一种甜瓜果皮果面沟的SNP标记、检测方法及应用与流程

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种甜瓜果皮果面沟的snp标记、检测方法及应用。

背景技术：

甜瓜(cucumismelol)是葫芦科重要的经济作物，具有较高的商业价值和经济价值。作为一种重要水果型蔬菜作物，在世界园艺产业中据有举足轻重的地位，自20世纪80年代，我国成为世界上甜瓜种植面积最大与产量最高的国家。根据数据统计，中国甜瓜栽培面积达到世界总栽培面积的45％，产量达到50％左右,中国甜瓜播种面积在2013年达到42.31万公顷，产量总和为1433.7万吨(《2013中国农业统计资料》)，对改变农业产业布局和增加农民收入具有重要意义。

果皮果面沟作为重要的外观品质之一，对改良甜瓜的商品性具有重要作用，因此长期以来一直是育种家的研究重点。通过传统育种方对甜瓜果皮果面沟性状的选择需要在果实生长期进行，存在鉴定周期长、效率低的缺点，而利用分子标记辅助选择育种(mas,molecularmarker-assistedselection)则可在苗期完成对果面沟性状的选育，不仅省时省力，而且还可以提高选育的准确性和效率，因此建立甜瓜果皮果面沟性状的分子标记辅助选择体系，对提高育种效率和加速育种进程具有重要意义。

甜瓜的果型、果实大小、果皮颜色是甜瓜果实品质的重要指标，同时也可根据这些指标对甜瓜进行分类和分级。对于甜瓜来说果面沟不仅是一种外观品质，而且果面沟影响甜瓜果皮结构、物质积累、果实受力及甜瓜果实裂果。保证成熟甜瓜果实完整无损、无裂果，有利于甜瓜运输与贮藏，也是甜瓜遗传育种研究重点。因此，开展甜瓜果面沟性状遗传规律及相关基因定位研究，对甜瓜种质资源改良和加快分子育种进程具有重要意义。

甜瓜果面沟形态发育的调控网络复杂且精细，由基因、microrna及激素等共同决定。有关甜瓜果面沟基因克隆、调控机理等基础研究较为薄弱。因此，寻找与甜瓜果面沟性状紧密连锁的dna标记，能够有效辅助甜瓜果面沟甜瓜的选育。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种甜瓜果皮果面沟的snp标记、检测方法及应用，主要目的是提供一个与甜瓜果皮果面沟紧密连锁的分子标记z1810268，用该分子标记在苗期可准确检测出甜瓜植株的果皮是否会有果面沟，为甜瓜果皮果面沟分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种甜瓜果皮果面沟性状相关的snp标记，所述snp标记的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；其中，seqidno.1所示的核苷酸序列与甜瓜果皮果面沟性状高度连锁，seqidno.2所示的核苷酸序列与甜瓜果皮无果面沟性状高度连锁。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测甜瓜果皮果面沟性状的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

又一方面，本发明实施例提供了一种用于检测甜瓜果皮果面沟性状的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物对。

又一方面，本发明实施例提供了上述snp标记、上述引物对及上述试剂盒在甜瓜育种中的应用。

再一方面，本发明实施例提供了一种检测甜瓜果皮果面沟性状的方法，通过检测待测甜瓜是否含有上述snp标记来确定所述甜瓜的果皮果面沟性状。

作为优选，所述检测方法包括以下步骤：

提取待测甜瓜的基因组dna；

利用上述引物对对甜瓜基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

对所述pcr扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与上述snp标记来确定所述待测甜瓜的果面沟性状；

或对所述pcr扩增产物用限制性内切酶taqi进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的果面沟性状。

作为优选，所述pcr的扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min，35cycles；72℃，5min。

作为优选，通过所述测序结果来确定果面沟性状的具体操作为：当所述pcr扩增产物的核苷酸序列和seqidn0.1序列一致，表示该植株的甜瓜果皮具有果面沟；

当所述pcr扩增产物的核苷酸序列和seqidn0.1序列不一致且与seqidn0.2序列一致，表示该植株的甜瓜果皮无果面沟。

作为优选，通过所述凝胶电泳显示结果来确定果面沟性状的具体操作为：当显示出所述pcr扩增产物不可被限制性内切酶taqi切开，表示该植株的甜瓜果皮具有果面沟；

当显示出所述pcr扩增产物可被限制性内切酶taqi切开，表示该植株的甜瓜果皮无果面沟。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过利用bsr-seq技术鉴定snps，根据鉴定的snps和公布的甜瓜基因组数据开发分子标记，并扫描f2分离群体，结合群体植株的果皮果面沟表型，开发与果面沟调控基因连锁更加紧密的分子标记；本发明开发的分子标记(z1810268)与果面沟调控基因位点连锁紧密，因而对甜瓜果皮果面沟性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜育种实践。

附图说明

图1为本发明实施例提供的有果面沟(0426)和无果面沟果皮(y101)的表型示意图；

图2为本发明实施例提供的分子标记z1810268在亲本(0426和y101)、f1及f2代植株中的多态性电泳图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

如图1所示，选择甜瓜种质材料0426果皮表面有宽清晰果面沟，材料y101果皮无果面沟，以0426和y101为亲本，杂交获得f1代植株，f1代植株自交构建f2分离群体；

用ctab法提取亲本、f1及f2分离群体的叶片总dna：取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的800μlctab提取缓冲液，65℃水浴30min；加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min离心15min；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴1h以上；12000r/min离心15min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀两次，干燥后，加入te缓冲液200μl溶解后，加入10μg/ml的rna酶去除rna，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λdna为标准，估计所得dna的浓度；后用te稀释终浓度为100ng/μl，存于-20℃备用；

在已种植f2分离群体中，选取30株果面沟果皮植株，取发育程度一致的甜瓜果皮组织，分别抽提总rna后等量混合形成果面沟池；同样的方法，选30株无果面沟果皮植株，取发育程度一致的甜瓜果皮组织，分别抽提总rna后等量混合形成无果面沟池；用illumina平台的hiseq2500双末端测序技术对两个混合池进行rna-seq测序，其中pairend(双末端)各125bp，测序深度约为60x，每个池的测序数据约为6g，共12g；然后，用已开发好的程序(perl语言编写的脚本，marker_snps_v1.pl)对两个池的rna-seq数据进行分析，流程如下：将两个混合池的rna-seq数据通过bowtie2软件比对甜瓜参考基因组上(http://www.icugi.org)，再利用tophat、samtools软件寻找两个池中等位基因的snps。

根据鉴定的snps位点及其在参考基因组上的侧翼序列设计引物，参见seqidn0.3和seqidn0.4，以抽提的双亲本、f1和f2分离群体dna为模板分别进行pcr扩增(pcr片段包含snps)，pcr扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min，35cycles；72℃，5min；用相应的限制性内切酶对pcr产物进行切割，使用2％琼脂糖凝胶电泳显示结果，亲本、f1和子代的多态性条带具体参见图2，扩增产物的序列为seqidn0.1和seqidn0.2；从果面沟植株中扩增的pcr片段无法被酶切，在琼脂糖凝胶上显示长度为596bp的条带，而从无果面沟植株中扩增的pcr产物可被酶切成两个小的片段432bp和164bp的条带，片段长度加起来与无法被酶切的长度相同；因此即得到可区分果皮有果面沟植株和无果面沟植株的多态性分子标记。

本发明研究得到的上述引物对seqidn0.3和seqidn0.4可以用来鉴定甜瓜果皮果面是否有沟；同样，利用本发明引物对可以制备试剂盒，该试剂盒中至少含有本发明的上述引物对，该试剂盒可用来鉴定果面沟形状。

本发明得到分子标记(名称为z1810268)的两条核苷酸序列seqidn0.1和seqidn0.2，长度均为596bp，在染色体上的具体位置为，chr11:19677312-19677907。

本发明得到的核苷酸序列如seqidn0.1与甜瓜果皮果面沟形状高度连锁；

本发明得到的核苷酸序列如seqidn0.2与甜瓜果皮无果面沟形状高度连锁。

本发明研究得到的上述分子标记(名称为z1810268)，核苷酸序列seqidn0.1和seqidn0.2，可以用来鉴定甜瓜果皮果面有沟还是无沟。

利用本发明的分子标记检测甜瓜果面沟形状的方法：提取待测甜瓜的基因组dna，利用上述设计的引物对，对甜瓜的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物，对pcr扩增产物进行测序得到其核苷酸序列，比较检测的核苷酸序列和seqidn0.1序列是否一致，如一致(条带不可被限制性内切酶taqi切开)，表示该植株的甜瓜果皮会有果面沟，如若不一致，而与seqidn0.2序列一致(条带可被限制性内切酶taqi切开)，则表示该植株的甜瓜果皮无果面沟。

本发明利用bsr-seq技术鉴定snps，根据鉴定的snps和公布的甜瓜基因组数据开发分子标记，并扫描f2分离群体，结合群体植株的果皮果面沟表型，开发与果面沟调控基因连锁更加紧密的分子标记，因而对甜瓜果皮果面沟性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜育种实践。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种甜瓜果皮果面沟的snp标记、检测方法及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>596

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtttgctcttgttgccgagctttactatttgctatggtggaagaaaagaagtataactt60

cttcacaagctgaagatgaattcaccaattatgctaaagagttttttcatctcatttgtt120

gggattggaaaaagggttcttcttcttcttcttcattacaacaacccaacaattctagag180

aaaatcaaaggaatctagaactgaggaatcaagagtctgatattgaaattggttgtagta240

aagatttgttgttgaaatcatctggtggagaagatggaggagttgagttagagttgatga300

gactgcataatcttgcaggtccaccaaggtttcttttcaccattaaagaggaaactaaag360

aagatttagaatctgaagatagaagcagaaaaggatcaagaacaagaagtctaagtgatc420

ttatattaacagttgatactccttttcttactcctttgccctctcctccattcaagccaa480

caacatctccattaaaccctttgaattctttcaaacaccatggattcaatataaatcctc540

tctttgaatcatcaaatgatttggatttgagtaggctcttatcttcacctccccca596

<210>2

<211>596

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgtttgctcttgttgccgagctttactatttgctatggtggaagaaaagaagtataactt60

cttcacaagctgaagatgaattcaccaattatgctaaagagttttttcatctcatttgtt120

gggattggaaaaagggttcttcttcttcttcttcattacaacaacccaacaattctagag180

aaaatcaaaggaatctagaactgaggaatcaagagtctgatattgaaattggttgtagta240

aagatttgttgttgaaatcatctggtggagaagatggaggagttgagttagagttgatga300

gactgcataatcttgcaggtccaccaaggtttcttttcaccattaaagaggaaactaaag360

aagatttagaatctgaagatagaagcagaaaaggatcaagaacaagaagtctaagtgatc420

ttatattaacagtcgatactccttttcttactcctttgccctctcctccattcaagccaa480

caacatctccattaaaccctttgaattctttcaaacaccatggattcaatataaatcctc540

tctttgaatcatcaaatgatttggatttgagtaggctcttatcttcacctccccca596

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtttgctcttgttgccgagc21

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgggggaggtgaagataagagcct24