-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m]n-t-o-其中m、n、x、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2、t和t*具有本申请中所定义的含义，其通过o原子共价连接至免疫原性载体。所述的缀合物包含通式(i)的至少一种合成寡糖以及与该至少一种寡糖(i)共价结合的免疫原性载体。令人惊讶地发现，用包含共价连接至免疫原性载体的通式(i)的寡糖的缀合物免疫接种导致产生高滴度的对通式(i)的寡糖的碳水化合物部分具有特异性的抗体。所述的抗体与天然肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5脂多寡糖交叉反应并且呈现调理素吞噬作用和杀菌活性，因此赋予对肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5细菌的防护作用。在本说明书的上下文中，将术语“免疫原性载体”定义为与寡糖缀合以形成缀合物的结构，与寡糖本身相比，该缀合物呈现增加的免疫原性。因此，通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)的寡糖与免疫原性载体的缀合具有刺激针对通式(i)的寡糖的免疫应答的作用，而不会诱导针对所述免疫原性载体的免疫应答。优选的免疫原性载体为具有免疫调节特性的载体蛋白或鞘糖脂。对于本领域技术人员而言，载体蛋白为选自由以下各项组成的组的蛋白质：白喉类毒素，突变的白喉类毒素，修饰的白喉类毒素，突变和修饰的白喉类毒素，破伤风类毒素，修饰的破伤风类毒素，突变的破伤风类毒素，无法分类的流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)非脂化细胞表面脂蛋白(蛋白质d)，脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)的外膜蛋白(omp)复合物，牛血清白蛋白(bsa)，匙眼帽贝血蓝蛋白(klh)，重组无毒性形式的铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)外毒素a(repa)或霍乱类毒素(ct)。本申请中所用的术语“类毒素”是指细菌毒素(通常是外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理被灭活或抑制，而其他特性，典型地为免疫原性得以维持。本申请中所用的突变的类毒素为重组细菌毒素，其已通过修饰野生型氨基酸序列而被改变为毒性较低乃至无毒性。这种突变可以是一个或多个氨基酸的替换。这种突变的类毒素在其表面上存在官能团，该官能团可以与互连分子的官能团y反应而得到修饰的类毒素。所述的官能团是本领域技术人员已知的，并且包括，但不限于赖氨酸残基的伯氨基官能团(其可以在还原剂的存在下与活化的酯，异氰酸酯基或醛反应)、可以被碳二亚胺活化的谷氨酸或天冬氨酸残基的羧酸酯官能团或半胱氨酸残基的巯基官能团。活化的酯包括n-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-gmbs)，琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-siab)，琥珀酰亚氨基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(sbap)，谷氨酸二琥珀酰亚胺酯(dsg)，己二酸二琥珀酰亚胺酯(dsa)，2-吡啶基二硫酚-四氧杂十四烷-n-羟基琥珀酰亚胺(peg-4-spdp)(参见图2)。可以将载体蛋白上的半胱氨酸残基转化为相应的脱氢丙氨酸，然后可以使其与适合的互连分子进一步反应，得到在其表面上具有该互连分子的官能团x的修饰的载体蛋白。特别优选的是，通式i的寡糖与作为赖氨酸残基伯胺官能团的官能团呈现的无毒性的突变白喉毒素crm197缀合。crm197如野生型白喉毒素为由两个亚基组成的535个氨基酸的单个多肽链(58kd)，所述的亚基通过二硫键连接，具有谷氨酸替换甘氨酸的单个氨基酸替换。其用作许多被批准用于疾病的结合疫苗，例如肺炎球菌联合菌苗(prevnar)中的载体蛋白。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，所述的载体蛋白在其表面上存在赖氨酸残基的伯氨基官能团，其能够与所述互连分子的官能团y反应而得到在其表面上具有所述互连分子的所述官能团x的修饰的载体蛋白，其能够与通式(i)化合物的连接基的末端氨基反应。互连分子的所述官能团x选自马来酰亚胺；α-碘乙酰基；α-溴乙酰基；以及n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)，醛，亚氨酸酯，羧酸，磺酸烷基酯，磺酰氯，环氧化物，酸酐，碳酸酯(参见图3)。优选地，通式i的寡糖与用马来酰亚胺修饰的无毒性突变白喉毒素crm197缀合。在另一个优选的实施方案中，通式i的寡糖与用α-溴乙酰胺修饰的无毒性突变的白喉毒素crm197缀合。在最优选的实施方案中，通式i的寡糖与用n-羟基琥珀酰亚胺己二酸酯修饰的无毒性突变的白喉毒素crm197缀合。优选的是通式(iv)的缀合物[t＊-((-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m)n-t-o-l-e1-w]c-cp(iv)其中c包含2-18；–e1–表示共价键、–nh–、–o–nh–、-o-、-s-、-co-、-ch＝ch-、-conh-、–co-nhnh-、-w-选自：a表示选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，b表示选自1、2、3和4的整数，cp为载体蛋白；以及m、n、x、l、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2、t和t*具有本申请中所定义的含义。优选e1为共价键、-nh–、–ch＝ch–、–conh–，优选cp为crm197。因此，在本发明的一个实施方案中，所述的缀合物具有通式(iv)，其中cp为crm197，且c、–e1–、w、m、n、x、l、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1、vx+2、t和t*具有本申请中所定义的含义。优选地，在通式(iv)中，连接基–l–选自：–la–、–la–le–、–la–lb–le–和–la–ld–le–；–la-选自：-(ch2)o-、-(ch2-ch2-o)o-c2h4-、-(ch2-ch2-o)o-ch2；-lb-表示-o-、-nh-co-nh-、-nh-co-ch2-nh–、–nh–co–；–ld–选自：–(ch2)q–、-(cf2)q-、-(ch2-ch2-o)q-c2h4-和-(ch2-ch2-o)q–ch2–；–le–选自：–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–和–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；以及o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。还优选通式(iv)的缀合物，其中–w–表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。尤其优选通式(iv)的缀合物，其中连接基–l–选自：–la–、–la–le–、–la–lb–le–和–la–ld–le–；–la–选自：–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–、–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–选自：–(ch2)q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–和–(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–选自：–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–和–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选选自1、2、3和4的整数；–w–表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。甚至更优选的是通式(iv)的缀合物，其中x表示1，v*–表示h–，连接基–l–选自：–la–、–la–le–、–la–lb–le–和–la–ld–le–；–la–选自：–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–、–(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–选自：–(ch2)q–、–(cf2)q–、–(ch2–ch2–o)q–c2h4–和–(ch2–ch2–o)q-ch2-；-le-选自：-(ch2)p1-、-(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、-ch2-(o-ch2-ch2)p1-和-(ch2)p1-o-(ch2)p2-；o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选选自1、2、3和4的整数；-w-表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。特别优选的是通式(iv)的缀合物，其中连接基-l-表示-(ch2)o–，o为选自2、3、4、5和6的整数；–w–表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。还优选的是通式(iv)的缀合物，其中x表示1，v*-表示h-，连接基-l-表示-(ch2)o-，o为选自2、3、4、5和6的整数；-w–表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。优选c包含2-18，更优选5-15，甚至更优选8-12。另外优选n表示1。还优选的是通式(v)的缀合物：[h-((-ux+4-ux+3-ux+2-ux+1-ux)m-(vx+2-vx+1-vx)1-m)n-o-l-e1-w]c-crm197(v)其中c包含2-18；–e1–表示共价键、–nh–、–o–nh–、–o–、–s–、–co–、–ch＝ch–、–conh–、–co–nhnh–、–w–选自：a表示选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，b表示选自1、2、3和4的整数；且m、n、x、l、ux+1、ux+2、ux+3、ux+4、vx、vx+1和vx+2具有本申请中所定义的含义。在另一个实施方案中，所述的免疫原性载体优选为具有免疫调节特性的鞘糖脂，更优选(2s,3s,4r)-1-(α-d-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇。本申请中所用的术语具有免疫调节特性的鞘糖脂是指能够刺激免疫系统对靶抗原的反应，但其本身并不赋予如上定义的免疫性的适合鞘糖脂。本申请中所用的鞘糖脂为包含与鞘脂α–连接的碳水化合物部分的化合物。优选地，碳水化合物部分为六吡喃糖，最优选为α–d-吡喃半乳糖。对于本领域技术人员而言，鞘脂为一类含有通过酰胺键连接至脂肪酸的c18氨基醇的脂质。c18氨基醇优选被羟基单取代、二取代或多取代。特别优选的是，c18氨基醇为植物鞘氨醇。脂肪酸优选为具有16-28且更优选为18-26的碳数的饱和烷基链的一元羧酸。具有免疫调节特性的鞘糖脂包括，但不限于(2s,3s,4r)-1-(α-d-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇，其可刺激自然杀伤(nk)和细胞杀伤自然杀伤(nk)产生细胞因子，并在体内表现出有效的抗肿瘤活性(proc.natlacad.sci.usa，1998，95，5690)。通式i的寡糖与具有免疫调节特性的鞘糖脂的缀合物具有热稳定的优点。为了适合缀合，在具有免疫调节特性的鞘糖脂上引入了官能团。所述的官能团容易直接与通式i的寡糖的连接基的末端氨基反应，得到通式i的寡糖的缀合物，或与互连分子的官能团y反应，得到具有免疫调节特性的修饰的鞘糖脂。优选地，在具有免疫调节特性的鞘糖脂的碳水化合物部分的c6上引入所述官能团。因此，具有免疫调节特性的鞘糖脂被官能团官能化，该官能团易于与寡糖的末端氨基或与互连分子的官能团y反应。易于与氨基反应的官能团包括但不限于活化的酯，异氰酸酯基，醛，环氧化物，亚氨酸酯，羧酸，磺酸烷基酯和磺酰氯。易于与互连分子的官能团y反应的官能团包括，但不限于活化酯、异氰酸酯基团、醛、环氧化物、酰亚胺酯、羧酸、磺酸烷基酯和磺酰氯。易于与互连分子的官能团y反应而得到提供互连分子的官能团x的具有免疫调节特性的修饰的鞘糖脂的官能团包括，但不限于胺、醇、硫醇、活化酯、异氰酸酯基团、醛、环氧化物、乙烯基、酰亚胺酯、羧酸、磺酸烷基酯、磺酰氯、乙烯基、炔基和叠氮基。优选地，具有免疫调节特性的鞘糖脂的碳水化合物部分的c6上引入的官能团选自由如下各项组成的组或包含如下各项的组：胺，硫醇，醇，羧酸，乙烯基，马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)，2-吡啶基二硫酚。互连分子的所述官能团x选自由如下各项组成的组或包含如下各项的组：马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，n-羟基-琥珀酰亚胺酯(nhs)，醛，羧酸，环氧化物，磺酸烷基酯，磺酰氯，酸酐，碳酸酯。如本申请中所用的，术语“互连分子”是指包含官能团x和官能团y的双官能分子，其中官能团x能够与连接基–l–上的末端氨基反应，并且官能团y能够与存在于免疫原性载体或固相支持体上的官能团反应。与包含通过非选择性裂解肺炎克雷伯菌的荚膜多糖、寡糖或其缀合物得到的分离的(而非合成的)寡糖混合物的疫苗相比，包含本发明的至少一种缀合物的疫苗引起的副作用和/或非保护性免疫应答更少。此外，与包含非选择性裂解的荚膜多糖、寡糖的分离混合物的疫苗相比，根据gmp法规更容易制造本发明的疫苗，并且本发明的疫苗更易被表征，这使得稳定性和纯度控制以及杂质的种类和数量的检测更加容易。更优选的是下式(v-1)–(v-11)中任意一个的缀合物：其中l、e1、w、c和n具有与如上所定义相同的含义。更优选的是通式(iv)、(v)和(v-1)–(v-11)中任意一个的缀合物，其中n为的整数2-10。更优选的是通式(iv)、(v)和(v-1)–(v-11)中任意一个的缀合物，其中c选自4-10。优选–w–表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。因此，尤其优选通式(iv)、(v)和(v-1)–(v-11)的缀合物，其中–w–表示且a为选自2、3、4、5和6的整数。优选地，连接基–l–表示–la–、–la–le–、–la–lb–le–或–la–ld–le–；–la–表示–(ch2)o–、–(ch2–ch2–o)o–c2h4–或-(ch2–ch2–o)o–ch2；–lb–表示–o–、–nh–co–nh–、–nh–co–ch2–nh–、–nh–co–；–ld–表示–(ch2)q–、–(ch(oh))q–、–(cf2)q-、-(ch2–ch2-o)q–c2h4–或-(ch2–ch2–o)q–ch2–；–le–表示–(ch2)p1–、–(cf2)p1–、–c2h4–(o–ch2–ch2)p1–、–ch2–(o–ch2–ch2)p1–或–(ch2)p1–o–(ch2)p2–；且o、q、p1和p2彼此独立地为选自1、2、3、4、5和6的整数；优选1、2、3和4的整数。在最优选的实施方案中，e1为共价键、–nh–、–ch＝ch–、–conh–、发现包含(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)中任意一个的寡糖的缀合物且特别是通式(iv)、(v)和(v-1)–(v-11)中任意一个的缀合物在人和/或动物宿主中引发保护性免疫应答，因此可用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5细菌相关的疾病。因此，包含缀合至免疫原性载体的通式(i)的寡糖的缀合物可用于预防和/或治疗在其脂多糖中包含如下寡糖片段之一的肺炎克雷伯菌相关的疾病：-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-3)-β-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1，2)-a-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-优选地，脂多糖中包含的上文所列举的寡糖片段之一的细菌为肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5。在一个优选的实施方案中，包含与免疫原性载体缀合的通式i的寡糖的缀合物可用于预防和/或治疗与细菌相关的疾病，特别是与在其o-多糖中包含以下寡糖片段之一的细菌相关的疾病：-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-3)-β-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-，且优选与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5相关的疾病，其中所述的疾病包括肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿道感染、伤口感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎。药物组合物本发明的另一方面涉及药物组合物或疫苗，其包含至少一种缀合物，该缀合物包含与免疫原性载体缀合的通式(i)的寡糖和/或通式(i)的至少一种寡糖与至少一种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。所述的药物组合物可用于在人和/或动物宿主中引起保护性免疫应答。理想地，该药物组合物适合在人类中使用。在本发明的另一方面，所述的药物组合物或疫苗还包含肺炎克雷伯菌的荚膜多糖、o-多糖和/或荚膜多糖、o-多糖片段和/或其蛋白质缀合物中的至少一种，其选自包含如下各项的组或由如下各项组成的组：肺炎克雷伯菌血清型o1、o2(o2a、o2ac、…)、o4、o7、o8、o12和耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌st258半乳聚糖-iii。本申请中所用的术语“佐剂”是指免疫佐剂，即疫苗组合物中使用的材料，该材料通过在与其抗原无关的情况下增强针对疫苗中所含给定抗原的免疫应答而而改进或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，免疫佐剂的经典公认的实例包括，但不限于油乳剂(例如弗氏佐剂)，皂苷，铝或钙盐(例如明矾)，非离子嵌段聚合物表面活性剂等。药物组合物优选为含水形式，特别是在施用的时间点，但它们也可以非含水液体形式或以干燥形式，例如明胶胶囊或冻干物等提供。药物组合物可以包括一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选无汞的组合物，并且可以制备无防腐剂的疫苗。药物组合物可以包括生理盐，例如钠盐，例如用于控制张力。氯化钠(nacl)为典型的盐，且可以以1-20mg/ml存在。可以存在的其他盐包括氯化钾，磷酸二氢钾，磷酸二钠脱水物，氯化镁，氯化钙等。药物组合物可以具有200mosm/kg和400mosm/kg之间的同渗质量摩尔浓度。药物组合物可以包括在净水(例如注射用水)中的化合物(含或不含不溶性金属盐)，但通常包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。典型地在5-20mm的范围内包括缓冲盐。药物组合物典型地具有5.0-9.5，例如6.0-8.0的ph。药物组合物优选无菌且不含谷蛋白。药物组合物适合于施用于动物(且特别是人)患者，因此包括人和兽医用途。它们可以用于升高患者中的免疫应答的方法中，它包含对患者施用该组合物的步骤。可以在使受试者暴露于肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5之前和/或受试者暴露于肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5之后施用本发明的药物组合物。在本发明的另一方面，本发明涉及至少一种缀合物在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途，所述的缀合物包含缀合至免疫原性载体的通式(i)的至少一种寡糖和/或通式(i)的至少一种寡糖，所述的药物组合物或疫苗用于预防和/或治疗与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b或o5细菌相关的疾病，特别地，与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b或o5细菌相关的疾病选自包含如下各项的组或由如下各项组成的组：肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿道感染、伤口感染、骨髓炎、菌血症、败血病和强直性脊柱炎。优选地，本发明涉及通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)中任意一个的至少一种寡糖和/或包含通式(i)、(ii)、(ii-a)–(ii-k)、(iii)、(iii-a)–(iii-j)或(iii-k)中任意一个的至少一种寡糖的缀合物中的至少一种在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途。更优选地，本发明涉及寡糖i'a-1–i'a-11，i'a-1–i'b-11，i'b-1–i'c-11，i'c-1–i'c-11，i'd-1–i'd-11，i'e-1–i'e-11和i'f-1–i'f-11中的至少一种和/或包含寡糖i'a-1–i'a-11，i'a-1–i'b-11，i'b-1–i'c-11，i'c-1–i'c-11，i'd-1–i'd-11，i'e-1–i'e-11和i'f-1–i'f-11中至少一种的缀合物中的至少一种在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途。特别地，本发明涉及通式(iv)、(v)和(v-1)–(v-11)中任意一个的至少一种缀合物在制备所述药物组合物或所述疫苗中的用途。可以制备单位剂量形式的药物组合物。优选地，本发明缀合物的剂量为0.1-10μg，优选1-10μg，优选0.2-9μg，更优选0.5-9μg，优选1-6μg，且最优选1-5μg。在一些实施方案中，单位剂量可以具有0.1-1.0ml，例如约0.5ml的体积。本发明还提供递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴剂等)，其包含例如包含单位剂量的本发明的药物组合物。该装置可以用于将所述组合物施用于脊椎动物受试者。本发明还提供无菌容器(例如小瓶)，其包含例如包含单位剂量的本发明的药物组合物。本发明还提供单位剂量的本发明药物组合物。本发明还提供包含本发明的药物组合物的气密容器。适合的容器包括例如小瓶。本发明的药物组合物可以以各种形式制备。例如，可以将组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体介质中的固体形式(例如冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备用于局部施用的组合物，例如软膏剂、霜剂或粉末剂。可以制备口服施用的组合物，例如为片剂或胶囊剂，喷雾剂或糖浆剂(任选经矫味)。可以制备用于肺部施用的组合物，例如，通过吸入器，采用细粉或喷雾剂。可以将组合物制备成栓剂。可以将组合物制备成用于鼻、耳或眼部施用，例如作为喷雾剂或滴剂。典型的是肌内施用的注射剂。所述药物组合物可以包含有效量的佐剂，即当以单剂量或作为系列的一部分施用于个体时有效增强对共同施用的肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5抗原的免疫应答的量。该用量可以变化，取决于被治疗的个体的健康和身体状况、年龄、被治疗的个体的分类学类别(例如非人类灵长类，灵长类等)、个体免疫系统合成抗体能力、期望的保护程度、疫苗的配方、主治医生对医疗状况的评估以及其他相关因素。该用量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围。用于配制和施用本发明的疫苗的技术可以在"remington'spharmaceuticalsciences"mackpublishingco.，eastonpa中找到。根据本发明的一种缀合物或通式(i)的一种寡糖的治疗有效剂量是指导致对疾病的至少部分免疫接种的化合物的量。这类化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学、药理学和和毒理学方法确定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。组合物的实际施用量将取决于所治疗的受试者、受试者的体重、患病的严重程度、施用方式和开据处方的临床医师的判断。本发明的另一方面涉及在人和/或动物宿主中诱导针对肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5的免疫应答的方法，所述的方法包括对所述人和/或动物宿主施用通式(i)的寡糖和/或其盐和/或其缀合物或其药物组合物。根据本发明的治疗或预防人和/或动物宿主中由肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5引起的疾病的方法包括对所述人和/或动物宿主施用通式(i)的至少一种寡糖和/或其盐和/或其缀合物或其药物组合物。免疫学测定法本发明的另一方面涉及用作免疫测定法中的标记物的通式(i)的寡糖，所述的免疫测定法用于检测抗细菌的抗体，所述的细菌在其o-多糖、寡糖中包含如下寡糖片段之一：-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-3)-β-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-β-d-man-(1-；-2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1-；-3)-α-d-man-(1，3)-α-d-man-(1，2)-α-d-man-(1-.这类测定法包括例如可用于检测针对在其o-多糖、寡糖中包含如上所列举的寡糖片段之一的细菌例如肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5的抗体的微阵列和elisa。大肠杆菌o9和o8分别共有肺炎克雷伯菌o3、o3b和o5的o抗原。洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiaceparcia)o2和e以及粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)o28共有o5抗原。因此，上文所列举的寡糖片段中之一的o-多糖、寡糖可用于检测针对大肠杆菌o8和o9、洋葱伯克霍尔德菌o2和e以及粘质沙雷氏菌o28的抗体。本发明的寡糖可以容易地与固相支持体缀合，以提供用于检测针对肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和/或o5的抗体的免疫学测定法。所述的固相支持体在其表面上存在易于与通式(i)的寡糖的氨基或与互连分子的官能团y反应以提供改性的固相支持体的官能团，从而在其表面上呈现互连分子的官能团x，其可以进一步与通式(i)的寡糖的氨基反应。在根据本发明的一个实施方案中，固相支持体为微阵列载玻片，在其表面上存在易于与互连分子的官能团y反应的官能团，以提供修饰的微阵列载玻片，使得在其表面上存在互连分子的官能团x。这样的微阵列载玻片的实例包括，但不限于环氧化物涂层包被的载玻片或gapstmii包被的载玻片。在一个优选的实施方案中，固相支持体为微阵列载玻片，其表面上呈现易于与通式(i)的寡糖的氨基且更优选与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化的酯反应的官能团。这类微阵列载玻片例如为nhs载玻片。附图描述图1显示肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和o5lpso-多糖的重复单元的化学结构。图2提供根据本发明的互连分子的官能团x的实例。图3提供根据本发明的互连分子的官能团x的实例。图4(a)显示本发明的crm197缀合物；(b)21*-crm197的结构；以及(c)69*-crm197。图5(a)显示采用10％聚丙烯酰胺凝胶解析的免疫接种实验中使用的糖缀合物(2.5微克/孔)21*-crm197和69*-crm197的sds-page；(b)kpc糖缀合物21*-crm197和69*-crm197的sec色谱图。图6显示用21*-crm197或69*-crm197制剂免疫接种的小鼠(n＝6)的第0天和第35天合并血清的elisa滴度。针对相应的o抗原bsa缀合物21*-bsa和69*-bsa测试了21*-crm197和69*-crm197制剂的血清。在这两种情况下，血清均用1％bsa-pbs稀释1：100、1000和10，000。在微量滴定板的每孔中加入稀释的血清(100μl)，并用0.5μg相应的bsa缀合物包被。使用稀释至1：10000的hrp缀合的山羊抗小鼠二抗进行检测，并使用tmb底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用graphpadprism软件绘制数据图。图7显示用69*-crm197制剂免疫接种的小鼠(n＝6)的第0天和第35天合并血清的交叉反应性。针对从相应菌株即lps(o5)分离的lps测试了69*-crm197制剂的血清。用1％bsa-pbs以1∶200稀释血清。将稀释的血清(100μl)加入微量滴定板的每孔，并用1.0μg相应的lps包被。使用稀释至1：10000的hrp缀合的山羊抗小鼠二抗进行检测，并使用tmb底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用graphpadprism软件绘制数据图。图8显示用69*-crm197制剂免疫接种的兔(n＝4)的第0天、第7天、第21天和第35天合并血清的elisa滴度。针对相应的o抗原bsa缀合物69*-bsa测试了69*-crm197制剂的血清。用1％bsa-pbs以1∶1000和10，000稀释血清。将稀释的血清(100μl)加入微量滴定板每孔，用0.5μg相应的69*-bsa包被。使用稀释至1：10000的hrp缀合的山羊抗兔二抗进行检测，并使用tmb底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用graphpadprism软件绘制数据图。图9显示用69*-crm197制剂免疫接种的兔(n＝4)的第0天和第35天合并血清的交叉反应性。针对从不同的kpc菌株#1-#4分离的lps测试了69*-crm197制剂的血清。在这两种情况下，均针对lps(o1)、商品-lps(o2a，c)、lps(o2a)、lps(o5)和lps(galiii)测试了血清。用1％bsa-pbs以1∶200稀释血清，并且将100μl稀释的血清加入微量滴定板的每孔，用1.0μg相应的lps包被。使用稀释至1：10000的hrp缀合的山羊抗兔二抗进行检测，并使用tmb底物显影。在450nm处测量吸光度，并使用graphpadprism软件绘制数据图。实施例a.化学合成一般信息：除非另有说明，否则使用商业级溶剂。干燥溶剂得自watersdrysolventsystem。色谱溶剂在使用前进行了蒸馏。敏感反应在热干燥的玻璃器皿中和氩气气氛下进行。在预先涂有0.25mm厚度硅胶的kieselgel60f254玻璃板上进行分析型薄层色谱法(tlc)。通过用香草醛溶液(95％etoh中的6％(w/v)香草醛和10％(v/v)硫酸)或hanessian染色剂(5％(w/v)钼酸铵、1％(w/v)硫酸铈(ii)和10％(v/v)硫酸的水溶液)染色使斑点显现。硅胶柱色谱法使用flukakieselgel60(230-400目)进行。1h、13c和二维nmr光谱使用varian400-mr光谱仪在296k下测定。化学位移(d)相对于相应的残留溶剂峰(cdcl3：在1h中d7.26和在13cnmr中77.16；cd3od：在1h中d3.31和在13cnmr中49.15)每百万之份数报告。以下缩写用于表示峰多重性：s单峰；d双峰；dd双联双峰；t三重峰；dt双联三重峰；q四重峰；m多重峰。偶合常数(j)以赫兹(hz)表示。使用schmidt&haenschunipoll1000旋光仪在λ＝589nm处进行旋光度(or)测量，并在括号中以g/100ml表示浓度(c)。高分辨率质谱(hrms)在freeuniversityberlin，massspectrometrycorefacility使用agilent6210esi-tof质谱仪进行。红外(ir)光谱是使用perkinelmer100ftir光谱仪在申请人的设施中测定。缩写acoh乙酸alloc烯丙氧羰基aq.含水的bh3硼烷bbr3三溴化硼boc叔丁氧羰基br.宽峰cascas注册号(cas＝化学文摘社)chcl3氯仿chex环己烷d双峰dd双联双峰dcm二氯甲烷dead偶氮二甲酸二乙酯dipean,n-二异丙基-乙胺dme二甲氧基乙烷dmf二甲基甲酰胺dmso二甲亚砜dppa叠氮化磷酸二苯酯edc·hcln1-((乙基亚氨基)亚甲基)-n3,n3-二甲基丙烷-1,3-二胺盐酸盐es电喷雾et2o乙醚etoac乙酸乙酯h小时hcl盐酸h2o水hobt.h2o1h-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇水合物k2co3碳酸钾m多重峰mecn乙腈meoh甲醇mei碘甲烷mgso4硫酸镁min分钟ms质谱法na2co3碳酸钠nacnbh3氰基硼氢化钠nahco3碳酸氢钠nah氢化钠naoh氢氧化钠na2so4硫酸钠ncsn-氯琥珀酰亚胺nisn-碘代琥珀酰亚胺nmr核磁共振pbs磷酸缓冲盐水pd/c披钯碳pph3三苯膦q四重峰rt室温s单峰sat.饱和的sep七重峰t三重峰tfa三氟乙酸thf四氢呋喃tsoh对甲苯磺酸wt重量。实施例1：单糖结构单元的合成化合物1*根据carb.res.，2010，345，10，1316-1323中所述的方法制备了化合物1*。化合物2*根据chemistry-aeuropeanjournal，2010，16(44)、13163–13175中所述的方法制备了化合物2*。化合物3*根据org.biomol.chem.，2018，(16)13，2277–2288中所述的方法制备了化合物3*。化合物4*根据j.org.chem.，2012，77(1)，108–125中所述的方法制备了化合物4*。化合物5*将化合物4*(2g，3.30mmol)溶于无水dcm(33ml)。加入苄基溴(1.4g，8.24mmol)和ag2o(7.64g，33mmol)，将该反应混合物在室温剧烈搅拌过夜。通过硅藻土过滤该反应体系，减压浓缩，得到粗产物。使粗产物装载上，使用应用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物(1.43g，62％)。hrms(esi+)计算值c44h40o6sna+[m+na]+719.2443，测定值719.2390。化合物6*根据j.am.chem.soc.，2017，139(2)，1011–1018中所述的方法从9*开始制备了化合物6*：将化合物9*(400mg，1.068mmol)溶于无水吡啶(5ml)。加入fmoccl(431mg，1.666mmol)和dmap(19.58mg，0.160mmol)，将该反应混合物在室温搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释该反应体系，用饱和nahco3和盐水洗涤。用na2so4干燥有机层，蒸发溶剂，得到粗产物，使粗产物装载在上，使用自动化纯化系统，应用二氧化硅(乙酸乙酯/环己烷)纯化，得到产物(360mg，56％)。hrms(esi+)计算值c35h32o7sna+[m+na]+597.1947，测定值597.1857。化合物7*将化合物6*(1.7g，2.274mmol)溶于bh3·thf(27ml，27mmol)，加入tmsotf(0.41ml，2.274mmol)。将该溶液在室温搅拌1.5h。用甲醇猝灭反应(用冰/水浴冷却)，减压浓缩，得到粗产物。使粗产物装载在上，使用自动化纯化系统与乙酸乙酯/环己烷纯化，得到产物(930mg，61％)。hrms(esi+)计算值c41h38o7sna+[m+na]+697.2236，测定值697.2188。化合物8*将化合物7*(930mg，1.37mmol)溶于无水dcm(14ml)。加入苄基溴(589mg，3.45mmol)和ag2o(3.19g，13.78mmol)，将该反应混合物在室温剧烈搅拌过夜。通过过滤该反应体系，减压浓缩，得到粗产物。使粗产物装载在上，使用应用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，得到产物8*(680mg，65％)。hrms(esi+)计算值c48h44o7sna+[m+na]+787.2705，测定值787.2653。化合物9*根据chem.eur.j.2014，20，3578–3583中所述的方法制备了化合物9*。实施例2：肺炎克雷伯菌血清型o3寡糖的合成化合物10*向化合物5*(550mg，0.789mmol)和5-叠氮基戊醇(306mg，2.368mmol)在无水dcm(2.9ml)中的溶液中加入分子筛，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(213mg，0.947mmol)，将该反应混合物冷却至-20℃。加入tmsotf(14μl，0.079mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。过滤反应混合物，用dcm洗涤，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤滤液，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层。用无水na2so4干燥，过滤，减压浓缩。通过应用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物10*，为无水粘稠凝胶(51mg，49％)。hrms(esi+)计算值c43h45n3o7na+[m+na]+738.3155，测定值738.3147。化合物11*在0℃向化合物10*(361mg，0.504mmol)在dcm：pbs(2：1，16.81ml)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(229mg，1.01mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2.5h。通过tlc监测反应(etoac的环己烷溶液，2：1)。用饱和nahco3(50ml)猝灭反应，用dcm(2x50ml)萃取。用盐水(50ml)洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩滤液，得到粗产物。通过使用二氧化硅的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，得到为无色油状物的化合物11*(210mg，72％)。hrms(esi+)计算值c32h37n3o7na+[m+na]+599.2563，测定值599.2555。化合物12*向化合物5*(276mg，0.396mmol)和化合物11*(190mg，0.330mmol)在无水dcm(8.4ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(89mg，0.396mmol)，将该反应混合物冷却至-20℃。加入tmsotf(6μl，0.03mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1h。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤滤液，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层。用无水na2so4干燥后，减压浓缩各层。通过应用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后，得到产物12*，为浑浊粘稠凝胶(300mg，78％)。hrms(esi+)计算值c70h71n3o13na+[m+na]+1184.4885，测定值1184.4902。化合物13*在0℃向化合物12*(290mg，0.294mmol)在dcm：pbs(2：1，8.3ml)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(113mg，0.499mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2.5h，通过tlc监测(etoac的环己烷溶液，2：1)。用饱和nahco3(40ml)猝灭反应，用dcm(2x40ml)萃取。用盐水(20ml)洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，减压浓缩，得到粗产物。通过使用二氧化硅的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，得到化合物13*，为无色油状物(136mg，53％)。hrms(esi+)计算值c59h63n3o13na+[m+na]+1044.4259，测定值1044.4252。化合物14*向化合物8*(135mg，0.176mmol)和13*(150mg，0.147mmol)在无水dcm(3.8ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(40mg，0.176mmol)，将该反应混合物冷却至-20℃。加入tmstof(2.6μl，0.015mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1.5h。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层。用无水na2so4干燥后，通过自动化纯化系统，应用二氧化硅(乙酸乙酯/环己烷)纯化粗产物，蒸发溶剂后得到产物14*，为浑浊粘稠凝胶(184mg，75％)。hrms(esi+)计算值c101h101n3o20na+[m+na]+1699.6910，测定值1699.6886。化合物15*在室温向化合物14＊(180mg，0.107mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入三乙胺(208μl，1.491mmol)，搅拌1h。减压除去挥发性物质。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物15*，为浑浊粘稠凝胶(138mg，88％)。hrms(esi+)计算值c85h91n3o18na+[m+na]+1476.6195，测定值1476.6198。化合物16*将甲醇钠的meoh溶液(0.5m)(0.075ml，0.330mmol)加到化合物15*(24mg，0.016mmol)在meoh：thf(2：1，1.5ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌20h。通过添加h2o(2ml)猝灭反应，用盐水(5ml)稀释。用etoac(2x10ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色粘稠凝胶(18mg，88％)。hrms(esi+)计算值c99h90o22na+[m+na]+1268.5671，测定值1268.5813。化合物17*将化合物16*(8.6mg，6.90μmol)溶于dcm(1ml)、叔丁醇(1ml)和2滴水的溶剂混合物中。向其中加入pd/c，在7巴的h2气力下在室温氢化24h。将该反应混合物通过ptfe滤器过滤，将残余物用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤，真空蒸发滤液，得到粗产物，1hnmr显示粗产物清洁，回收样品，冷冻干燥，得到化合物17*，为白色结晶固体(3.8mg，93％)。hrms(esi+)计算值c23h43no16h+[m+h]+590.2694，测定值590.2683。1hnmr(400mhz，d2o)δ5.15(d，j＝1.7hz，1h)、5.11(d，j＝1.8hz，1h)、4.85(d，j＝1.8hz，1h)、4.24(dd，j＝3.3，1.8hz，1h)、4.06-4.12(m，2h)、4.03(dd，j＝9.1，3.3hz，1h)、3.86–3.97(m，5h)、3.71–3.86(m，8h)、3.61–3.71(m，2h)、3.51–3.61(m，1h)、3.01(t，j＝7.6hz，2h)、1.61–1.78(m，4h)、1.39–1.54(m，2h)。化合物18*向化合物8*(43mg，0.056mmol)和化合物15*(65mg，0.045mmol)在无水dcm(1.94ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(12mg，0.054mmol)，将该反应混合物冷却至-20℃。加入tmstof(0.8μl，4.47μmol)，将该反应混合物在0℃搅拌35min。通过tlc监测反应，直至无原料留下。加入三乙胺(250μl)，将该混合物温热至室温，历时1h。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，随后用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(46mg，54％)。hrms(esi+)计算值c113h119n3o23h+[m+h]+1909.8166，测定值1909.8160。化合物19*向化合物3*(16.8mg，0.026mmol)和化合物18*(28mg，0.015mmol)在无水甲苯(0.9ml)和无水二噁烷(0.3ml)混合物中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌1h。然后加入nis(4mg，0.018mmol)，将该反应混合物冷却至-20℃。加入tmstof(0.27μl，1.484μmol)，将该反应混合物搅拌2h，使其温热至室温。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，随后用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(32mg，89％)。hrms(esi+)计算值c147h151n3o29na+[m+na]+2445.0331，测定值2445.9951。化合物20*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.051ml，0.223mmol)加到五糖19*(27mg，0.011mmol)在meoh：thf混合物(2：1，1.5ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌16h。通过添加h2o(3ml)猝灭反应，用盐水(5ml)稀释。用etoac(2x10ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色粘稠凝胶(17mg，72％)。hrms(esi+)计算值c126h139n3o26na+[m+na]+2133.9578，测定值2133.9517。化合物21*将化合物20*(17mg，8.05μmol)溶于dcm(1ml)、叔丁醇(1ml)和2滴水的溶剂混合物中。加入pd/c，在h2气囊中在室温氢化24h。将该反应混合物通过ptfe滤器过滤，将残余物用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤，真空蒸发滤液，得到粗产物，1hnmr分析显示反应完成和存在产物，因此，将粗产物通过c18sepak柱，用水(3mlx2，fr1)、20％乙腈-水(3mlx2，fr2)和乙腈(3ml，fr2)纯化。将这些级分冷冻，冻干24h，得到化合物21*的一种纯的级分fr1(白色固体，6，4mg，87％)和2种不纯的级分白色蓬松固体(fr2，0.4mg)、白色蓬松固体(fr.3，0.6mg)。hrms(esi+)计算值c35h63no26h+[m+h]+914：3717，测定值914：3725。1hnmr(400mhz，d2o)δ5.35(d，j＝1.7hz，1h)、5.28(d，j＝1.8hz，1h)、5.08(d，j＝1.8hz，1h)、5.02(d，j＝1.8hz，1h)、4.82(d，j＝1.8hz，1h)、4.20(dd，j＝3.3，1.8hz，1h)、4.02–4.11(m，4h)、3.92–4.01(m，3h)、3.80–3.92(m，8h)、3.50–3.80(m，18h)、2.93–3.04(m，2h)、1.58–1.76(m，4h)、1.37–1.58(m，2h)。化合物22*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和叠氮基乙醇为原料制备了化合物22*。化合物23*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和叠氮基癸醇为原料制备了化合物23*。化合物24*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇为原料制备了化合物24*。化合物25*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和3-叠氮基-2,2-二氟丙醇为原料制备了化合物25*。化合物26*按照与类化合物21*似的方式以化合物5*和相应的叠氮基醇为原料制备了化合物26*。化合物27*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和相应的叠氮基醇为原料制备了化合物27*。化合物28*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和相应的s-苄硫醇为原料制备了化合物。化合物29*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和5-己烯醇为原料制备了化合物29*。化合物30*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷醇为原料制备了化合物30*。化合物31*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和叠氮基-peg7-醇为原料制备了化合物31*。化合物32*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和5-苄氧基戊醇为原料制备了化合物32*。化合物33*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和12-苄氧基癸醇为原料制备了化合物33*。化合物34*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和甲基6-羟基癸酸为原料制备了化合物34*。化合物34a*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和甲基6-羟基癸酸为原料制备了化合物34a*。化合物35*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和1，2-二苄基甘油或丙酮化合物保护的甘油为原料制备了化合物35*。化合物36*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和2-(氯乙氧基)乙醇为原料制备了化合物36*。化合物37*按照与化合物21*类似的方式以化合物5*和4-戊烯-1-醇为原料制备了化合物37*。实施例3：肺炎克雷伯菌血清型o5三糖的合成化合物38*向化合物3*(490mg，0.758mmol)和5-叠氮基丙醇(294mg，2.273mmol)在无水甲苯(11.4ml)和无水二噁烷(3.76ml)的混合物中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(205mg，0.909mmol)，将该反应混合物冷却至0℃。加入tfoh(11.4mg，0.076mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌2h。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(25ml)洗涤，用ch2cl2(2x40ml)萃取。用饱和nahco3溶液(25ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物38*，为无色粘稠凝胶(420mg，83％)。hrms(esi+)计算值c39h43n3o7na+[m+na]+688.2999，测定值688.3009。化合物39*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.41ml，1.802mmol)加到单糖38*(400mg，0.601mmol)在meoh：thf混合物(2：1，12ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌20h。通过添加h2o(15ml)猝灭反应，用盐水(20ml)稀释。用etoac(2x60ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色粘稠凝胶(300mg，89％)。hrms(esi+)计算值c32h39n3o6na+[m+na]+584.2737，测定值584.2738。化合物40*向化合物3*(355mg，0.548mmol)和化合物39*(280mg，0.499mmol)在无水甲苯(10ml)和无水二噁烷(3.3ml)混合物中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(135mg，0.598mmol)，将该反应混合物冷却至0℃。加入tfoh(7.5mg，0.05mmol)，将该反应混合物在0℃搅拌1h。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，随后用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(350mg，64％)和起始化合物39*(62mg，22％)。hrms(esi+)计算值c66h71n3o12na+[m+na]+1120.4935，测定值1120.4922。化合物41*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.8ml，3.19mmol)加到化合物40*(350mg，0.319mmol)在meoh：thf混合物(2：1，7.5ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌20h。通过添加h2o(15ml)猝灭反应，用盐水(20ml)稀释。用etoac(2x60ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物66*，为无色粘稠凝胶(278mg，88％)。hrms(esi+)计算值c59h67n3o11na+[m+na]+1016.4673，测定值1016.4686。化合物42*向化合物2*(180mg，0.304mmol)在无水dcm(11ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入1-(苯亚磺酰基)哌啶(69.7mg，0.333mmol)和2,4,6-三叔丁基嘧啶(150mg，0.606mmol)。将该反应混合物冷却至-65℃，搅拌30min。加入三氟甲磺酸酐(61μl，0.362mmol)，将该反应混合物在-65℃搅拌20min。然后将反应混合物冷却至-78℃，滴加在dcm(5ml)中的化合物41*(275mg，0.277mmol)，在-78℃搅拌6h，然后在1h内温热至-25℃。过滤反应混合物，用饱和nahco3溶液(25ml)洗涤，用ch2cl2(2x35ml)萃取。用盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(220mg，54％)。hrms(esi+)计算值c99h95n3o16na+[m+na]+1496.6610，测定值1496.6623.化合物43*将化合物42*(8mg，5.99μmol)溶于溶剂混合物dcm(1ml)、tbuoh(1ml)和2滴水中。加入pd/c，在h2气囊中在室温氢化。通过ptfe滤器过滤该反应混合物，用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤残余物。真空蒸发滤液，得到粗产物。通过1hnmr纯化粗产物，回收样品，冷冻干燥，得到白色结晶固体(3.53mg，定量)。hrms(esi+)计算值c23h43no16h+[m+h]+590.2660，测定值590.2814。1hnmr(400mhz，d2o)δ5.12(d，j＝1.8hz，1h)、5.07(d，j＝1.7hz，1h)、4.77(s，1h)、4.28(dd，j＝3.4，1.8hz，1h)、4.02(d，j＝3.2hz，1h)、3.81–4.00(m，6h)、3.48–3.81(m，11h)、3.36(ddd，j＝9.4，6.7，2.3hz，1h)、2.98(t，j＝7.6hz，2h)、1.58–1.74(m，4h)、1.36–1.51(m，2h)。化合物44*按照与化合物43*类似的方式以化合物3*和叠氮基乙醇为原料制备了化合物44*。化合物45*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和叠氮基癸醇为原料制备了化合物45*。化合物46*按照与化合物43*类似的方式以为原料化合物5*和2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇制备了化合物46*。化合物47*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和3-叠氮基-2,2-二氟丙醇为原料制备了化合物47*。化合物48*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和相应的叠氮基醇为原料制备了化合物48*。化合物49*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和相应的叠氮基醇为原料制备了化合物49*。化合物50*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和相应的s-苄硫醇为原料制备了化合物50*。化合物51*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和5-己烯醇为原料制备了化合物51*。化合物52*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷醇为原料制备了化合物52*。化合物53*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和叠氮基-peg7-醇为原料制备了化合物53*。化合物54*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和5-苄氧基戊醇为原料制备了化合物54*。化合物55*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和12-苄氧基癸醇为原料制备了化合物55*。化合物56*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和甲基6-羟基癸酸为原料制备了化合物56*。化合物56a*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和甲基6-羟基癸酸为原料制备了化合物56a*。化合物57*按照与化合物43*类似的方式以为原料化合物5*和1，2-二苄基甘油制备了化合物57*。化合物58*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和2-(氯乙氧基)乙醇为原料制备了化合物58*。化合物59*按照与化合物43*类似的方式以化合物5*和4-戊烯-1-醇为原料制备了化合物59*。实施例4：肺炎克雷伯菌血清型o5六聚糖的合成化合物60*在0℃向化合物42*(220mg，0.149mmol)在dcm：pbs(2：1，7.4ml)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(67.7mg，0.298mmol)。将该反应混合物在室温搅拌4h，通过tlc监测(etoac的环己烷溶液，2：1)。用饱和nahco3(50ml)猝灭反应，用dcm(2x50ml)萃取。用盐水(25ml)洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，得到粗产物。通过使用二氧化硅的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，得到化合物60*，为无色油状物(125mg，63％)。hrms(esi+)计算值c79h87n3o16na+[m+na]+1356.5984，测定值1356.5983。化合物61*在0℃向化合物8*(160mg，0.209mmol)在dcm(3ml)中的溶液中加入三乙胺(0.2ml，1.435mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1h。减压浓缩反应混合物，得到粗产物。通过使用二氧化硅的自动化快速色谱法纯化粗产物(乙酸乙酯/环己烷)，得到无色油状物(96mg，85％)。hrms(esi+)计算值c33h34o5sna+[m+na]+566.2025，测定值566.2065。化合物62*在0℃向在dcm(10ml)和h2o(1ml)中的化合物61*(1.05g，1.623mmol)中加入n-碘代琥珀酰亚胺(365mg，1.623mmol)和三氟乙酸(124μl，1.623mmol)，搅拌2h。使该反应混合物分配在饱和nahco3水(50ml)溶液与dcm(50ml)之间。用饱和na2s2o3溶液(50ml)洗涤有机层，用na2so4干燥。通过柱色谱法纯化粗产物，用etoac环己烷作为溶剂，得到期望的产物(730mg，81％)，为无色油状物。hrms(esi+)计算值c34h34o7na+[m+na]+577.2202，测定值577.2208。化合物63*将cs2co3(141mg，0.433mmol)和2,2,2-三氟-n-苯基-亚氨代乙酰氯(135mg，0.649mmol)加到乳醇62*(120mg，0.216mmol)在dcm(2.2ml)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过tlc监测。2小时后，全部原料耗尽，通过过滤该反应体系，用dcm(10ml)洗涤。蒸发溶剂，将粗产物(157mg，定量)在未任何纯化的情况下用于下一步。化合物64*向化合物63*(157mg，0.216mmol)和化合物61*(117mg，0.216mmol)在无水甲苯(4.6ml)和二噁烷(1.5ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。加入tmsotf(3.92μl，0.022mmol)，将该反应混合物在-10℃搅拌1h。用饱和nahco3溶液(25ml)猝灭反应，用dcm(2x20ml)萃取。用na2so4干燥有机层，蒸发以得到粗产物。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物(193mg，83％)，为无色油状物。hrms(esi+)计算值c67h66o11sna+[m+na]+1101.4224，测定值1101.4073。化合物65*向化合物64*(116mg，0.108mmol)和化合物60*(120mg，0.090mmol)在无水甲苯(4.5ml)和无水二噁烷(1.5ml)的混合物中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(26.3mg，0.117mmol)，将该反应混合物冷却至0℃。加入tfoh(1.35mg，8.99μmol)，将该反应混合物搅拌3h，逐步温热至室温。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(110mg，53％)。hrms(esi+)计算值c140h147n3o27na+[m+na]+2326.0153，测定值2326.0177。化合物66*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.051ml，0.239mmol)加到五糖65*(110mg，0.048mmol)在meoh：thf(2：1，3ml)混合物中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌16h。通过添加h2o(5ml)猝灭反应，用盐水(10ml)稀释。用etoac(2x20ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，过滤，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物66*，为无色粘稠凝胶(95mg，90％)。hrms(esi+)计算值c140h147n3o27na+[m+na]+2221.9891，测定值2221.9960。化合物67*向化合物2*(23.16mg，0.039mmol)在无水dcm(2ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌10min。然后加入1-(苯亚磺酰基)哌啶(8.59mg，0.041mmol)和2,4,6-三叔丁基嘧啶(18.55mg，0.075mmol)。将该反应混合物冷却至-65℃，搅拌30min。加入三氟甲磺酸酐(7.55μl，0.045mmol)，将该反应混合物在-65℃搅拌15min。然后将反应混合物冷却至-78℃，滴加在dcm(1.5ml)中的化合物66*(75mg，0.034mmol)，在-78℃搅拌6h，然后在1h内温热至-25℃。过滤反应混合物，用饱和nahco3溶液(15ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物(作为α/β混合物)，为浑浊粘稠凝胶(35mg，38％)。hrms(esi+)计算值c164h171n3o31na+[m+na]+2702.1828，测定值2702.1783。化合物68*在室温向在dcm(2.5ml)中的化合物67*(35mg，0.013mmol)中加入乙硫醇(9.66μl，0.131mmol)和对甲苯磺酸一水合物(1.24mg，6.53μmol)，将该混合物搅拌1.5h。用三乙胺(1ml)使反应混合物猝灭，真空浓缩。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物，为纯的期望的β-异构体(16mg，49％)，为无水油状物。hrms(esi+)计算值c150h163n3o31na+[m+na]+2526.1202，测定值2526.1152。化合物69*将化合物68*(15mg，5.99μmol)溶于溶剂混合物dcm(1ml)、tbuoh(1ml)和2滴水中。加入pd/c，在h2气囊中在室温氢化24h。通过ptfe滤器过滤该反应混合物，用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤残余物。真空蒸发滤液，得到粗产物。1hnmr分析显示反应完成，存在产物。因此，通过c18sepak柱，使用水(3mlx2，fr1)、20％乙腈-水(3mlx2，fr2)和乙腈(3ml，fr3)纯化粗产物。冷冻全部级分，冻干24h，得到化合物69*纯的级分fr1(白色固体，5，64mg，87％)和2种不纯的级分白色蓬松固体(fr2，0.2mg)、白色蓬松固体(fr.3，0.2mg)。hrms(esi+)计算值c41h73no31h+[m+h]+1076.4244，测定值1076.4245。1hnmr(400mhz，重水)δ5.33(d，j＝1.8hz，1h)、5.14(d，j＝1.8hz，1h)、5.10(d，j＝1.7hz，1h)、5.06(d，j＝1.7hz，1h)、4.65–4.68(m，2h)、4.27(dt，j＝3.2，1.4hz，2h)、4.14–4.20(m，1h)、4.09(dd，j＝3.4，1.7hz，1h)、3.82–4.04(m，12h)、3.47–3.82(m，23h)、3.32–3.43(m，2h)、2.94–3.02(m，2h)、1.59–1.73(m，4h)、1.35–1.53(m，2h)。实施例5：肺炎克雷伯菌血清型o5九糖的合成化合物70*向化合物63*(720mg，0.978mmol)和4-甲氧基苯酚(121mg，0.978mmol)在无水甲苯(7.3ml)和二噁烷(2.5ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。添加tmsotf(18μl，0.098mmol)，将该反应混合物在-10℃搅拌1h。用饱和nahco3溶液(35ml)猝灭反应，用dcm(2x50ml)萃取。用na2so4干燥有机层，蒸发以得到粗产物。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物(540mg，84％)，为无水油状物。hrms(esi+)计算值c41h40o8na+[m+na]+683.2621，测定值683.2643。化合物71*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.52ml，2.406mmol)加到苯甲酸酯70*(530mg，0.802mmol)在meoh：thf混合物(4：1，7.5ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌16h。通过添加h2o(3ml)猝灭反应，用盐水(25ml)稀释。用etoac(2x50ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色粘稠凝胶(430mg，96％)。hrms(esi+)计算值c34h36o7na+[m+na]+579.2359，测定值579.2395。化合物72*向化合物3*(100mg，0.155mmol)和化合物71*(86mg，0.155mmol)在无水甲苯(2.3ml)和无水二噁烷(0.8ml)混合物中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入nis(41.7mg，0.186mmol)，将该反应混合物冷却至-10℃。加入tfoh(2.32mg，0.015mmol)，将该反应混合物搅拌1h，逐步温热至室温。过滤反应混合物，用饱和na2s2o3溶液(25ml)洗涤，用ch2cl2(2x30ml)萃取。用饱和nahco3溶液(15ml)和盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(132mg，78％)。hrms(esi+)计算值c66h68o13na+[m+na]+1115.4558，测定值1115.4595。化合物73*将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(0.074ml，0.343mmol)加到苯甲酸酯72*(125mg，0.114mmol)在meoh：thf混合物(4：1，2.3ml)中的溶液中。将该反应体系在相同温度搅拌16h。通过添加h2o(3ml)猝灭反应，用盐水(25ml)稀释。用etoac(2x50ml)萃取反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为无色粘稠凝胶(108mg，95％)。hrms(esi+)计算值c61h64o12na+[m+na]+1011.4295，测定值1011.4326。化合物74*向化合物2*(197mg，0.334mmol)在无水dcm(6ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。然后加入1-(苯基亚磺酰基)哌啶(76mg，0.365mmol)和2,4,6-三叔丁基嘧啶(165mg，0.664mmol)，将反应混合物冷却至-65℃，搅拌30min。加入三氟甲磺酸酐(67μl，0.397mmol)，将该反应混合物在-65℃搅拌20min。然后将反应混合物冷却至-78℃，滴加在dcm(4ml)中的化合物73*(300mg，0.303mmol)，在-78℃搅拌6h，然后在1h内温热至0℃。过滤反应混合物，用饱和nahco3溶液(25ml)洗涤，用ch2cl2(2x25ml)萃取。用盐水(10ml)洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥，减压浓缩。通过使用二氧化硅的自动化纯化系统纯化(乙酸乙酯/环己烷)，蒸发溶剂后得到产物，为浑浊粘稠凝胶(300mg，67％)。hrms(esi+)计算值c92h95o17na+[m+na]+1492.6266，测定值1492.6232。化合物75*在0℃向在乙腈(8.7ml)和h2o(1.1ml)中的三糖74*(289mg，0.197mmol)中加入硝酸铈铵(172mg，0.315mmol)，搅拌2h。通过tlc监测反应混合物，再加入另一部分硝酸铈铵(172mg，0.315mmol)，搅拌2h。使该反应混合物分配在饱和nahco3水(25ml)溶液与dcm(35ml)之间。用dcm(25ml)萃取水层，用na2so4干燥合并的有机层，蒸发以得到粗产物。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物(125mg，46％)，为淡黄色油状物。hrms(esi+)计算值c85h86o16na+[m+na]+1385.5814，测定值1385.5885。化合物76*将cs2co3(38.2mg，0.117mmol)和2,2,2-三氟-n-苯基-亚氨代乙酰氯(36.5mg，0.176mmol)加到乳醇75*(80mg，0.059mmol)在dcm(8ml)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌，通过tlc监测。2小时后，全部原料耗尽，通过硅藻土过滤该反应体系，用dcm(20ml)洗涤。蒸发溶剂，将粗产物(90mg，定量)不经任何纯化用于下一步。化合物77*向化合物76*(80mg，0.052mmol)和化合物60*(69.6mg，0.052mmol)在无水甲苯(2ml)和二噁烷(0.66ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。添加tmsotf(1μl，5.21μmol)，将该反应混合物在-10℃搅拌1h。用饱和nahco3溶液(20ml)猝灭反应，用dcm(2x25ml)萃取。用na2so4干燥有机层，蒸发以得到粗产物。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物(70mg，50％)，为无水油状物。hrms(esi+)计算值c164h171n3o31na+[m+na]+2702.1828，测定值2702.1853。化合物78*在0℃向化合物77*(60mg，0.022mmol)在dcm：pbs(2：1，5.1ml)中的溶液中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(10.2mg，0.045mmol)。在室温将该反应混合物搅拌2h，通过tlc监测(etoac的环己烷溶液，2：1)。再添加一部分2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(5mg)，将该反应混合物在室温搅拌2h。用饱和nahco3(25ml)猝灭反应，用dcm(2x25ml)萃取。用盐水(15ml)洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，减压浓缩滤液，得到粗产物。通过使用二氧化硅的自动化快速色谱法(乙酸乙酯/环己烷)纯化粗产物，得到无色油状物(30mg，53％)。hrms(esi+)计算值c153h163n3o31na+[m+na]+2562.1202，测定值2562.1219。化合物79*向化合物76*(35mg，0.023mmol)和化合物78*(29mg，0.011mmol)在无水甲苯(3ml)和二噁烷(1ml)中的溶液中加入ms，将该混合物在室温搅拌30min。添加tmsotf(0.2μl，1.142μmol)，将该反应混合物在-10℃搅拌1h。用饱和nahco3溶液(20ml)猝灭反应，用dcm(2x25ml)萃取。用na2so4干燥有机层，蒸发以得到粗产物。通过柱色谱法，使用etoac和环己烷作为溶剂纯化残余物，得到期望的产物(28mg，63％)，为黄色油状物。maldi-tof：计算值c238h247n3o46h+[m+h]+3885.722，测定值3885.105。化合物80*将化合物79*(6.0mg，1.415μmol)溶于溶剂混合物dcm(1ml)、tbuoh(1ml)和2滴水中。向其中加入pd/c，在h2气囊中在室温氢化24h。使该反应混合物通过ptfe滤器过滤，用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤残余物。真空蒸发滤液，得到粗产物。1hnmr分析显示反应完成，且存在产物。因此，通过c18sepak柱、应用水(3mlx2，fr1)、20％乙腈-水(3mlx2，fr2)和乙腈(3ml，fr3)纯化粗产物。冷冻全部级分，冻干24h，得到化合物80*fr1的纯的级分(白色固体，2，4mg，99％)、两种不纯的级分白色蓬松固体(fr2，0.03mg)，白色蓬松固体(fr.3，0.4mg)。hrms(esi+)计算值c59h103no46h+[m+h]+1562.5829，测定值1562.5815实施例5：肺炎克雷伯菌血清型o3寡糖的自动化合成通用方法和材料用于制备结构单元以及活化剂tmsotf和封闭储备液的无水*溶剂取自溶剂干燥系统(jcmeyer溶剂系统)。hplc级dcm用于洗涤。所有其他洗涤溶剂(dmf、thf、二噁烷和meoh)均为试剂级。通过与甲苯共蒸发(3x)并在高真空下干燥约1-2小时干燥结构单元。使用用光可裂解的连接基改性的merrifield树脂(负载＝0.41mmol/g)，以0.0125mmol的规模进行了所有合成。负载了连接基的树脂的结构如下–储备溶液活化剂溶液：150mmnis/15mmtfoh的dcm*：二噁烷溶液*酸洗涤溶液：62mmtmsotf的dcm溶液*封端溶液：10％(v/v)ac2o/2％(v/v)meso3h的dcm溶液*吡啶“预洗涤”溶液：10％(v/v)吡啶的dmf溶液fmoc脱保护溶液：20％(v/v)哌啶的dmf溶液自动化模块模块a：初始树脂溶胀/合成洗涤开始用dcm、dmf和thf洗涤树脂(3x，2ml，各25s)，然后在dcm(2ml)中溶胀30min，偶尔使用脉冲氩气起泡混合。模块b：用62mmtmsotf酸洗涤将dcm(2ml)递送至反应容器中，将温度调节至-20℃。排干dcm，用另外2mldcm替代，然后滴加tmsotf溶液(1ml)。将该混合物在氩气起泡下温育1.5分钟，然后排干，用2mldcm洗涤25s。模块c：硫代糖苷偶联结构单元备料和糖基化参数：糖基化循环：将dcm(2ml)添加到树脂中，将温度设置为活化温度t1-2k。在冷却的同时，将结构单元溶液递送至反应容器中。设定温度稳定在t1-2k后，通过加入1ml活化剂溶液启动反应。在开始第二个20分钟的温育周期之前，将混合物在t1中放置5分钟，在此期间将温度升高到温度t2。温育周期完成时，将反应混合物排干，用dcm：二噁烷1：1(2ml)和dcm(2ml)将树脂各洗涤一次。通过将温度升至25℃并同时执行两次另外的dcm洗涤(2ml)来完成该模块。模块d：封端用dmf(2x，25s)洗涤树脂，将反应容器的温度设定为25℃。将在dmf中的2ml的10％吡啶递送至反应容器中。1min后，将溶液排干，将树脂用dcm(3x，2ml，25s)洗涤。然后，将4ml的封端溶液递送至反应容器中，并在氩气起泡下温育20min。通过排干反应混合物，用dcm(3x，2ml，25s)洗涤树脂，结束循环。行为循环溶液量t(oc)温育时间加热---25洗涤2dmf2ml2525s递送1dmf中的10％py2ml251min洗涤3dcm2ml2525s递送1封端溶液4ml2520min洗涤3dcm2ml2525s模块e：fmoc脱保护用dmf(3x，2ml，25s)洗涤树脂，将反应容器温度调整至25℃。将2mlfmoc脱保护溶液递送入反应容器。5min后，通过uv-传感器排干溶液。用dmf(3x，2ml)和dcm(5x，2ml，60s，各自)洗涤树脂。在准备下一个循环中使反应容器的温度降至-20℃。行为循环溶液量t(oc)温育时间加热---25洗涤3dmf2ml2525s递送1fmoc脱保护溶液2ml255min洗涤1dmf2ml冷却----20-洗涤3dmf2ml25s洗涤5dcm2ml25s自动化后步骤从固相支持体上裂解自动化合成后，使用连续流动光反应器将寡糖从固相支持体上裂解下来。将样品(载有目标寡糖的树脂)溶于20mldcm(用戊烯稳定，lc-ms级)，以1.0ml/min的速率注入反应器中(波长＝300nm)。当所有树脂均在反应器内部时，注入新鲜的dcm(20ml)以回收经光解的树脂。真空浓缩如此获得的滤液，其使其经受进一步分析和纯化。纯化和hplc分析将粗产物溶于1：1的己烷：乙酸乙酯，并使用分析型hplc(ymc-diol-300柱，150x4.6mm，elsd检测器和daad，280nm)分析。方法–(终止时间–60.0min)时间(min)％乙酸乙酯％己烷流量(ml/min)0.0020801.0005.0020801.00040.0055451.00045.0010001.00050.0010001.000得到的寡糖清单来自溶液相合成中自动化步骤的完全保护的寡糖的脱保护的实验方法：苯甲酰基和乙酸酯脱保护：将甲醇钠的meoh溶液(25％w/w)(30-45eq.)加到苯甲酸酯83*-87*(1eq.)在meoh：thf(2：1)混合物中的溶液中。将该反应体系在相同温度下搅拌16h。通过加入h2o(1ml)猝灭反应，用盐水(5ml)稀释。用etoac(2×10ml)萃取该反应混合物。用无水na2so4干燥合并的有机层，减压浓缩。蒸发溶剂后得到粗产物83a*-87a*，为黄色粘稠的凝胶，其在没有任何进一步纯化的情况下被用于下一步。苄基脱保护：将83a*-87a*(1eq.)溶于溶剂混合物dcm(2ml)、tbuoh(2ml)和2滴水中。加入pd/c，在h2气囊中在室温氢化24h。将该反应混合物通过ptfe滤器过滤，将残余物用甲醇(6ml)、(50％甲醇-水(6ml)洗涤，真空蒸发滤液，得到粗产物。1hnmr分析显示反应完成和存在产物。因此，粗产物通过c18sepak柱，用水(3mlx2，fr1)、50％乙腈-水(3mlx2，fr2)和乙腈(3ml，fr2)纯化。将全部级分冷冻，冻干24小时，得到化合物83b*–87b*的一种纯的级分fr1和不纯的级分fr2。因此，采用上述方案得到了六聚糖83b*、十聚糖84b*、十二聚糖85b*和十五聚糖86b*。按照类似方案，从化合物87a*可以得到完全脱保护的二十聚糖87b*。b肺炎克雷伯菌血清型o3和o5寡糖的免疫接种研究材料：·elisa板(高结合，eia/ria板，9孔，平底，具有低蒸发盖，公司：3361)·检测抗体：山羊抗兔igg过氧化物酶缀合物(sigma，#a4914)和山羊抗小鼠igg(h+l)过氧化物酶缀合物(dianova代码：115-035-068)。·封闭溶液：1％fcs(v/v)的pbs溶液。·抗体稀释剂：pbs+1％bsa(w/v)。·洗涤缓冲液：pbs+0.1％吐温20(pbs-t)·展开溶液：1steptmultratmb-elisa展开剂.(thermoscientific，目录号：34028)·终止溶液-2m硫酸(h2so4)。·平板读出器：anthosht2。·软件：用于吸光度测定的winread2.36和用于数据绘图和分析的graphpadprism7。·明矾：氢氧化铝凝胶佐剂(2％)，brenntag，批号：5447expdt：2020年2月。·不完全弗氏佐剂(ifa)。invivogen；目录号：vac-ifa-10，批号：ifa-39-03；expdt：2019年9月。·quantiprotmbca测定试剂盒(sigma)产品：qpbca-1kt；批号：slbr7451v；pcode：1002296464·小型-tgxtmgels-10％，10孔(30μl/孔)对照号：64175708，·precisionplusdualcolor，目录号：1610374；对照号：641798899·gelcodetm蓝色安全蛋白染色剂；thermoscientific；参考号：1860957；批号：ta260266·肺炎克雷伯菌lps。sigma-l4268；批号：116m4057v方法：1.细菌菌株和lps有/没有囊的lps(o抗原)不同的肺炎克雷伯菌(kpc)菌株用于分离和纯化相应的lps。纯化的lps在酶联免疫吸附测定法(elisa)中用作包被抗原。o2a，clps购自sigma-aldrich。表1.用于lps分离的肺炎克雷伯菌菌株#lps/o抗原1o12o2a3o2a，c4半乳聚糖-iii2.糖缀合物的生产和表征kpc合成抗原为根据如下所述方法与用于免疫接种实验的载体蛋白crm197缀合(21*-crm197和69*-crm197)和与用于elisa的作为包被抗原的牛血清白蛋白缀合(bsa；(21*-crm197和69*-crm197))的21*和69*。通用缀合方案步骤1：pnp-酯合成在室温在8ml小瓶中将化合物21*或69*(1eq)溶于dmso或dmso-h2o。将活化的己二酸双-(4-硝基苯基)酯(20eq)加入其中，并搅拌5分钟。加入三乙胺(50当量)，并将该反应混合物在室温搅拌3-5h。用液氮冷冻反应混合物，然后冻干18h至干，得到浅黄色粗产物以及过量的试剂。粗产物用足量的chcl3接着用dcm充分洗涤以除去过量的试剂。干燥固体对硝基苯基(pnp)酯，并且将其进行下一步。步骤2：与蛋白质缀合缀合方法：将在50μl0.15mnacl的napi缓冲液溶液中的21*或69*的pnp酯滴加到包含缓冲液中crm197或bsa的反应小瓶中(150μl)。最终用50μl缓冲溶液冲洗小瓶，然后将其完全转移到反应小瓶中。因此，使得小瓶中的反应体积为～200μl。反应混合物变为黄色，并在室温搅拌反应混合物24h。将缀合溶液((21*-crm197、69*-crm197，21*-crm197或69*-crm197)转移到ultra-0.5ml离心滤器中，在2-8℃下离心6分钟。向反应小瓶中加入300μl缓冲液，冲洗并转移至滤器中且再次离心。使用1xpbs溶液再进行洗涤，并离心直至黄色消失，且缀合物变为澄清溶液。最终洗涤后，将缀合物在2-8℃储存在1xpbs溶液中。通过sds-page、sec色谱法和maldi分析，分析缀合物。通过使用maldi分析，减去缀合蛋白与未结合蛋白之间的质量，具体计算糖在载体上的载量。按照制造方案，使用微量bca方法估算了蛋白质含量。2.1sds-page分析。将样品在微量离心管中混合，并在热循环仪上于95℃加热5min。冷却至室温5min后，将约2.5μg样品与10μl标记物上样至10％聚丙烯酰胺凝胶的各自孔中。将样品在120v恒定电压下运行1h。根据制造说明使用gelcodetm蓝色安全蛋白染色剂进行染色。将凝胶用去离子水洗涤过夜，并使用凝胶记录系统扫描。2.2糖缀合物的尺寸排阻色谱法(sec)通过sec分析了用于免疫接种研究的糖缀合物(21*-crm197和69*-crm197)，以观察缀合与未缀合的crm蛋白之间的质量差异。将样品在50mmtris，20mmnacl，ph7，2中稀释，并在配备tosohtskg2000柱(swxl，7.8mmx30cm，5μm)和tosoh保护柱(swxl6.0mmx4cm，7μm)的agilent1100hplc系统上运行。将流速保持在1ml/min。3.用于免疫接种的疫苗制剂用氢氧化铝佐剂(明矾)配制糖缀合物配用于小鼠研究，并且用弗氏不完全佐剂(ifa)配制用于兔免疫接种。3.1明矾中的制剂所有制剂均在无菌条件下制备。将糖缀合物(ds)和pbs以适当的预先计算的比例在相当于最终制剂体积的50mlfalcontm管中混合，没有考虑所需的明矾体积(0.25mg/ml)。这形成了ds-pbs混合物。每只动物的抗原/ds剂量保持在5μg/100μl/动物。使用血清移液器将ds-pbs混合物适度混合(5x)。向ds-pbs混合物中，加入相应体积的明矾原液(10mg/ml)，得到最终明矾比为1：40或0.250mg/ml。通过使用5ml血清移液管轻轻移液(20x)将混合物即刻混合。封盖falcontm管，用包裹，并在室温(rt)在振动器上以250rpm混合2h。在2h的温育时间之后，将制剂置于清洁台下，等分，进一步在4℃下储存直至进一步使用。3.2ifa中的制剂来自invivogen的不完全弗氏佐剂(ifa)用于配制兔免疫接种研究的疫苗。方案遵循按照制造商的规程。抗原：ifa浓度保持在1：1。每只动物的抗原剂量保持在5μg/200μl/动物(100μl抗原+100μlifa)。将期望的计算体积(最终免疫接种体积的50％)的ifa放入15ml无菌falcontm管中。将计算量的稀释抗原溶液(体积用pbs将体积调节至最终免疫接种体积的50％)放入配备了20g针头的3ml无菌注射器中。将ds溶液加到包含ifa的falcontm管中，并立即涡旋振荡15秒(5x)。制剂的颜色在涡旋时从浅黄色变为乳白色，这表明形成稳定的乳液。将得到的疫苗制剂短暂涡旋并等分到具有期望剂量体积的2ml无菌试管中。免疫接种前，将包含疫苗制剂的试管涡旋，且然后注入动物体内。3.3明矾制剂的表征表征在明矾中配制的糖缀合物以确定最终明矾浓度和制剂的ph。4.免疫接种方案：在特定的无病原体条件下进行小鼠和兔免疫接种，并随意提供食物和水。用疫苗制剂(表2)皮下免疫接种小鼠(n＝6)和兔(n＝4)，注射体积为100微升/小鼠和200微升/兔。小鼠的抗原剂量除抗原7外保持在5微克/动物(抗原1和抗原2各为2.5微克)。兔的抗原剂量保持在5微克/动物。在第0、14和28天免疫接种小鼠和兔。相应地，对于小鼠在第-1、7和22天抽血，对于兔在第0、7和21天抽血，以确定抗体滴度。在第35天，处死动物，并采血。表2.小鼠(n＝6)和兔(n＝4)的免疫接种方案。*采用所述值从pbs(阴性对照)中减去小鼠血清分析的全部值。组糖缀合物每组的小鼠每组的兔121*-crm197(o3)60269*-crm197(o5)645.使用内部抗原包被板的血清酶联免疫吸附测定法(elisa)：用抗原包被平板：将缀合物21*-bsa和69*-bsa以及lps#1-#4用作包被抗原。将lps溶于异丙醇，浓度为10/20μg/ml。用100μl包被每个孔，得到包被浓度为1-2微克/孔。将lps溶液装入孔中，使其在室温在无菌工作台内过夜蒸发。对于缀合物21*-bsa和69*-bsa，将相应的缀合物以5μg/ml的浓度溶于ph7.4的磷酸缓冲盐水(pbs)中。每孔包被100μl，在4℃温育过夜，得到抗原浓度0.5微克/孔。洗涤：抗原吸附过夜后，用pbs-t(200微升/孔)洗涤板1次，然后将板翻转并在干净的干纸巾上轻拍以除去每孔的过量流体。封闭：用200μl商品封闭溶液封闭平板，并在rt温育2h。洗涤：封闭后，用pbs-t(200微升/孔)洗涤板3次，然后将板翻转并在洁净的干纸巾上轻拍以除去每孔的过量流体。血清稀释和温育：将来自不同实验组的不同时间点的合并血清(n＝4只兔或n＝6只小鼠/组)在抗体稀释剂(pbs+1％bsa)中稀释至其相应的稀释度。将100μl不同实验组的稀释血清样品一式两份添加到相应的孔中，在设定为250rpm的振荡器上于rt温育2h。100微升/孔的抗体稀释剂(pbs+1％bsa)形成实验空白。与血清一起温育后，用pbs-t(200μl/孔)洗涤板4次，然后将板翻转并在干净的干纸巾上轻拍以除去每孔的过量流体。温育(检测抗体)：将相应的检测抗体、抗兔或抗小鼠igghrp缀合物在抗体稀释剂(pbs+1％bsa)中按1：10,000稀释，添加100微升/孔，在rt在振荡器上以250rpm温育1h。与检测抗体一起温育后，用pbs-t(200微升/孔)洗涤板5次，将板翻转并在干净的干纸巾上轻拍以除去每孔的过量流体。底物添加：向每个孔中，加入100μl立即可用的tmb(3,3,’,5,5’-四甲基联苯胺)底物(从4℃标准化至室温)，并在黑暗中温育15min。通过加入50微升/孔的2mh2so4溶液终止酶促反应的蓝色，得到黄颜色的溶液。使用平板读出器在450nm处测量黄颜色溶液的吸收。结果：使用graphpadprism软件制图，分析吸收值。结果。糖缀合物21*-crm197和69*-crm197的表征分析了用于免疫接种研究的kpc抗原糖缀合物21*-crm197和69*-crm197的缀合效率和抗原含量。糖缀合物的maldi分析揭示出非常好的缀合效率。缀合与未缀合的crm197蛋白之间的质量差异导致不同糖缀合物的载量为2–15，优选3-10个抗原/crm197分子。还通过10％sds-page和sec分析了糖缀合物，其揭示与未缀合的crm197蛋白相比有明显的质量漂移(图5a和图5b)。elisa数据。来自21*-crm197/69*-crm197免疫接种的小鼠的血清识别相应的抗原(参见图6)。血清还与相应的肺炎克雷伯菌lps发生交叉反应(参见图7)。来自21*-crm197/69*-crm197免疫接种的兔的血清分别识别相关bsa缀合物21*-bsa和69*-bsa中的相应o抗原(参见图8)。来自21*-crm197/69*-crm197免疫接种的小鼠的血清选择性识别相应的肺炎克雷伯菌lps(参见图9)。本申请中提供的数据证明，在用本发明的缀合物免疫接种后，在兔和小鼠中引发了抗本发明的寡糖以及抗肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和o5的天然o-多糖的功能性抗体。该抗体与肺炎克雷伯菌血清型o3、o3b和o5的天然o-多糖(lps)确实交叉反应，这表明这些抗体与肺炎克雷伯菌结合并赋予抗肺炎克雷伯菌感染的防护作用的潜能。elisa数据进一步证明，本发明的缀合物具有免疫原性并诱导高抗体滴度。因此，elisa分析显示本发明的式(i)的寡糖在兔和小鼠中具有免疫原性并产生交叉反应性抗体。当前第1页12