检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒。

背景技术：

星状病毒(astrovirus)是一种属于星状病毒科的单股正链rna病毒，基因组长度在6.4～7.9kb不等。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物属和禽类属，其中哺乳动物属根据宿主的不同又分为人星状病毒、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒以及貂星状病毒等；禽类星状病毒属包括鸭星状病毒(dastv)、火鸡星状病毒(tastv)、禽肾炎病毒(anv)和鸡星状病毒(castv等)。

2017年下半年以来，我国部分地区陆续从鹅病料中分离到新型的鹅源星状病毒。遗传进化分析发现，该新发病毒与之前报道的所有禽类星状病毒的基因型差异较大，与其他禽类的星状病毒同源性仅在30％-50.5％之间，无论是全基因组还是单个的orf遗传进化分析都属于新的遗传分支，为新型的鹅源肾型星状病毒goastv。临床上该病可引起病鹅的关节肿大，生产性能下降，死淘率可达30％以上；剖解可见肾脏、心包等有明显的白色尿酸盐析出。关于该病毒的诊断，传统的病毒分离鉴定，费时费力，不适合临床使用，而且该病毒无血凝性，在鸡胚、鸭胚上不生长，在鹅胚上的繁殖能力也不高。目前最常见的检测方法是应用普通rt-pcr，但该方法易造成标本间的交叉污染，而且需要进行凝胶电泳进行判断，亦不适合临床大批样品进行检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒；利用所述引物组进行lamp反应能够快速准确的检测鹅源星状病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

检测鹅源星状病毒的引物组，所述引物组包括内引物，外引物和环引物，所述内引物包括fip和bip；所述fip的序列如seqidno:1所示；所述bip的序列如seqidno:2所示；所述外引物包括f3和b3；所述f3的序列如seqidno:3所示，所述b3的序列如seqidno:4所示；所述环引物包括lb和lf；所述lb的序列如seqidno:5所示；所述lf的序列如seqidno:6所示；所述引物组适用于lamp检测。

本发明还提供了检测鹅源星状病毒的试剂盒，包括lamp反应buffer，酶混合物和双蒸水，还包括所述的引物组。

优选的，所述内引物fip和bip的使用浓度独立为1.4μmol/l-1.8μmol/l。

优选的，所述外引物f3和b3的使用浓度独立为0.1μmol/l-0.5μmol/l。

优选的，所述环引物lb和lf的使用浓度独立为0.6μmol/l-1.0μmol/l。

优选的，所述酶为链置换型的bstdna聚合酶，所述酶的酶活力为6～10u/μl

优选的，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

优选的，所述阴性对照品为双蒸水，所述阳性对照品为鹅源星状病毒毒株的cdna。

本发明的有益效果：本发明提供的检测鹅源星状病毒的引物组，针对鹅源星状病毒orf2基因设计，适用于lamp检测，所述引物组的扩增效率好、扩增速度快，能够特异地扩增靶基因。利用所述引物组对鹅源星状病毒检测，灵敏度高(最低检测可达0.5ng/μl)，特异性好(其他对照病毒均未扩增)，不需要昂贵的仪器设备，检测结果可直接可视判定，方便推广应用。

附图说明

图1为实施例1中对不同样品的lamp结果可视化观察；

图2为实施例2中不同温度下lamp反应结果图；

图3为实施例3中lamp反应灵敏度检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了检测鹅源星状病毒的引物组，所述引物组包括内引物、外引物和环引物，所述内引物包括fip和bip；所述fip的序列如seqidno:1所示；所述bip的序列如seqidno:2所示；所述外引物包括f3和b3；所述f3的序列如seqidno:3所示，所述b3的序列如seqidno:4所示；所述环引物包括lb和lf；所述lb的序列如seqidno:5所示；所述lf的序列如seqidno:6所示。

在本发明中，所述引物组适用于lamp法检测鹅源星状病毒，所述引物组优选的根据genbank发布的新型鹅源星状病毒毒株序列(genbank登录号：mh052598)的orf2基因设计引物，orf2基因编码病毒的衣壳蛋白，为病毒的结构蛋白。在具体设计过程中，优选的将所述待扩增的序列分为六个独立的区域，分别设计相应的引物。

本发明还提供了检测鹅源星状病毒的试剂盒，包括lamp反应buffer，酶和双蒸水，还包括所述的引物组。在本发明中，所述内引物fip和bip的使用浓度独立优选为1.4～1.8μmol/l，更优选为1.5～1.7μmol/l，更优选为1.6μmol/l；所述外引物f3和b3的使用浓度独立优选为0.1～0.5μmol/l，更优选为0.4μmol/l；所述环引物lb和lf的使用浓度独立优选为0.6～1.0μmol/l，更优选为0.7～0.9μmol/l，最优选为0.8μmol/l。本发明中所述内引物fip和bip的使用浓度优选的一致，所述外引物f3和b3的使用浓度优选的一致，所述环引物lb和lf的使用浓度优选的一致。

在本发明中，所述lamp反应buffer优选为2×buffer；本发明中所述酶和lamp反应buffer优选的来源于lamp核糖核酸扩增试剂盒，日本荣研化学株式会社。本发明中所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。所述阴性对照品优选的为双蒸水，所述阳性对照品优选为鹅源星状病毒毒株的cdna。

本发明中所述试剂盒适用于lamp法检测鹅源星状病毒，所述lamp法检测鹅源星状病毒的体系优选为25μl；所述lamp反应体系优选的包括如下组分：

2×buffer12.5μl，

酶(bstdna聚合酶)1μl，

fip和bip，1.6μmol/l各0.2μl

f3和b3，0.4μmol/l各0.2μl

lb和lf，0.8μmol/l各0.2μl

补充ddh2o至25μl。

本发明中，所述lamp法检测鹅源星状病毒的程序优选的如下：60℃～67℃反应55～65min；更优选的为63～65℃反应58～62min，最优选的为64℃反应60min。

本发明中所述lamp反应结果检测方法优选的通过浊度测定仪进行，优选的在所述lamp反应过程中，每5～7s测定反应液的浊度并绘制曲线，来判断结果的阴阳性。本发明中所述浊度测定仪优选的为实时浊度仪型号为la-320c。本发明采用浊度仪测定lamp检测结果的原理如下：

lamp在反应过程中发生以下反应式：

(dna)n-1+dntp—→(dna)n+p2o7^4-；

p2o7^4-+2mg²⁺—→mg2p2o7↓

其中mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀。

本发明采用浊度仪检测lamp检测结果，无需开盖，避免污染，通过浊度变化曲线来判断反应产物的阴阳性，避免了检测结果的误判。

本发明中所述lamp反应检测过程中，优选的还包括在所述反应液中添加te核酸染料，采用te核酸染料进行结果的判定，通过颜色的变化直观进行检测，te是一种ph指示剂，根据反应液ph的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为无色，阳性时为亮绿色。

本发明所述方法非常适合在基层检测部门中广泛推广使用，对2017年以来新发的鹅源星状病毒进行快速、特异的测定，与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、成本低、快速简便等优点。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

检测鹅源星状病毒的试剂盒，包括引物组，2×buffer，酶混合物(em)，双蒸水，阳性对照品鹅源星状病毒毒株的cdna。其中2×buffer，链置换型的bstdna聚合酶来源于lamp核糖核酸扩增试剂盒，日本荣研化学株式会社。

所述试剂盒包括如表1所示引物。

表1引物组序列

实验材料：

lamp核糖核酸扩增试剂盒(dnaamplificationkit)来自日本荣研化学株式会社；可视染料(tecolorimetricindicator,te)来自天津捷易特生物科技有限公司；实时浊度仪la-320c来自日本荣研化学株式会社；分光光度计nd-1000来自nanodrop公司。

方法：

病毒rna的提取：

goastv毒株xz来自于徐州某种鹅场，临床表现为雏鹅集体采食量下降，拉绿色稀便，大部分有跛行或瘫痪症状。死淘量随发病每天增加，剖检肾脏、心包和关节有尿酸盐沉积。采集病变明显的肝脏、肾脏等组织。

病毒rna的提取按照宝生物viralrnakit操作进行，提取rna立即使用或超低温-86℃保存。

rt反转录过程：

反转录体系：5×rtbuffer4μl、amvenzymemix2μl、randomprimer(50μm)0.5μl、rna模板100pg～1μg(7μl)、rnasefreeh2o补至20μl。反应条件为：42℃30min、4℃结束。所得cdna在-20℃保存。

lamp反应：

lamp反应体系如下：2×buffer12.5μl，bstdna聚合酶(bstdnapolymerase)8u/μl1μl，fip和bip(1.6μmol/l)各0.2μl、f3和b3(0.4μmol/l)各0.2μl、lb和lf(0.8μmol/l)各0.2μl、模板cdna2μl补充ddh2o至25μl。将混合物置于60℃-67℃恒温反应60min。以双蒸水为阴性对照。

lamp反应结果检测：

实时浊度仪检测：lamp在反应过程中发生以下反应式：

(dna)n-1+dntp—→(dna)n+p2o7^4-

p2o7^4-+2mg²⁺—→mg2p2o7↓

其中mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，采用实时浊度仪la-320c，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。

基于te颜色改变检测：te是一种ph指示剂，根据反应液ph的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为无色，阳性时为亮绿色。

检测样品

1号为阳性对照品xz-goastv18；2到12号分别为阴性样本：2号为ddh2o；3-12分别为新城疫病毒(ndv)、h9亚型禽流感病毒(h9aiv)、水禽源副黏病毒4型(apmv-4)、传染性支气管炎病毒(ibv)、鸭源星状病毒(dkastv)、禽白血病病毒(alv)、鸡贫血病毒(cav)、坦布苏病毒(tembusu)、腺病毒4型(fadv-4)、鹅星状病毒毒株2010分离毒株(goastv10)。

可视化检测结果如图1所示，阳性对照品lamp检测为有色即阳性，其余样品为无色，即阴性。可见所述试剂盒能够应用于鹅源星状病毒检测。

实施例2

实施例1中所述试剂盒使用时最佳的lamp检测温度筛选

温度从60-67℃，梯度为1℃，进行筛选；xz-goastv18反应时间为60min。

结果如图2所示，从图2可以看出64℃、65℃、66℃时先发生了lamp反应，由于64℃最先发生了lamp反应，所以将最佳温度选为64℃。

实施例3

实施例1中试剂盒的灵敏性检测

将10倍梯度稀释的xz-goastv18阳性对照品cdna模板(原始模板浓度为550ng/μl)用于lamp反应，检测温度64℃，检测结果见图3。lamp能检测到样本的第3个稀释度，整个反应时间小于60min。图3中包括浊度检测结果和运用te染料判定结果；图3中从左到右，模板浓度依次为：1，10倍稀释；2，100倍稀释；3，1000倍稀释；4，10000倍稀释；5，100000倍稀释；6，1000000倍稀释；7，10000000倍稀释，8，双蒸水(阴性对照)。可见所述方法最低检测可达0.5ng/μl。

实施例4

临床应用

通过对40枚鹅胚(11日龄，来自山东章丘鹅养殖场)接种病毒后的尿囊液进行上述lamp方法检测。尿囊液病毒rna的提取按照宝生物viralrnakit操作进行，提取rna立即使用或超低温-86℃保存。

rt反转录cdna过程：5×rtbuffer4μl、amvenzymemix2μl、randomprimer(50μm)0.5μl、rna模板1μg、rnasefreeh2o补至20μl。反应条件为：42℃30min、4℃结束。

lamp反应体系如下：2×buffer12.5μl，bstdna聚合酶(bstdnapolymerase)浓度8u/μl1μl，fip和bip(1.6μmol/l)各0.2μl、f3和b3(0.4μmol/l)各0.2μl、lb和lf(0.8μmol/l)各0.2μl、模板cdna2μl补充ddh2o至25μl。将混合物置于64℃恒温反应60min。以双蒸水为阴性对照。用该方法可快速鉴定出36份阳性样品(36/40)。这一结果与fq-pcr(实时荧光pcr)试验的测定结果完全一致，fq-pcr也检出36份阳性样品(36/40)。fq-pcr的引物和探针如下：goastv-f：5'tggtggtggtgcggtttt3'(seqid：7)；goastv-r：5'gggcaacgtaccatcataacg3'(seqid：8)；probe：5'famtgtagagacggactggacmgb3'(seqid：9)；反应体系：2×premixex(forqpcr)10μl、forwardprimer(10μm)0.2μl、reverseprimer(10μm)0.2μl、probe(10μm)0.5μl、cdna2μl补ddh2o至20μl；反应过程：95℃2min，94℃5s、60℃30s进行40cycles，60℃收集荧光信号。阳性样品的fq-pcr反应体系通道出现特定的扩增曲线。可见本发明所述方法和实时荧光pcr方法检测结果完全一致，阳性检测率为90％(36/40)。

因此证明该方法特异好、敏感度高，而且不需要昂贵的荧光定量pcr仪、检测结果直接可视判定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>42

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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